王 影 姚 琳 吳禹岐 李世寬 范金鳳 陳 瑛

(哈爾濱師范大學(xué)黑龍江省水生生物多樣性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150025)

浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)是一種營自由生的淡水纖毛蟲, 廣泛分布于池塘、河流和沼澤中。隸屬于原生動(dòng)物界纖毛門多膜綱下毛目尖毛科[1], 是棘尾蟲屬的模式種。作為單細(xì)胞模式生物, 棘尾蟲在研究核組織和發(fā)育、染色體和染色質(zhì)、端粒生物學(xué)以及基因組重排等領(lǐng)域有著重要的地位[2—4]。早在1876年, 第一份記錄染色體和有絲分裂紡錘體的報(bào)道就來自于對棘尾蟲小核結(jié)構(gòu)的觀察[5]。另外一份研究發(fā)現(xiàn), 在浮萍棘尾蟲大核多倍體化后, 基因組中有大量DNA(約90%)存在丟失現(xiàn)象, 這一發(fā)現(xiàn)引起了學(xué)者們對于纖毛蟲中基因組減少和重排現(xiàn)象的廣泛研究。隨后, 浮萍棘尾蟲即作為模式單細(xì)胞生物, 廣泛用于端粒結(jié)構(gòu)調(diào)控[6]和染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研究中[7—9]。在2013年,浮萍棘尾蟲大核基因組完成測序, 為研究染色質(zhì)介導(dǎo)、RNA引導(dǎo)的發(fā)育基因組重排等現(xiàn)象提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)[10]?；诨蚪M測序結(jié)果, 本實(shí)驗(yàn)室研究了浮萍棘尾蟲在表皮生長因子誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng), 從轉(zhuǎn)錄水平初步揭示了其分裂和增殖調(diào)控的分子機(jī)制[11]。棘尾蟲主要營動(dòng)物性營養(yǎng)[12],傳統(tǒng)的棘尾蟲培養(yǎng)方式是喂飼藻類(Algae)、細(xì)菌(Bacteria)及唇鞭蟲(Chilomonas)等。在利用該物種作為研究對象開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)前, 通常需進(jìn)行饑餓處理, 以減少細(xì)菌和微藻對研究結(jié)果的干擾, 但是依然難以完全消化蟲體內(nèi)的食物[13], 非常不利于開展棘尾蟲的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。因此, 建立浮萍棘尾蟲純培養(yǎng)體系, 成為開展棘尾蟲生物學(xué)研究的重要前提。

原生動(dòng)物的培養(yǎng)方式主要分為自由生和寄生型兩類: 自由生活的模式原生動(dòng)物以草履蟲(Paramecium)和四膜蟲(Tetrahymena)為代表, 其專用的無菌培養(yǎng)基已經(jīng)建立[14—16], 其他種屬的培養(yǎng)方式均為混合培養(yǎng)[17—19]。因此, 本研究以原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲純培養(yǎng)基為主要參考[20], 采用響應(yīng)面分析方法,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選調(diào)整各個(gè)主要組成分配比, 以獲得適合浮萍棘尾蟲細(xì)胞的無菌純培養(yǎng)基, 并進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所用的浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)由中國科學(xué)院水生生物研究所饋贈(zèng)。其基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址: http://stylo.ciliate.org/index.php/home/welcom。

1.2 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)方法

嗜熱四膜蟲培養(yǎng)基的成分主要包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、葡萄糖和檸檬酸等成分達(dá)39種, 用于探究不同成分對蟲體生長繁殖的影響, 具體成分參考唐任寰等[21]; 培養(yǎng)唇鞭蟲的Pringsheim’s液成分為Na3PO4、KCl、Ca(NO3)2、MgSO4和FeSO4; 綠梭藻(Chlorohonium)培養(yǎng)基成分為NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、NaH2PO4、NH4NO3、MgSO4、FeCl3和MnCl2等無機(jī)成分, 具體成分參考Ammermann等[22], Pringsheim’s液、綠梭藻培養(yǎng)基只用來比較和檢驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的優(yōu)化效果。

優(yōu)化培養(yǎng)基的方法主要分為兩步: 第一步, 利用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 探索主要營養(yǎng)元素的濃度, 為優(yōu)化培養(yǎng)基成分提供合理的數(shù)據(jù)范圍。第二步, 為克服單因素實(shí)驗(yàn)的局限性, 通過正交實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析后, 確定主要影響因素。將最佳培養(yǎng)基成分和最適培養(yǎng)條件相組合, 篩選出適合于浮萍棘尾蟲的培養(yǎng)體系。

1.3 浮萍棘尾蟲培養(yǎng)方法

取100只蟲體放入10 mL的培養(yǎng)液中, 在設(shè)定的pH和溫度條件下靜置培養(yǎng), 每24h測定一次細(xì)胞密度, 每次計(jì)數(shù)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.4 氮源濃度對浮萍棘尾蟲生長的影響

在嗜熱四膜蟲培養(yǎng)基其他組分不變的條件下:分別添加甲硫氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸(以5%的單位為一個(gè)濃度梯度, 共稀釋7個(gè)濃度), 研究10因素不同濃度組合條件下氮源濃度對細(xì)胞密度的影響。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)方法同1.3。

1.5 碳源濃度對浮萍棘尾蟲生長的影響

在嗜熱四膜蟲培養(yǎng)基其他組分不變的條件下:分別添加葡萄糖和檸檬酸(以10 mg/L為一個(gè)濃度梯度, 共稀釋6個(gè)濃度), 研究在不同濃度條件下碳源濃度對細(xì)胞密度的影響。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)方法同1.3。

1.6 磷酸氫二鉀濃度對浮萍棘尾蟲生長的影響

在嗜熱四膜蟲培養(yǎng)基其他組分不變的條件下:分別添加磷酸氫二鉀(以0.1%的單位為一個(gè)濃度梯度, 共稀釋5個(gè)濃度), 研究磷酸氫二鉀濃度對細(xì)胞密度的影響。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)方法同1.3。

1.7 優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)是由Box等[23]提出的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法, 是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法, 通過對具有代表性的局部各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn), 回歸擬合在全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系, 并且取得各因素的最優(yōu)水平值[24]。氮源采用central composite design設(shè)計(jì)了10因素的組合實(shí)驗(yàn), 研究不同組合條件對于棘尾蟲細(xì)胞數(shù)目的影響, 篩選出最適的氮源元素含量的配比。

正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上, 以氮源、碳源的母液(葡萄糖和檸檬酸按照1:1配制)和磷酸氫二鉀作為考察因素, 按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 比較各組合培養(yǎng)條件對細(xì)胞密度的影響, 篩選出最適于棘尾蟲生長的培養(yǎng)基組分。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)方法同1.3。

1.8 最佳培養(yǎng)條件的篩選

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基下培養(yǎng), 研究培養(yǎng)溫度(10、15、20、25和30℃)、培養(yǎng)基初始pH (6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)和初始接種密度(5、50、100、200和300 cells/mL)對最終獲得細(xì)胞密度的影響。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)方法同1.3。

1.9 細(xì)胞密度與代時(shí)計(jì)算方法

生長曲線與代時(shí)和細(xì)胞密度的換算公式如下:

其中, A為初始體系中微生物數(shù)量常用對數(shù)值;B為最大生長速率; C為微生物穩(wěn)定期數(shù)量常用對數(shù)值與初始數(shù)量常用對數(shù)值之差; M為最大生長速率時(shí)所對應(yīng)的時(shí)刻;Y(Nt)為微生物在時(shí)間t時(shí)的常用對數(shù)值lg。根據(jù)上述公式用Origin8.0即可直接得出參數(shù)A、C、B和M, 進(jìn)而算出: MCC=eA+C;GT=(2.7182/B)/(log2MCC/N0); 其中, e為自然對數(shù),N0為接種初始密度, MCC為細(xì)胞最大密度, GT為對數(shù)期的代時(shí)[25]。通過生長曲線可算出最大細(xì)胞密度(Maximum cell concentration, MCC)和代時(shí)(Generation times, GT)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS(20.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 氮源濃度對細(xì)胞密度的影響

單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 嗜熱四膜蟲培養(yǎng)基中18種氨基酸里有10種氨基酸的濃度變化對細(xì)胞密度具有顯著影響。利用central composite design設(shè)計(jì)了10因素的組合實(shí)驗(yàn), 共300組不同濃度氨基酸的組合實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過方差分析和各因素的貢獻(xiàn)度分析得出: 呈現(xiàn)正效應(yīng)的異亮氨酸貢獻(xiàn)度最大為48.182%、丙氨酸的貢獻(xiàn)度是22.4506%, 呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)的組氨酸的貢獻(xiàn)度是14.6905%, 說明在一定的范圍內(nèi), 增加異亮氨酸、丙氨酸的濃度含量并減少組氨酸的濃度含量有助于棘尾蟲細(xì)胞密度的增加。氮源中心組合的細(xì)胞密度的回歸方程為:

N4為異亮氨酸, N5為組氨酸, N6為丙氨酸?；貧w方程用決定系數(shù)R2檢測, 其值為0.9037, 說明實(shí)際值與預(yù)測值擬合良好。變異系數(shù)(CV)=5.18%, 值稍大, 但在合理范圍內(nèi), 說明模型可信度高。通過響應(yīng)面的貢獻(xiàn)度分析發(fā)現(xiàn)N4-6的貢獻(xiàn)程度最大, 需要進(jìn)一步調(diào)整比例, 在實(shí)際統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)組氨酸的添加量為零時(shí), 細(xì)胞生長密度最高, 所以最終表 1中只包含9種氨基酸, 配成氮源母液。氮源的配比見表 1。

氨基酸Amino acid 濃度Concentration (mol/L)L-Ala 2.5280×10-4 L-Glu 1.8835×10-4 L- Gln 5.4795×10-5 Gly 3.6667×10-4 L-Lle 2.6718×10-4 L-Val 1.4957×10-4 L- Met 1.5101×10-4 DL-Ser 2.1429×10-4 L-Thr 2.3109×10-4

2.2 碳源濃度對細(xì)胞密度的影響

培養(yǎng)基中的碳源是由葡萄糖和檸檬酸提供, 因此對碳源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn), 結(jié)果如圖 1所示, 當(dāng)葡萄糖濃度為30 mg/L、檸檬酸濃度為40 mg/L, 作為碳源的最佳濃度時(shí), 細(xì)胞密度均存在最大值約為400 cells/mL。

圖1 葡萄糖和檸檬酸的濃度對細(xì)胞密度的影響Fig. 1 The effect of glucose and citric acid on cell density

2.3 磷酸氫二鉀濃度對細(xì)胞密度的影響

如圖 2所示, 細(xì)胞密度隨著K2HPO4·3H2O濃度的增加而增加。當(dāng)K2HPO4·3H2O的濃度達(dá)到0.5%時(shí), 細(xì)胞密度達(dá)到最大300 cells/mL左右, 而K2HPO4·3H2O濃度繼續(xù)提高細(xì)胞密度則隨之遞減。在一般情況下, K2HPO4·3H2O除了為細(xì)胞的生長提供磷源外, 還具有穩(wěn)定培養(yǎng)液pH的作用, 偏高或偏低的pH都不利于細(xì)胞生長。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了K2HPO4·3H2O的最適添加量為0.5%。

圖2 磷酸氫二鉀的濃度對于細(xì)胞密度的影響Fig. 2 The Effect of K2HPO4 on cell density

2.4 氮源、碳源和磷酸氫二鉀三因素的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

為克服單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的局限性, 探究幾大營養(yǎng)元素之間相互作用的關(guān)系, 分別以氮源母液、碳源母液及磷酸氫二鉀作為三大類營養(yǎng)元素, 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法, 設(shè)計(jì)了3因素3水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表 2, 結(jié)果分析見表 3。

三因素中心組合的細(xì)胞密度的回歸方程為:

X1:氮源,X2:碳源,X3:磷酸氫二鉀, 回歸方程用決定系數(shù)R2檢測, 其值為0.8221, 說明實(shí)際值與預(yù)測值擬合良好; 變異系數(shù)(CV)=11.21%, 值稍大, 但在合理范圍內(nèi), 說明模型可信度高, 因素和水平的顯著性可有效地檢測棘尾蟲的生長情況, 反映因素之間相互影響的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過方差分析, 從表中可以觀察到氮源、碳源和磷酸氫二鉀對于棘尾蟲細(xì)胞生長的影響都顯著, 氮源的影響最大, 其次是磷酸氫二鉀。最佳的配比為氮源的濃度80 mg/mL, K2HPO4·3H2O的濃度達(dá)到0.65% mg/mL, 碳源的終濃度為20 mg/mL時(shí), 細(xì)胞密度最大可達(dá)868 cells/mL左右。

2.5 優(yōu)化純培養(yǎng)基與常用培養(yǎng)基對浮萍棘尾蟲培養(yǎng)效果的比較

在相同的培養(yǎng)條件下, 初始接種量均為10 cells/mL, 分別添加等量的綠梭藻培養(yǎng)液、Pringsheim’s唇鞭蟲培養(yǎng)液和純培養(yǎng)基, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù), 對其進(jìn)行長達(dá)144h的計(jì)數(shù)觀察, 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)通過差異顯著性分析, 得到3種培養(yǎng)基對于浮萍棘尾蟲的影響, 得到在72h、96h和120h時(shí)均差異性顯著,P＜0.05, 說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基, 相對于其他兩種培養(yǎng)條件, 具有顯著影響。

在相同培養(yǎng)條件下, 浮萍棘尾蟲在Pringsheim’s液、綠梭藻培養(yǎng)液和優(yōu)化培養(yǎng)基(Medium)中的生長曲線見圖 3?？梢钥闯鲈?種培養(yǎng)基中, 細(xì)胞密度都在120h左右達(dá)到最大, 120h后隨之減少。在優(yōu)化培養(yǎng)基中最大細(xì)胞密度(Maximum cell concentration)MCC約為6.0×102cells/mL、代時(shí)(Generation times)GT為10h, 而在常用的Pringsheim’s液和綠梭藻使用的混合培養(yǎng)基中MCC為4.8×102和4.0×102cells/mL、GT為13h。在優(yōu)化后培養(yǎng)基相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式, 在保證細(xì)胞數(shù)量有所增加的情況下, 成功的縮短了細(xì)胞分裂代時(shí)。同時(shí), 活體和蛋白銀染色觀察培養(yǎng)蟲體效果(圖 4), 發(fā)現(xiàn)無菌純培養(yǎng)基中生長的棘尾蟲體內(nèi)不再有大量藻和細(xì)菌, 細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)均勻潔凈的狀態(tài)。

表2 三因素的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab. 2 Three-factor orthogonal experimental design

表3 三因素的方差分析Tab. 3 ANOVA for content of three components

2.6 浮萍棘尾蟲培養(yǎng)條件的優(yōu)化

分別以培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量做單因素實(shí)驗(yàn), 根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果, 分析可知: (1)溫度對于棘尾蟲生長的影響是顯著的, 隨著溫度的升高, 細(xì)胞密度逐漸增大, 到25℃時(shí), 細(xì)胞密度可達(dá)到850 cells/mL左右; 但溫度進(jìn)一步升高, 蟲體密度急劇減少(圖 5);(2)不同的初始pH對棘尾蟲的生長具有一定的影響,隨著初始pH的增加, 細(xì)胞密度也逐漸增加, 當(dāng)初始pH為7.0時(shí), 細(xì)胞密度達(dá)到1100 cells/mL左右, 當(dāng)初始pH繼續(xù)增加時(shí), 細(xì)胞密度反而下降, 利用單因素實(shí)驗(yàn)得出, 棘尾蟲生長的最佳初始pH為7.0 (圖 6);(3)不同的接種量對棘尾蟲數(shù)量的影響是顯著的, 利用單因素實(shí)驗(yàn)得出, 當(dāng)接種量為100 cells/mL時(shí), 細(xì)胞密度可達(dá)到3500 cells/mL, 在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)過高或過低的接種量均無法滿足分子實(shí)驗(yàn)的需求, 確定最佳接種量為100 cells/mL (圖 7)。本實(shí)驗(yàn)中采用的是容量為50 mL的無菌培養(yǎng)瓶, 加入10 mL培養(yǎng)液后水平放置, 既能夠保證培養(yǎng)瓶內(nèi)有充足的氧氣, 又能給棘尾蟲類喜貼壁生活的原生動(dòng)物提供足夠的表面積, 因此選擇的裝液量為10 mL。當(dāng)溫度為25℃, 初始pH為7.0, 接種量為100 cells/mL時(shí), 此為各因素的最佳培養(yǎng)條件。

圖3 浮萍棘尾蟲在三種培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig. 3 The growth curve of Stylonychia lemnae under three culture conditions

圖4 浮萍棘尾蟲在不同培養(yǎng)條件下的活體和染色圖片F(xiàn)ig. 4 Living and staining images of Stylonychia lemnae under different culture conditions

2.7 培養(yǎng)基配制方法及浮萍棘尾蟲的馴化

本實(shí)驗(yàn)將無菌培養(yǎng)浮萍棘尾蟲的純培養(yǎng)基命名為SLPP, 具體成分配比如下(表 4), 具體配置方法和步驟: (1)按配方稱取相應(yīng)藥品, 溶于100 mL滅菌ddH2O, 攪拌溶解均勻后, 調(diào)節(jié)pH等于7.0, 配制為母液; (2)將母液高壓蒸汽滅菌鍋, 115℃, 滅菌15min, 冷卻后4℃冰箱儲(chǔ)存待用; (3)培養(yǎng)前, 在超凈工作臺(tái)中, 用滅菌ddH2O將母液稀釋20倍后, 用于培養(yǎng)蟲體。

為了避免藻類的干擾, 浮萍棘尾蟲可先選用普通麥粒水培養(yǎng)一段時(shí)間, 待達(dá)到對數(shù)生長期后, 再將浮萍棘尾蟲轉(zhuǎn)接到滅菌的SLPP培養(yǎng)基中, 在25℃條件下, 無菌培養(yǎng)至對數(shù)期生長期, 再連續(xù)轉(zhuǎn)接3次, 可獲得能夠穩(wěn)定的在SLPP培養(yǎng)基中生長繁殖的無菌蟲體, 用于后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)和分子實(shí)驗(yàn)。

圖5 浮萍棘尾蟲在不同溫度下的細(xì)胞密度Fig. 5 The cell density of Stylonychia lemnae under different temperatures

圖6 浮萍棘尾蟲在不同初始pH下的細(xì)胞密度Fig. 6 The cell density of Stylonychia lemnae under different initial pH

3 討論

原生動(dòng)物大都生活在有機(jī)質(zhì)豐富、水質(zhì)腐敗且不大流動(dòng)的污水中。不同的水質(zhì), 生活著不同種類的原生動(dòng)物。通常我們在野外采集回的樣品, 均需經(jīng)過原位水的培養(yǎng), 逐漸替換為蒸餾水進(jìn)行馴化,培養(yǎng)過程中通過添加麥粒、米粒等物質(zhì)產(chǎn)生的菌類, 供給營養(yǎng)[26]。研究發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物和水細(xì)菌關(guān)系密切, Sanders等[27]指出無論在淡水或海洋生態(tài)系統(tǒng)中, 細(xì)菌和鞭毛蟲的數(shù)量有著較為穩(wěn)定的比例(約1000:1)。原生動(dòng)物對細(xì)菌的掠食速度是驚人的,每時(shí)每刻都在進(jìn)食, 所以食用的菌類、藻類等物質(zhì)長期殘留在蟲體內(nèi)。在顯微鏡下分別拍攝在菌類、藻類喂飼下的棘尾蟲活體和蛋白銀染色圖片時(shí), 可明顯的觀察到存在于蟲體內(nèi)部未消化完全的食物(圖 4)。因此, 為了減少細(xì)菌和藻類對分子測序分析的干擾, 往往在提取浮萍棘尾蟲遺傳物質(zhì)前,先進(jìn)行饑餓處理, 但是細(xì)菌和微藻在蟲體內(nèi)依然難以被完全消化[28], 對分子測序結(jié)果產(chǎn)生干擾。而使用已有的自由生纖毛蟲無菌純培養(yǎng)基時(shí), 發(fā)現(xiàn)棘尾蟲不能獲得穩(wěn)定的生長效果。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)的研究和檢驗(yàn), 初步建立了適合浮萍棘尾蟲無菌純培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。利用該純培養(yǎng)體系, 最大細(xì)胞密度可比傳統(tǒng)培養(yǎng)方式提高1.2%左右, 有效避免其他物種干擾, 同時(shí), 該培養(yǎng)基成分與嗜熱四膜蟲純培養(yǎng)基相比更加簡潔廉價(jià)。

圖7 浮萍棘尾蟲在不同接種量下的細(xì)胞密度Fig. 7 The cell density of Stylonychia lemnae under different inoculation quantity

表4 SLPP培養(yǎng)基組分Tab. 4 SLPP medium component

經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基從原來的“少量原種, 純營養(yǎng)液, 長周期培養(yǎng)”的方式轉(zhuǎn)變?yōu)椤按罅吭N, 配合型營養(yǎng)液, 短周期培養(yǎng)”的方式[29], 在培養(yǎng)基中所添加的碳源、氮源和無機(jī)鹽均是原生動(dòng)物培養(yǎng)中常用的營養(yǎng)成分。經(jīng)過篩選營養(yǎng)成分和優(yōu)化培養(yǎng)條件, 建立起了適用于腹毛類棘尾蟲屬的培養(yǎng)基, 既可以獲得純凈的生物樣品, 又可以縮短實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)的周期, 有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。