伊佳虹，郭亞榮，王書(shū)敏，宋彬，仇海樂(lè)，賈軍梅

0 引言

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是發(fā)病率居全球第五的常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。一旦確診，轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差[2]。HOX（homeobox）基因?qū)偻串愋秃屑易?，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切[3]。研究發(fā)現(xiàn)該家族成員中的HOXB7可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、血管生成等促進(jìn)胃癌[4]、肺癌[5]、胰腺癌及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[6-8]，且HOXB7可通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。TGF-β（transforming growth factor-β）作為一種生長(zhǎng)因子，過(guò)度活化與多種疾病密切相關(guān)，如肝纖維化[10]、炎性反應(yīng)[11]和腫瘤[12]等。Liu等[8]認(rèn)為HOXB7與TGF-β可能通過(guò)活化TGF-β/SMAD3信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞侵襲進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展。Komatsu等[13]報(bào)道HOXB7在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌預(yù)后顯著相關(guān)，但HOXB7在HCC進(jìn)程中的作用及機(jī)制尚未闡明。因此，本文采用HOXB7 shRNA轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞，探討HOXB7基因在肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過(guò)程中的作用及部分機(jī)制，從而為尋找肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海一研生物科技有限公司；RIPA、PMSF購(gòu)自南京凱基；抗鼠二抗、抗兔二抗以及β-actin購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HOXB7、β-actin引物由山西賽奧科技有限公司合成；TGF-β購(gòu)自杭州聯(lián)科公司；SMAD3購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HOXB7 shRNA購(gòu)自復(fù)能基因有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Transwell小室、酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司；Anchored Oligo（dT）18試劑盒、ECL顯色液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HepG2、SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640:FBS:PS=89:10:1的培養(yǎng)基中。分別對(duì)小干擾RNA組（實(shí)驗(yàn)組）、陰性對(duì)照小干擾RNA組（陰性對(duì)照組）、空白對(duì)照組細(xì)胞使用1.2 μg DNA。按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明手冊(cè)對(duì)HOXB7的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 熒光定量PCR 按照說(shuō)明書(shū)對(duì)肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞使用TransZol Up裂解液提取總RNA。通過(guò)Anchored Oligo(dT)18試劑盒得到反轉(zhuǎn)錄cDNA。利用2× TransStart? Tip Green qPCR SuperMix體系配置反應(yīng)體系并放入熒光定量PCR儀，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用半定量分析計(jì)算HOXB7基因相關(guān)的mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table1 Primer sequences amplified by PCR

1.2.3 Western blot檢測(cè) 用裂解混合液提取肝癌細(xì)胞或shRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，使用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳，并用不同抗體分別行免疫印跡分析，ECL顯色液避光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相。使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，其相對(duì)表達(dá)水平用目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參蛋白條帶灰度的比率表示。

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn) 將等量細(xì)胞接種于96孔板上培養(yǎng)24 h，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入含有TGF-β抑制劑的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h。CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性。用酶標(biāo)儀在600 nm的參比波長(zhǎng)下測(cè)定450 nm處的吸光度值。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 按照Lipofectamine 2000的試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后，用200 μl尖端輕輕劃線，1×PBS沖洗兩遍，相差顯微鏡下分別取0、16、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍照，并計(jì)數(shù)劃痕處細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell上層小室中加入Matrigel膠母液60 μl，培養(yǎng)箱孵育30 min后加入50 μl無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，消化轉(zhuǎn)染HOXB7 shRNA（實(shí)驗(yàn)組）、陰性對(duì)照shRNA（陰性對(duì)照組）及空白組細(xì)胞（空白對(duì)照組），各取200 μl接種于Transwell上層小室，加500 μl含10%胎牛血清或含抑制劑的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，吸取上層小室內(nèi)基質(zhì)膠、液體，PBS擦去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min。結(jié)晶紫染色后，在200×視野下觀察透膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。t檢驗(yàn)用于兩獨(dú)立樣本均值比較，單因素方差分析用于多樣本間均數(shù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXB7 mRNA基因在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞株中HOXB7 mRNA的表達(dá)量分別為（3.198±0.9291）和（1.053±0.376），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），見(jiàn)圖1。

2.2 shRNA敲除HOXB7基因表達(dá)的效果

空白對(duì)照組HOXB7 mRNA表達(dá)水平（1.038±0.395）與陰性對(duì)照組（0.943±0.006）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.766），實(shí)驗(yàn)組HOXB7 mRNA水平（0.450±0.670）較陰性對(duì)照組明顯降低（P=0.009），見(jiàn)圖2A；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組肝癌SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)HOXB7 shRNA轉(zhuǎn)染后HOXB7蛋白表達(dá)量較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組均降低（P=0.01），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組HOXB7蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.878），見(jiàn)圖2B。

圖1 Real-time PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中HOXB7 mRNA的表達(dá)量Figure1 HOXB7 mRNA expression in HCC cell lines detected by Real-time PCR

圖2 shRNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞的沉默效果Figure2 Silencing effect of shRNA on HOXB7 expression at mRNA(A) and protein(B) levels in SMMC-7721 cells detected by RT-PCR and Western blot

2.3 HOXB7基因敲減后對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響

CCK8 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOXB7 shRNA實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞的吸光度值（0.644±0.007）顯著低于空白對(duì)照組（1.068±0.006）與陰性對(duì)照組（1.096±0.052），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.889），見(jiàn)圖3。

圖3 CCK8法檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力Figure3 Proliferation of SMMC-7721 cells after shRNA transfection detected by CCK8 method

2.4 HOXB7基因敲減對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組跨膜細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.782），見(jiàn)圖4。

2.5 HOXB7基因敲減后對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，24 h后實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞的遷移能力降低（P＜0.05），說(shuō)明HOXB7低表達(dá)能抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力，見(jiàn)圖5。

2.6 HOXB7基因敲除對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路的影響

HOXB7基因敲除后，實(shí)驗(yàn)組p-Smad3蛋白表達(dá)水平（0.624±0.232）較空白對(duì)照組（1.241±0.112）及陰性對(duì)照組（1.294±0.690）水平明顯降低（P＜0.001），空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組p-Smad3蛋白表達(dá)量差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.548），而實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

圖4 Transwell檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力 (×200)Figure4 Invasion ability of SMMC-7721 cells after shRNA transfection detected by Transwell assay (×200)

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shRNA 轉(zhuǎn)染后SSMC-7721細(xì)胞遷移能力Figure5 Migration of SSMC-7721 cells after shRNA transfection measured by wound healing assay

圖6 Western blot法檢測(cè)HOXB7基因敲除對(duì)TGF-β信號(hào)通路的影響Figure6 Effects of HOXB7 gene knockout on expressions of TGF-β signal pathway detected by Western blot

3 討論

近年來(lái)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[14]，其中約90%的病理類型為肝細(xì)胞肝癌[15]，原發(fā)性肝癌主要治療方式為手術(shù)切除及局部治療，但大多數(shù)患者因確診時(shí)已為中晚期而失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)[16]，目前晚期肝癌治療除了傳統(tǒng)的放化療以外，還可以采用分子靶向藥物治療以及免疫治療等方法[17]，然而大多數(shù)轉(zhuǎn)移性肝癌患者的生存現(xiàn)狀仍不理想。因此，闡明肝細(xì)胞肝癌發(fā)展的機(jī)制有助于改善肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后。

同源盒基因 B7（HOXB7）為HOX基因家族中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在DNA合成與轉(zhuǎn)錄方面有重要作用，其高表達(dá)可導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生。研究表明HOXB7在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[18-19]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中HOXB7基因表達(dá)顯著高于癌旁組織，這與Komatsu等[13]的研究一致，證實(shí)HOXB7作為癌基因參與了HCC的進(jìn)程。為明確HOXB7對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，本研究通過(guò)靶向HOXB7基因的shRNA轉(zhuǎn)染HOXB7表達(dá)量較高的肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，Real-time PCR及Western blot的結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中HOXB mRNA及蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組跨膜細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯減少，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組下降。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖與遷移能力隨著HOXB7表達(dá)下調(diào)而受到抑制，與課題組以往的研究結(jié)果一致，提示HOXB7可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力。

HOXB7在HCC進(jìn)程中的作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，據(jù)報(bào)道HOXB7可通過(guò)不同途徑發(fā)揮作用，包括上調(diào)c-Myc和Slug表達(dá)并激活A(yù)KT通路[9]、活化FGF介導(dǎo)的MAPK/ERK通路[20]等。此外，HOXB7還可以通過(guò)刺激FGF等生長(zhǎng)因子的分泌從而介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[21-22]發(fā)揮促癌作用，而TGF-β是參與EMT過(guò)程調(diào)節(jié)的主要因子之一[23]。TGF-β還可通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤的侵襲、浸潤(rùn)，如TGF-β可分別激活Smad和Non-Smad信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[24]。其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad3為T(mén)GF-β通路中重要的下游蛋白，該蛋白的異常表達(dá)可引起腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[23]。其下游信號(hào)也可能是通過(guò)調(diào)控其他通路調(diào)節(jié)EMT、細(xì)胞遷移等過(guò)程促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，如MEK/Erk、PI3K/Akt、MAPK等通路[25]。因此，為了進(jìn)一步明確HOXB7促進(jìn)HCC進(jìn)程的作用機(jī)制，本研究利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOXB7基因敲除后TGF-β通路中下游蛋白的活化水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組p-Smad3的表達(dá)較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組顯著下調(diào)。HOXB7敲除后Smad3的磷酸化水平下調(diào)，這提示HOXB7可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β通路中Smad3磷酸化促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移。然而HCC的侵襲、遷移是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，尤其是HOXB7在促進(jìn)肝癌進(jìn)展的具體分子機(jī)制尚未完全明確，后續(xù)還需開(kāi)展關(guān)于TGF-β通路的一系列分子機(jī)制研究，進(jìn)一步探討HOXB7在HCC進(jìn)程中的分子機(jī)制。