蔡 坤，李文婷，梁志堅，史福林，劉 楊

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東 汕頭 515000）

櫛孔扇貝（Chlamys farreri）為海洋軟體動物瓣鰓綱貝類，又名海扇，其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美可口，具有很高的食用價值.有資料表明扇貝含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類脂肪、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分[1-5]，每100 g 扇貝瑤柱中含蛋白質(zhì)63.7 g、脂肪3 g、糖類15 g、鈣47 mg、磷886 mg 和鐵2.9 mg 等[6]，其中糖類含量豐富，僅次于蛋白質(zhì)含量.研究還發(fā)現(xiàn)，扇貝中的多種生物活性成分，具有很高的藥用和保健價值.其中多糖是扇貝生理活性物質(zhì)的主要組成部分，具有抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫能力、抗病毒等多種生理功能[7-13]，對扇貝多糖的研究將為扇貝的高值化利用提供依據(jù)，因此扇貝多糖口服液開發(fā)具有十分廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景.

本研究主要通過微波輔助熱水浸提法提取扇貝粗多糖，利用雙水相體系、透析技術(shù)純化，真空干燥后得粗多糖干粉.利用所得的多糖進行吞噬細胞吞噬和活化實驗，以探究其免疫活性.再將提取所得多糖與白砂糖、檸檬酸、蜂蜜共同調(diào)配成口服液.制備過程中以多糖得率和感官評定分數(shù)為指標，分別考查扇貝多糖的提取方法和口服液配方組成等因素，優(yōu)選扇貝多糖提取工藝及口服液制備配方，為扇貝的進一步開發(fā)和利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料

實驗用扇貝瑤柱由江蘇連云港洋溢海鮮館提供，取自櫛孔扇貝（Chlamys farreri）.在50°C下烘干，研磨成扇貝干粉后備用.

扇貝粗多糖（CFP）：按微波功率650 W、微波提取時間15 min、微波溫度50℃及液料比60∶1 的條件處理扇貝干粉，提取液經(jīng)雙水相體系、透析技術(shù)純化后冷凍干燥后備用.用于細胞試驗的試樣溶液均在臨用前用細胞培養(yǎng)液配制，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌，備用.

RAW 264.7 細胞株來自武漢普諾賽科技有限公司，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、脂多糖（LPS）購于北京索萊寶科技有限公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液、青-鏈霉素雙抗均購于Gibco 公司，二甲基亞砜（DMSO）購于麥克林公司，硫酸銨、無水乙醇為分析純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；透析袋（截留分子量：2000 g/mol）購于美國Spectrum laboratories 股份有限公司；檸檬酸、白砂糖、蜂蜜均為食用級.

1.1.2 實驗儀器

CW-2000 型超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DK-S12 型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；M200 Pro 光柵型多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；37XC 型倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；BCM-1300 生物潔凈工作臺（安泰空氣技術(shù)有限公司）；MLS-3750 高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機株式會社）；DK-S12 型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；BCD-196T 冰箱（青島海爾股份有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 扇貝粗多糖的制備

1.2.1.1 超聲微波輔助熱水浸提扇貝粗多糖的條件優(yōu)化

超聲-微波協(xié)同萃取儀主要由加熱裝置、超聲發(fā)生裝置、微波發(fā)生裝置、冷凝裝置、反應(yīng)器（球型玻璃燒瓶）組成.反應(yīng)器體積可達1000 mL.

將樣品粉末與蒸餾水按一定液料比配置于反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器置入萃取儀中，調(diào)節(jié)好萃取儀微波功率、微波時間、微波溫度的參數(shù)后，運行萃取儀.待萃取過程完成后取出萃取液，待進一步操作.

具體工藝參數(shù)設(shè)置如下：

（1）固定液料比為60∶1、微波時間為15 min 及微波溫度為50°C，考察不同微波功率（350、450、550、650 和750 W）對扇貝多糖得率的影響；

（2）固定液料比為60∶1、微波功率為650 W 及微波溫度為50°C，考察不同微波時間（5、10、15、20 和25 min）對扇貝多糖得率的影響；

（3）固定液料比為60∶1、微波功率為650 W 及微波時間為15 min，考察不同微波溫度（40、50、60、70 和 80°C）對扇貝多糖得率的影響；

（4）固定微波功率為650 W、微波時間為15 min 及微波溫度為50°C，考察不同液料比（40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 和 80∶1）對扇貝多糖得率的影響.

用葡萄糖制備標準溶液，通過苯酚-硫酸法[14]測定吸光值后繪制標準曲線，得到線性回歸方程，再利用線性回歸方程計算提取的扇貝溶液中的多糖得率.以扇貝多糖得率為指標，繪制關(guān)于微波功率、提取時間、提取溫度和液料比的單因素實驗圖，優(yōu)選出多糖提取條件.

1.2.1.2 獲取脫蛋白的扇貝多糖干粉

將經(jīng)不同微波輔助熱水浸提后的樣品液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的燒瓶中，蒸發(fā)濃縮至40 g，然后配置乙醇-硫酸銨雙水相體系（400 g 體系：硫酸銨177.0 g、乙醇：109.2 g、蒸餾水73.8 g、樣品液40 g），將配置好的溶液混勻后倒入分液漏斗靜置分層，取下層清液，經(jīng)透析后再進行冷凍干燥.

1.2.2 扇貝多糖的體外免疫活性研究

1.2.2.1 中性紅法測定RAW 264.7 巨噬細胞的吞噬能力

取生長良好、對數(shù)生長期的RAW 264.7 巨噬細胞，吸去培養(yǎng)液，加入2 mL 預(yù)熱的PBS 清洗殘留的培養(yǎng)液，重復(fù)兩次，然后用冷的PBS 進行處理，2 min 后進行吹打，制成濃度為1×105個/mL 的細胞懸液，接種在無菌的96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL，在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)熱的PBS 洗去未貼壁的細胞，分別加入100 μL 培養(yǎng)液（含10% FBS）和不同濃度CFP（125-2000 μg/mL），以 LPS（5 μg/mL）為陽性對照.

細胞培養(yǎng)24 h 后，在無菌環(huán)境下，吸棄細胞培養(yǎng)液，每孔加入無菌0.075%的中性紅生理鹽水溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，吸去中性紅溶液，每孔用PBS 小心洗滌兩次，吸去PBS 后每孔加入200 μL 的細胞裂解液體積比φ（冰醋酸：無水乙醇）=1∶1，提取出細胞內(nèi)的中性紅，室溫靜置過夜，用酶標儀在540 nm 處檢測吸光值.每次實驗重復(fù)三次.

1.2.2.2 Griess 法測定RAW 264.7 巨噬細胞的NO 分泌量

NO 在體內(nèi)或者在水溶液中極易氧化成NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺胺發(fā)生重氮反應(yīng)，后者進一步與萘基乙烯己二胺發(fā)生偶合反應(yīng)，該反應(yīng)的終產(chǎn)物濃度與NO2-濃度具有線性關(guān)系，在540～570 nm 處具有最大吸收峰.

細胞濃度和加藥方式同1.2.2.1（但將加藥體積改為200 μL）.細胞分別培養(yǎng)24 h 后，離心（170xg，10 min），收集培養(yǎng)液上清，按試劑盒說明書（Griess 法）制作標準曲線，測定NO 含量.

1.2.3 優(yōu)選扇貝多糖口服液配方

1.2.3.1 口服液制備單因素實驗

按1.2.1 實驗操作中篩選的提取條件提取出扇貝多糖，與白砂糖、檸檬酸和蜂蜜加水混合制備成口服液，并進行感官評定.以感官評定分數(shù)為指標，優(yōu)選出扇貝多糖口服液的配方.具體調(diào)配操作如下：

（1）取扇貝多糖粉，配制成質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.6%、1.1%、1.6%和2.1%扇貝多糖溶液各100 mL，分別向溶液中加入質(zhì)量分數(shù)達到2%白砂糖、0.12%檸檬酸、1.5%蜂蜜，配置成扇貝多糖口服液，對其進行感官評價（選用百分制），確定最佳扇貝多糖用量；

（2）在最佳扇貝多糖用量的基礎(chǔ)上，添加白砂糖，質(zhì)量分數(shù)分別達到1%、2%、3%、4%和5%，隨后添加質(zhì)量分數(shù)為0.12%檸檬酸、1.5%蜂蜜，配置成扇貝多糖口服液，對其進行感官評價，確定最佳白砂糖用量；

（3）在最佳扇貝多糖和白砂糖的基礎(chǔ)上，檸檬酸質(zhì)量分數(shù)達到0.02%、0.07%、0.12%、0.17%和0.22%，然后各加入蜂蜜，質(zhì)量分數(shù)達到1.5%，配置成扇貝多糖口服液，對其進行感官評價，確定最佳檸檬酸用量；

（4）在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，扇貝多糖，白砂糖，檸檬酸都分別選用其最佳用量.添加蜂蜜，質(zhì)量分數(shù)達到0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，配置成扇貝多糖口服液，對其進行感官評價，確定最佳蜂蜜用量.

1.2.3.2 評分標準

為使制得的口服液具有較好的感官品質(zhì)，將制備好的扇貝多糖口服液分別請10 名具有一定經(jīng)驗及鑒別能力的不同品嘗者進行感官評定.總得分選用百分制，每個指標最高25 分，評分標準見表1（總分計算方法：去除一個最高分和一個最低分后，計算剩余得分的平均值，結(jié)果保留整數(shù)）.

表1 口服液評分標準

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)選微波輔助熱水浸提法條件

利用超聲-微波協(xié)同萃取儀進行微波輔助熱水浸提時有4 個重要的工藝參數(shù)：微波功率、微波提取時間、微波溫度及液料比.因此本實驗以多糖得率為依據(jù)，對這4 個參數(shù)分別進行單因素實驗，以期尋找到最佳的提取條件.實驗結(jié)果如圖1.

圖1（A）圖是固定液料比為60∶1、微波時間為15 min 及微波溫度為50°C，考察不同微波功率（350、450、550、650 和750 W）對扇貝多糖得率的影響.從圖中可以明顯觀察到，當(dāng)功率在350～650 W 之間時，多糖得率隨功率增加而增大，但功率超過650 W 后多糖得率開始明顯下降.因此，得出扇貝多糖微波輔助熱水浸提的最佳微波功率應(yīng)為650 W.

圖1（B）圖是固定液料比為60∶1、微波功率為650 W 及微波時間為15 min，考察不同微波時間（5、10、15、20 和25 min）對扇貝多糖得率的影響.從圖中可以看出在5～15 min 間，多糖得率隨提取時間增長而增加，但15～20 min 多糖得率卻開始緩慢下降，超過20 min 多糖得率下降明顯.因此，扇貝多糖微波輔助熱水浸提的最佳微波提取時間應(yīng)為15 min.

圖1（C）圖是固定液料比為60∶1、微波功率為650 W 及微波時間為15 min，考察不同微波溫度（40、50、60、70 和80 ℃）對扇貝多糖得率的影響.從圖中可以看出40～50 ℃時，多糖得率隨溫度上升而增加；但50～60 ℃之間，多糖得率隨溫度上升而逐漸降低；當(dāng)溫度在60～70 ℃之間時，多糖得率又有小幅度增高；而隨著溫度繼續(xù)上升，多糖得率開始大幅度下降.因此，扇貝多糖微波輔助熱水浸提的最佳微波溫度應(yīng)為50 ℃.

圖1（D）圖是固定微波功率為650 W、微波時間為15 min 及微波溫度為50℃，考察不同液料比（40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 和80∶1）對扇貝多糖得率的影響.從圖中看，當(dāng)液料比為60∶1 時，多糖得率明顯高于其他條件下的多糖得率.因此，扇貝多糖微波輔助熱水浸提的最佳液料比應(yīng)為60∶1.

綜上所述，要想利用微波輔助熱水浸提法獲得較高的多糖得率，應(yīng)對工藝參數(shù)進行如下選擇：微波功率650 W、微波提取時間15 min、微波溫度50℃及液料比60∶1.

圖1 微波功率、微波提取時間、微波溫度和液料比對扇貝多糖得率的影響

2.2 扇貝多糖的體外免疫活性研究

2.2.1 中性紅法測定RAW 264.7 巨噬細胞的吞噬能力

作為機體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成細胞，巨噬細胞承擔(dān)著吞噬、消除細胞內(nèi)寄生菌、真菌，和清除衰老的自身細胞的職能，所以巨噬細胞的吞噬功能，在一定程度上可以反映機體的免疫狀態(tài).本實驗中采用巨噬細胞吞噬中性紅的方法對RAW 264.7 巨噬細胞的吞噬能力進行測定，結(jié)果如圖2所示.

由圖可知，當(dāng)作用時間為24 h 時，LPS 組和粗多糖組的吸光值較空白對照組均有著不同程度的升高，表明經(jīng)過LPS 和粗多糖處理后，巨噬細胞RAW 264.7 吞噬中性紅的能力得到了提高.

圖2 扇貝粗多糖（CFP）對RAW264.7 細胞吞噬中性紅的影響（24 h）與對照組比較：*p＜0.05，**p＜0.01.

2.2.2 Griess 法測定RAW 264.7 巨噬細胞的NO 分泌量

探討前，首先介紹一下曲字的調(diào)值和音樂性字腔的一些基本情況。漢語口語中的字聲有四聲陰陽之別，但在音樂性的昆曲字腔中，除了平聲字的字腔外，其他三聲字腔的陰、陽，幾乎沒有差別。其中，上聲字字腔音勢就只有呈狀的高—低—高一種；去聲字字腔音勢就只有呈狀的低—高—低一種；入聲字字腔音勢就只有呈▼頓音狀的一個單短音。概言之，這就是昆曲音樂的一大基本特征：仄聲字腔不分陰陽。這一點，與昆曲的曲詞創(chuàng)作只講平仄、不分四聲陰陽基本對應(yīng)。

NO 作為信使分子和細胞毒性分子，廣泛的參與集體免疫應(yīng)答相關(guān)的各種生理過程，是活化的巨噬細胞殺傷腫瘤細胞和病原微生物的主要效應(yīng)分子，所以NO 的分泌量可以作為檢測巨噬細胞活化狀態(tài)的一個指標[15].

本實驗選用 5 個質(zhì)量濃度梯度（125 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL）的三種多糖對巨噬細胞RAW 264.7 刺激24 h，收集細胞培養(yǎng)上清，以PBS 組為空白對照，LPS（5 μg/mL）為陽性對照.以NaNO2為標準品制作標準曲線，得到圖3，并從圖中計算得NO 標準曲線線性回歸方程為y=0.0058x，R2=0.9993，再根據(jù)線性回歸方程計算得各實驗組的NO 濃度，結(jié)果如圖4（24 h）.

如圖4所示，在粗多糖處理組中，多糖質(zhì)量濃度在250～2000 μg/mL 范圍內(nèi)顯著的促進了巨噬細胞RAW 264.7 分泌NO，而且呈現(xiàn)了濃度依賴性.

圖3 NO 標準曲線

圖4 扇貝粗多糖（CFP）對 RAW 264.7 細胞分泌 NO 的影響（24 h）與對照組比較：*p＜0.05，**p＜0.01.

2.3 優(yōu)選扇貝多糖口服液配方

2.3.1 多糖用量對口服液品質(zhì)的影響

如表2所示，制備口服液時，隨著扇貝多糖添加量的增多，口服液的色澤由無色變?yōu)闇\黃色，狀態(tài)也由透明澄清變成半透明，但對于口服液的香味和口感不會產(chǎn)生明顯影響.從色澤和狀態(tài)角度，多糖含量為1.6%和2.1%呈淺黃色半透明的口服液給人的感官感受優(yōu)于多糖含量為0.1%～1.1%無色透明的口服液，又因為多糖含量為1.6%和2.1%的口服液在香味和口感上無明顯差異，基于成本考慮，扇貝多糖含量1.6%為最適用量.

表2 扇貝多糖對口服液品質(zhì)的影響

2.3.2 白砂糖和檸檬酸用量對口服液品質(zhì)的影響

如表3和表4所示，綜合考慮選擇白砂糖質(zhì)量分數(shù)3%，檸檬酸質(zhì)量分數(shù)為0.07%.

表3 白砂糖對口服液品質(zhì)的影響

表4 檸檬酸對多糖口服液品質(zhì)的影響

2.3.3 蜂蜜用量對口服液品質(zhì)的影響

蜂蜜的添加使扇貝多糖口服液滋味更豐富，營養(yǎng)價值也有所提高.但蜂蜜的用量對口服液的組織狀態(tài)，口感，香味等指標影響較大，因此，篩選蜂蜜用量應(yīng)更加謹慎.

如表5所示，當(dāng)蜂蜜含量為1%時，多糖口服液酸甜適中，清新爽口；當(dāng)蜂蜜含量超過2%時，口服液組織狀態(tài)受蜂蜜影響開始變濃稠，口感偏甜，因此，選用蜂蜜質(zhì)量分數(shù)為1%為佳.

表5 蜂蜜對多糖口服液品質(zhì)的影響

2.3.4 小結(jié)

根據(jù)上述成分的最佳用量（即以質(zhì)量分數(shù)記，扇貝多糖為1.6%、白砂糖為3%、蜂蜜為1%、檸檬酸為0.07%）配置扇貝多糖口服液，蜂蜜香味濃郁，酸甜適中，呈淺黃色半透明狀，經(jīng)感官評分為85，因此適合作為制備口服液的配方.

3 結(jié)論

本實驗采用微波輔助熱水浸提的方法提取扇貝多糖，研究了不同提取條件對扇貝多糖得率的影響，并在此基礎(chǔ)上選擇合適的提取條件.通過對微波功率、提取時間、提取溫度及液料比進行的單因素實驗的結(jié)果分析，最終選擇在微波功率650 W、微波提取時間15 min、微波溫度50℃及液料比60∶1 的條件下對本實驗所用的扇貝瑤柱材料進行提取.

根據(jù)細胞實驗的結(jié)果可知，扇貝多糖濃度在125-2000 μg/mL 范圍內(nèi)可以促進巨噬細胞RAW 264.7 吞噬中性紅的能力，濃度在250-2000 μg/mL 范圍內(nèi)能促進巨噬細胞RAW 264.7 分泌NO 且呈濃度依賴性.

在調(diào)配扇貝多糖口服液的過程中，通過對扇貝多糖、白砂糖、蜂蜜和檸檬酸4 種成分的單因素實驗的研究，得出適宜的口服液配方（以質(zhì)量分數(shù)記）：扇貝多糖為1.6%、白砂糖為3%、蜂蜜為1%、檸檬酸為0.07%.

本試驗制備的扇貝多糖口服液清香爽口、食用方便，但還需通過動物實驗及臨床實驗來驗證其藥用價值，這也是下一步需要研究的方向.