趙克，倪峰，劉康棟

0 引言

腦膠質(zhì)瘤（Glioblastoma）起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，目前腦膠質(zhì)瘤在我國(guó)每年新發(fā)病例5萬(wàn)人左右[1]。近年來(lái)，術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺的耐藥機(jī)制以及探討對(duì)同步放化療敏感的生物標(biāo)志物是當(dāng)前腦膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1.8～2.0Gy/次共計(jì)54～60 Gy仍然是目前治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)劑量方案。另外，替莫唑胺具有廣譜的抗腫瘤活性，通過(guò)口服吸收，以接近100%的生物利用度進(jìn)入全身血液循環(huán)，通過(guò)甲基化加成物的錯(cuò)配修復(fù)發(fā)揮細(xì)胞毒作用[2]。因此，替莫唑胺同步放療成為術(shù)后高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P-1（Glutathione S-Transferase P-1,GSTP-1）基因位于11q13.2，包含7個(gè)外顯子。在中國(guó)人群中，對(duì)該基因多態(tài)性的研究尚不多。研究發(fā)現(xiàn)，在接受同步放化療治療的高加索人群的膠質(zhì)瘤患者中，位于GSTP-1基因編碼區(qū)的Ile105Val位點(diǎn)和總生存期相關(guān)[3]，也有研究表明該位點(diǎn)與接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物引起的骨髓抑制顯著相關(guān)[4]。因此，本研究旨在探討GSTP-1基因遺傳變異對(duì)術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響，并探討該位點(diǎn)和GSTP-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)及治療方案

回顧性分析2010年1月—2018年6月河南省腫瘤醫(yī)院腦外科術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者175例，入組標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)確診為高級(jí)別膠質(zhì)瘤且接受手術(shù)切除治療；年齡≥18歲；ECOG評(píng)分0～2分；肝腎功能、血常規(guī)正常（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L）。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤或嚴(yán)重疾病的患者；沒(méi)有接受術(shù)后替莫唑胺聯(lián)合放療的患者。主要研究終點(diǎn)為無(wú)進(jìn)展生存期（PFS），次要終點(diǎn)為總生存期（OS）以及藥物基因組學(xué)分析。

放療的實(shí)施方案為：接受手術(shù)切除后6周以內(nèi)開(kāi)始放療計(jì)劃，結(jié)合患者情況給予總劑量54 Gy或60 Gy，30次分割，1.8或2.0 Gy/次，每天1次，每周前5天，共計(jì)6周。替莫唑胺用法用量為：同步放療期間，和化療同一天開(kāi)始，75 mg/m2每天，共計(jì)42天，治療過(guò)程中根據(jù)患者耐受情況可暫停用藥，但總服藥期不超過(guò)49天。同步放化療結(jié)束后4周，患者接受6周期的替莫唑胺單藥輔助化療，第1個(gè)周期150 mg/m2，隨后每周期200 mg/m2，第1～5天，28天一個(gè)周期。治療過(guò)程中根據(jù)患者的耐受情況調(diào)整替莫唑胺的治療周期。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，每個(gè)入組的患者或者家屬均簽署了知情同意書(shū)。根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)估。

1.2 標(biāo)本收集及基因分型

入組的患者在接受放化療前用EDTA抗凝管收集外周血樣本4 ml，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。GSTP-1基因Ile105Val（rs1695）位點(diǎn)的基因分型通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）方法進(jìn)行。擴(kuò)增包含該位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的上游引物為：5’-CCCCAGTGACTGTGTGTTGA-3’，下游引物為：5’-CAAGAAGCCCCTTTCTTTGT-3’。PCR產(chǎn)物大小為226 bp，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Tail對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行孵育消化，通過(guò)條帶的大小判斷基因型。

1.3 PBMC樣本收集及GSTP-1 mRNA表達(dá)分析

從入組的175例患者中另外收集接受放化療前的新鮮外周血樣本，用來(lái)提取外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），最終納入表達(dá)分析的PBMC標(biāo)本為78例，液氮保存。TRIzol試劑進(jìn)行RNA提取，上游引物為：5’-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3’，下游引物為：5’-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為498 bp。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μl，GSTP-1上游引物（20 μmol/L）0.2 μl，下游引物（20 μmol/L）0.2 μl，ddH2O 7.6 μl，cDNA 2 μl，反應(yīng)體系總計(jì)20 μl，之后用羅氏Real-time PCR儀器進(jìn)行GSTP-1 mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，用相對(duì)定量法 2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有變量均采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型的變量和Ile105Val位點(diǎn)不同基因型的分布采用χ2檢驗(yàn)。連續(xù)型的變量和該位點(diǎn)不同基因型的分析采用非參檢驗(yàn)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。用Stata14.0繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者PFS和OS的差異，曲線間的差異用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的比較。PFS為患者接受手術(shù)切除治療的時(shí)間到出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或者死亡的時(shí)間。OS為患者接受手術(shù)切除治療到死亡的時(shí)間。多變量分析時(shí)，對(duì)OS的多變量分析構(gòu)建Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線臨床資料及GSTP-1 Ile105Val位點(diǎn)基因分型情況

納入研究的175例腦膠質(zhì)瘤患者的基線臨床資料見(jiàn)表1。Ile105Val位點(diǎn)的基因分型結(jié)果為：G/G型119例（68.00%），G/A型51例（29.14%），A/A型5例（2.86%），最小等位基因頻率為0.17，該位點(diǎn)基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.868）。由于A/A型患者較少，后期分析中將G/A型和A/A型患者合并。Ile105Val位點(diǎn)不同基因型患者在基線臨床資料中分布均衡。

表1 GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的基線臨床資料Table1 Baseline characteristics of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

2.2 GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)對(duì)預(yù)后的影響

隨訪截至2018年10月，中位隨訪時(shí)間為29.5月（0.9～40月）。無(wú)進(jìn)展生存期的分析，見(jiàn)圖1，攜帶A等位基因的G/A+A/A基因型和G/G基因型患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期（mPFS）分別為4.4和6.9月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。

G/A+A/A型和G/G基因型患者的中位總生存期（mOS）分別為11.0和15.3月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖2。另外，為了校正其他混雜因素對(duì)OS的影響，本研究構(gòu)建了Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，將可能影響OS的風(fēng)險(xiǎn)因素，如年齡、性別、ECOG評(píng)分（1～2分為一組）、WHO分級(jí)、放療劑量以及Ile105Val位點(diǎn)納入該模型。經(jīng)過(guò)多變量校正后結(jié)果，見(jiàn)表2，Ile105Val位點(diǎn)對(duì)OS仍然具有獨(dú)立的影響意義（OR=1.85,P=0.008）。另外其他的基線資料在Cox模型當(dāng)中對(duì)OS具有獨(dú)立影響意義的有年齡（OR=1.45,P=0.015）、ECOG評(píng)分（OR=2.11,P=0.011）、WHO分級(jí)（OR=0.45,P＜0.001）。

圖1 GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的無(wú)進(jìn)展生存曲線Figure1 PFS curves of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

圖2 GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的總生存期曲線Figure2 Overall survival curves of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

表2 影響OS的基線臨床資料以及Ile105Val多態(tài)性位點(diǎn)的多變量Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型Table2 Multivariate Cox regression analysis of baseline characteristics and Ile105Val polymorphism

2.3 GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)對(duì)GSTP-1 mRNA表達(dá)的影響

在78例PBMC標(biāo)本中，G/G型53例，G/A型23例，A/A型2例，三種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.790）。A/A型患者相對(duì)較少，隨后的分析中將A/A型和G/A型合并，共計(jì)25例。G/A+A/A基因型相對(duì)于野生型的G/G型患者，PBMC中GSTP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)明顯較高（4.01±0.472vs.2.76±0.624），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 78例PBMC樣本中GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)不同基因型GSTP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure3 Relative GSTP-1 mRNA expression of 78 case of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) specimens according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)基因分型并和患者的預(yù)后進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)Ile105Val位點(diǎn)G/A+A/A基因型患者PFS和OS較差，另外在78例具有PBMC標(biāo)本患者的mRNA表達(dá)水平分析中發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)不同的基因型患者GSTP-1 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)較大的差異。結(jié)果表明Ile105Val位點(diǎn)可能通過(guò)影響GSTP-1 mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響術(shù)后接受替莫唑胺同步放療的腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

腦膠質(zhì)瘤是異質(zhì)性較強(qiáng)的惡性腫瘤，近年來(lái)給患者帶來(lái)生存獲益的治療進(jìn)展較為緩慢。目前，研究結(jié)果表明最大安全切緣的手術(shù)切除可以進(jìn)一步明確診斷，改善神經(jīng)功能癥狀并為術(shù)后輔助放化療提供有利條件[5]。另外，大量的證據(jù)表明術(shù)后同步放化療無(wú)論對(duì)于低級(jí)別還是高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者均具有明顯的生存獲益[6]。然而術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者接受同步放化療在臨床治療結(jié)果和預(yù)后上也有較大的個(gè)體差異，明確影響術(shù)后放化療的預(yù)后因素有助于提高臨床治療腦膠質(zhì)瘤的整體療效。藥物基因組學(xué)方面目前已經(jīng)有較多預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物的研究成果：2018年報(bào)道的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子遺傳變異位點(diǎn)rs1005230和膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后顯著相關(guān)[7]。2017年報(bào)道的MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)rs1625649對(duì)甲基化的腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后具有顯著影響[8]。隨后報(bào)道的MC4R基因多態(tài)性rs489693位點(diǎn)在接受同步放化療的腦膠質(zhì)瘤患者中的療效有預(yù)測(cè)價(jià)值[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中國(guó)腦膠質(zhì)瘤患者接受同步放化療后，GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)對(duì)患者預(yù)后具有明顯的影響。首先，本研究中Ile105Val位點(diǎn)的最小等位基因頻率為0.17，這和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人群中的突變頻率基本一致，但是從高加索人群的結(jié)果來(lái)看[10]，該位點(diǎn)的基因型分布頻率具有較大的種族差異。預(yù)后結(jié)果上，意大利Pasqualetti團(tuán)隊(duì)的研究[3]納入50例IDH1/2基因野生型的接受同步放化療的腦膠質(zhì)瘤患者，分析了XRCC1、XRCC3、RAD51和GSTP-1基因多態(tài)性和PFS以及OS的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了GSTP-1基因rs1695位點(diǎn)A/A型患者預(yù)后較差，這和本研究中G/A+A/A基因型患者較差的預(yù)后基本一致。另外，在亞洲人群中，日本學(xué)者Yoshihama團(tuán)隊(duì)[11]的研究納入了320例接受卡鉑聯(lián)合紫杉醇治療的婦科腫瘤患者，分析了GSTP-1基因rs1695位點(diǎn)對(duì)患者的預(yù)后及安全性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1695位點(diǎn)GG型患者與較高的血液學(xué)毒性相關(guān)，另外A等位基因攜帶者具有較差的預(yù)后，這和本研究的結(jié)果基本一致，但是該研究并沒(méi)有評(píng)估此位點(diǎn)和GSTP-1 mRNA表達(dá)的關(guān)系。另外有研究發(fā)現(xiàn)，rs1695位點(diǎn)和接受順鉑為基礎(chǔ)的化療出現(xiàn)的不良反應(yīng)有關(guān)，法國(guó)Lui團(tuán)隊(duì)[12]的研究納入了161例接受順鉑或卡鉑治療的兒童腫瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1695位點(diǎn)A/A基因型患者和較多的耳毒性顯著相關(guān)，這說(shuō)明了該位點(diǎn)會(huì)對(duì)化療藥物有一定的作用，本研究未評(píng)估該位點(diǎn)和不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)，需進(jìn)一步探索。

GSTP-1基因是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，通過(guò)催化許多疏水和親電化合物與還原型谷胱甘肽的結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮生物解讀或生物轉(zhuǎn)化的作用[13]。Ile105Val位點(diǎn)為非同義突變，位于該基因編碼區(qū)改變了氨基酸序列，可能會(huì)影響GSTP-1基因表達(dá)以及GSTP-1蛋白的功能。關(guān)于GSTP-1基因表達(dá)水平和患者預(yù)后目前尚沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論，目前有研究報(bào)道了GSTP-1在結(jié)直腸癌等腫瘤中為高表達(dá)狀態(tài)[14]。Theisen團(tuán)隊(duì)的研究納入32例晚期食管癌患者，通過(guò)分析GSTP-1基因表達(dá)狀態(tài)和治療反應(yīng)率的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，GSTP-1表達(dá)較低的患者具有較好的預(yù)后[15]。這和本研究mRNA表達(dá)分析的結(jié)果具有一致的趨勢(shì)。GSTP-1基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞外源性物質(zhì)解毒過(guò)程中具有重要作用，因此阻止了外源性物質(zhì)和胞內(nèi)蛋白核酸的相互作用。早前有研究表明谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的蛋白在很多藥物耐藥的細(xì)胞系中具有較多的表達(dá)[16]。因此，GSTP-1蛋白阻止了替莫唑胺和腫瘤細(xì)胞核酸的結(jié)合從而使其部分損失了細(xì)胞毒作用，因此較高的GSTP-1表達(dá)通常會(huì)伴隨著較差的替莫唑胺療效及預(yù)后。

本研究也有局限性，首先納入研究的樣本量不大。另外，研究為回顧性的分析有一些偏倚無(wú)法避免。但本研究相對(duì)充分地對(duì)GSTP-1基因Ile105Val位點(diǎn)的預(yù)后影響意義進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)也從mRNA表達(dá)層面揭示了該位點(diǎn)造成預(yù)后差異的部分原因，對(duì)術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評(píng)估具有一定的臨床指導(dǎo)意義。