李漢兵，趙旭琴，王心怡，戚佳夢，王 燦，姚元發(fā)

（1.浙江工業(yè)大學藥學院藥理學系，浙江 杭州310014；2.浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院生物醫(yī)學工程系，浙江 杭州310027）

二甲雙胍是臨床上使用非常廣泛的一線抗2型糖尿病藥物。18 世紀70 年代，歐洲地區(qū)已有文獻記錄豆科植物中的山羊豆（Galega officinalis Linn）可治療糖尿病[1-2]。1844-1878 年，Strecker 和Rathke 確定有效成分為胍類化合物并人工合成[3]。1918年，人工合成的二甲雙胍問世[4]。隨后大量的動物和人體研究證實二甲雙胍的降血糖作用[5-6]。1958年，二甲雙胍被英國和歐洲其他國家批準用來治療糖尿病。由于其合成工藝簡單、成本低廉、具有優(yōu)越的抗高血糖效果和較低的副作用，迅速成為臨床上抗2型糖尿病的“首選藥”。公認的二甲雙胍抗高血糖機制是抑制肝葡萄糖異生作用和增加外周組織對葡萄糖的利用達到降血糖的效果[7]。進一步研究揭示，二甲雙胍通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）抑制轉錄因子環(huán)腺苷酸反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）上的結合蛋白Ser436磷酸化[8]。此外，二甲雙胍激活AMPK，促進骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）囊泡向細胞膜轉運，提高外周組織對葡萄糖的攝取。在肝細胞中，二甲雙胍激活的AMPK進一步激活其下游底物乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）1/2，促進脂質代謝進而改善肝細胞的胰島素敏感性[9]。因此，二甲雙胍被廣泛認為是AMPK的激動劑，其藥理作用與AMPK的激活緊密相關。

目前，多個流行病學研究發(fā)現，相比使用磺酰脲類藥物或胰島素類藥物的患者，使用二甲雙胍治療糖尿病的患者具有更低的患癌風險[10-13]。大部分的研究認為，二甲雙胍抗腫瘤機制主要表現為磷酸化激活AMPK：①通過結節(jié)性硬化復合物（tuberous sclerosis complex，TSC）抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，介導蛋白質合成[14]；②磷酸化激活ACC，抑制脂肪的合成[9]；③減少纖溶酶原激活物，抑制因子和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，抑制腫瘤血管的生成[15]；④磷酸化CREB 轉錄因子，減少糖異生[8]；⑤激活轉錄因子P53蛋白，抑制參與上皮間充質細胞轉化的Slug、Snail 和神經型鈣黏附蛋白表達，影響腫瘤的轉移[16]。但也有一些新的證據發(fā)現，二甲雙胍不通過激活AMPK 仍然可以抑制腫瘤細胞的生長和遷移。本文將著重闡述二甲雙胍不依賴AMPK激活的抗腫瘤作用機制。

1 改善胰島素敏感性

Welzel 等[17]、Jinjuvadia 等[18]和Simon 等[19]3 個團隊臨床調查和meta 分析均發(fā)現，2 型糖尿病患者的患癌風險比正常人高。例如，2 型糖尿病患者患肝癌風險比正常人高3～5 倍。胰島素抵抗是2 型糖尿病的主要病理基礎。近年來，也有新觀點認為，高胰島素血癥（2 型糖尿病的典型臨床癥狀）是胰島素抵抗重要原因之一[20-23]。而胰島素作為刺激細胞生長和增殖的重要信號因子，又與腫瘤的發(fā)生有密切關系[24]。Wang等[25]在研究子宮內膜癌時發(fā)現，患者體內胰島素水平和胰島素受體（insulin receptor，IR）表達水平均有升高，通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路促進細胞有絲分裂和抗凋亡，促進子宮內膜瘤的發(fā)生。在各亞型的乳腺癌中，IR 磷酸化激活降低了患者生存率，受體抑制劑可顯著抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長[26]。因此，過高的胰島素水平具有一定的致癌作用，降低癌癥患者胰島素水平或減少IR表達和激活，改善胰島素敏感性，對腫瘤的治療具有積極作用。

一項對2713 例臨床病例跟蹤調查研究發(fā)現，長期服用二甲雙胍均能提高胰島素抵抗高風險人群和普通人群的胰島素敏感性[27]。Dowling等[28]通過對患者乳腺癌組織免疫組化染色發(fā)現，二甲雙胍治療后反而顯著降低AMPK 及其底物ACC 的磷酸化，同時觀察到與細胞生長相關的IR表達及其下游的Akt 磷酸化、胞外信號調節(jié)激酶磷酸化均有顯著性降低。另一項研究發(fā)現，在用二甲雙胍治療煙草誘導的肺癌模型中，肺癌組織中胰島素樣生長因子受體和IR磷酸化受到抑制，但并未發(fā)現AMPK被激活[29]，這提示二甲雙胍可能通過非AMPK途徑降低循環(huán)中胰島素水平且抑制由IR 介導的細胞生長。葡萄糖刺激胰島素的分泌與肝糖異生是一對相互拮抗的生理反應，糖異生重要的轉錄調節(jié)因子CREB Ser133 磷酸化后，激活肝分泌神經肽吻素（kisspeptin）可抑制胰腺cAMP 合成和中和胰高糖素樣肽促胰島素分泌作用[30]。二甲雙胍作為糖異生的重要抑制劑，在AMPK 未激活狀態(tài)下，可非競爭性抑制甘油磷酸鹽脫氫酶活性和穿梭至線粒體，減少線粒體呼吸作用，使胞漿NADH累積。受抑制的甘油磷酸鹽脫氫酶直接影響甘油進入糖異生途徑，且累積的NADH抑制乳酸在乳酸脫氫酶的作用下氧化成丙酮酸，二者均可減少糖異生[31]。簡而言之，二甲雙胍可激活AMPK磷酸化CREB抑制其調節(jié)糖異生相關基因表達，也可非競爭性抑制甘油磷酸鹽脫氫酶和抑制乳酸轉變?yōu)楸徇M而減少進入糖異生途徑的中間體。糖異生的減少在一定程度上抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌，降低血液中胰島素水平，改善胰島素敏感性，營造一個不利于腫瘤細胞生長的環(huán)境。此外，脂肪酸刺激NLR 家族Pyrin域蛋白3介導的炎癥激活，促使脂肪細胞中白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 表達，這2種炎癥因子均可抑制IR底物激活，如磷酸化其Ser307 位點，抑制后續(xù)Akt 的激活，導致胰島素抵抗，而在飲食誘導的肥胖小鼠的脂肪細胞中，二甲雙胍抑制IL-1β 和IL-6 的表達及其介導的VEGF 基因的表達，改善胰島素抵抗并減少VEGF水平，這對肥胖型腫瘤患者的抗腫瘤治療也有積極影響[32-34]。

2 抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路

mTOR 是細胞代謝過程的重要一環(huán)，主要受生長因子（包括VEGF、氨基酸和葡萄糖）、細胞能量狀態(tài)和多種形式的應激（如DNA損傷等）激活[35]，控制細胞的生長、增殖和代謝。mTOR一般通過形成復合物即mTOR 復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTORC2 發(fā)揮功能，2 種復合物均有mTOR、攜SEC13哺乳動物致命因子8 和mTOR 互作的DEP結構域3 個元件。mTORC1 還包括mTOR 調節(jié)相關蛋白（regulatory-associated protein of mTOR，Raptor）和富脯氨酸的Akt底物，其下游底物真核生物翻譯起始子結合蛋白可啟動多種致癌蛋白的表達涉及細胞周期蛋白、原癌基因激活、血管生成、細胞存亡、細胞與環(huán)境交流及細胞侵襲等[36]；另一下游底物核糖體蛋白S6 激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）被Raptor 磷酸化Thr389 激活促進核糖 體 的蛋白質合 成[37]。mTORC2 特有mTOR對雷帕霉素（西羅莫司）遲鈍元件、應激刺激的蛋白激酶互作蛋白1和乳腺癌抑制基因Protor-1。mTORC2主要參與蛋白質合成、細胞骨架重組和自噬等生理過程[38]，也有學者提出mTORC2 促進脂肪酸、鞘磷脂和甘油磷脂的合成，誘導肝癌發(fā)生[39]。

AMPK通過激活TSC2與TSC1形成復合物，抑制位于溶酶體上的腦內Ras同源蛋白（Ras homolog enriched in brain，Rheb）對mTORC1的激活，也可直接磷酸化Raptor 抑制mTORC1 活性，這些信號通路已被詳細闡明。因而，二甲雙胍通過AMPK的激活抑制mTOR信號通路也被廣泛認可。但Adem等[40]研究TSC2 敲除的小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）發(fā)現，二甲雙胍5 mmol·L-1和苯乙雙胍5 mmol·L-1處理后，AMPK底物ACC Ser79磷酸化增多，但mTORC1仍受到抑制，這可能與二甲雙胍濃度相關，二甲雙胍0.5 mmol·L-1（低濃度）刺激的mTOR 抑制依賴于TSC 復合物。因此，AMPK 不依賴TSC 復合物仍可以負調控mTOR 信號通路。在AMPK α1/α2 敲除的MEF 細胞中，2 種雙胍類藥物同等程度抑制AMPK α1/α2敲除的MEF 細胞和野生型MEF 細胞中mTORC1的底物S6K1 T389磷酸化，提示二甲雙胍存在抑制mTOR信號通路的其他靶點。

2.1 通過DNA損傷反應調節(jié)基因1抑制mTOR激活

DNA損傷反應調節(jié)基因1（regulated in devel?opment and DNA damage responses 1，Redd1）是低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的靶基因，參與調節(jié)細胞存活[41]，同時也受DNA 損傷、營養(yǎng)消耗、糖皮質激素和胰島素的調控[42-43]。Redd1是mTOR的負調節(jié)因子，它是通過影響mTOR活性和線粒體來抑制腫瘤發(fā)生的關鍵代謝調節(jié)劑[44]。Ben Sahra等[45]用二甲雙胍5 mmol·L-1處理前列腺淋巴結癌（lymph node carcinoma of prostate，LNCaP）細胞后，Redd1 蛋白和mRNA 表達水平都明顯增加，該現象在MCF-7和人非小細胞肺癌細胞A549 中也得到驗證。用二甲雙胍處理后，攜帶野生型p53 基因的LNCaP 細胞，Redd1 表達增加，而在p53 基因異常的2 種前列腺癌細胞DU145（p53基因突變）和PC3（p53基因缺失）中無變化，提示二甲雙胍可能通過p53 基因上調Redd1表達。隨后用p53基因敲除實驗也驗證了該結論。

Brugarolas 等[44]在研究低氧誘導的HEK293和HeLa 細胞中mTOR 信號通路時，發(fā)現Redd1 抑制mTORC1 的下游底物S6K1 Thr389 位點的磷酸化，TSC2敲除可消除Redd1對S6K1的磷酸化，提示Redd1可能以TSC 依賴的方式負調控mTOR信號通路。Redd1被誘導激活后可與14-3-3蛋白（一類介導誘導基因的組蛋白磷酸化作用的蛋白質[46]）結合，導致TSC2/14-3-3復合物解離，暴露磷酸化位點，TSC1/2被激活從而抑制mTORC1[47]。Ben Sahra等[45]將LNCaP 細胞和MEF 細胞中Redd1 敲低，不影響二甲雙胍對AMPK的磷酸化程度，同時也觀察到S6（S6K1 的底物）磷酸化水平增加。AMPKα1/α 2亞基敲低，只能輕微減弱二甲雙胍對細胞增殖的抑制，但Redd1敲低后基本消除了二甲雙胍抑制作用，提示二甲雙胍通過Redd1抑制mTOR。

2.2 通過Ras 相關GTP 結合蛋白抑制mTORC1轉位

氨基酸激活的mTOR 通路牽涉一種特異性蛋白即Rag蛋白[48]，Gator1復合物在氨基酸刺激下會被降解，解除對Rag 的抑制作用[49]，Rag 將結合到mTORC1 上并招募更多的mTORC1，位于溶酶體上的Rheb 完成mTORC1 的活化[50]。二甲雙胍通過抑制Rag A和Rag C蛋白酶活性，阻止mTORC1復合物向溶酶體聚集，抑制mTOR 信號通路。即在氨基酸刺激的mTOR 信號啟動時，二甲雙胍-Rag-mTORC1-S6K1 軸是二甲雙胍-AMPK-TSCmTORC1-S6K1軸功能有效的保障[51]，這一現象也符合Klubo-Gwiezdzinska 等[52]在研究骨髓甲狀腺癌細胞時觀察到AMPK 催化位點失活并不影響二甲雙胍對S6K1的抑制。

因此，二甲雙胍不依賴AMPK抑制mTOR信號通路達到抗腫瘤作用是存在理論基礎的。

3 抑制腫瘤遷移相關因子

細胞要遷移時，必須改變其形狀和韌性，方便其與周圍的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）相互作用。ECM 提供了細胞黏附和爬行的附著點，同時也是細胞向前運動以及影響生長因子發(fā)揮作用的天然屏障。腫瘤細胞運動形式主要可分為間葉細胞狀運動和偽足狀運動。單細胞爬行是由相互依存的幾個步驟（細胞極化并形成突出物、突出物和整合素附著到ECM、ECM降解和細胞收縮、細胞尾部解黏附）連續(xù)循環(huán)而成的[53]。在偽足狀運動中，細胞呈圓形，較少依賴蛋白酶，需要高的Rho 激酶信號來驅動更高水平的肌球蛋白收縮。2 種運動狀態(tài)受外界條件刺激可相互轉換，當基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶等蛋白酶在進行間葉遷移的細胞中被阻斷時，這些細胞可通過不依賴蛋白酶的偽足狀運動爬行。小GTP 酶家族的成員包括Rho/ROCK、Ras 相關C3 肉毒桿菌毒素底物（Ras-related C3 botulinum toxin substrate，Rac）和細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，CDC42）等都是細胞運動的關鍵調節(jié)因子，這些蛋白與整合素、肌動蛋白纖維和肌球蛋白等相互作用，調節(jié)癌細胞爬行[54]。

3.1 抑制Ras相關C3肉毒桿菌毒素底物

當細胞開始爬行時，Rho 富集于細胞偽足尖端，激活ROCK1/2 促進肌動蛋白形成應激纖維和肌動蛋白收縮，Rac 負責肌動蛋白聚集形成板狀偽足[54-55]，其中，Rac 將會受到多種上游信號如P-Rex1，CXCL12，ROCK和DOCK3等調控。敲低Rac 及其上游的ROCK 將顯著抑制腫瘤細胞侵襲能力[54]。雖然Cerezo 等[16]報道，二甲雙胍可調控黑素瘤細胞上皮間充質轉化過程，且該過程依賴于AMPK 的激活，但在腫瘤細胞遷移和侵襲過程中，二甲雙胍則是通過抑制P-Rex1 和減少化學因子CXCL12，顯著抑制Rac活性，阻礙細胞形成板狀偽足，進而抑制腫瘤細胞的遷移[56]。早些年研究認為，Rac 是AMPK 的下游底物，細胞骨架的重排需要AMPK參與并激活Rac蛋白，且AMPK抑制劑化合物（Compound C）可逆轉此現象[57]，但化合物C是一類易脫靶的工具藥，可造成假陽性結果。Sylow等[58]發(fā)現，Rac 激活不需要AMPK 參與，也非其下游底物，AMPKα 亞基失活不會影響Rac 對肌動蛋白的調控。

3.2 抑制細胞分裂周期蛋白42

CDC42 在惡性腫瘤中調節(jié)細胞骨架和微管動力學、細胞間和細胞內外基質黏附中都起到了非常重要的作用[59]。有文獻報道，CDC42 失活導致胃癌細胞凋亡和G1期阻滯[60]，抑制乳腺癌細胞生長和運動[61]。CDC42 與其效應器MRCK（Rac/CDC42結合激酶）α 亞基結合，磷酸化肌動蛋白Ⅱ輕鏈上Thr18 和Ser19 位點，啟動細胞收縮運動[62]。二甲雙胍可下調胰腺癌細胞SU86和高轉移乳腺癌細胞MDA-MB-231 中CDC42 的mRNA 水平和蛋白表達，細胞的增殖、遷移和侵襲均受到顯著抑制。有趣的是，AMPK 的下調也會引起CDC42 下調，AMPK 敲除并不能逆轉二甲雙胍對CDC42 的影響，提示二甲雙胍并非通過AMPK 發(fā)揮功能。RNA-seq篩選并驗證，二甲雙胍通過下調組氨酸氨基轉移酶1（histone acetyltransferase 1，HAT1）、轉錄延長因子β 多肽2（transcription elongation factor β polypeptide 2，TCEB2）和酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白β（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase acti?vation protein β，YWHAβ）轉錄調節(jié)子抑制cdc42基因表達[63]。這一實驗結果與Hadad 等[64]開展的二甲雙胍對乳腺癌治療作用的臨床隨機雙盲研究結果一致。他們發(fā)現，服用二甲雙胍的糖尿病乳腺癌癥患者的癌組織中CDC42顯著下調。

因此，二甲雙胍可干預2 種與細胞運動密切相關的蛋白Rac和CDC42，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，且該途徑不需要AMPK的參與。

3.3 抑制基質金屬蛋白酶

MMP 是一類降解細胞外基質多種成分的蛋白水解酶。細胞收縮前，MMP和組織蛋白酶將ECM的組分膠原、纖連蛋白和層連蛋白降解成較小的碎片，還可將無活性的前基質金屬蛋白（pro-MMP）剪切生成具有活性MMP。這些較小的片段再由明膠酶（MMP2 和MMP9）或絲氨酸蛋白酶完全降解[53]。ECM 的降解促使腫瘤生成和遷移相關因子更加便捷地作用到靶細胞，創(chuàng)造一個趨化性的微環(huán)境。MMP9在宮頸癌、結直腸癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌等多種癌癥中表達增高[65-66]。Hwang 等[67]研究發(fā)現，在人成纖維肉瘤細胞HT-1080 細胞中，二甲雙胍通過抑制佛波醇誘導MMP9 的轉錄啟動因子激活蛋白1活化，來抑制MMP9的mRNA和蛋白的表達水平。同時，AMPK 抑制劑化合物C 和AMPK 催化亞基失活并不能改變二甲雙胍對MMP9 和其轉錄啟動因子激活蛋白1 的抑制作用，表明此通路并不依賴AMPK。

4 其他途徑

血管生成是腫瘤發(fā)生和轉移的重要步驟，VEGF在血管生成過程中起著重要的作用[68]。多種VEGF 與癌癥的發(fā)生和轉移相關。研究表明，VEGF-A可促進肝癌細胞的增殖[69]，腫瘤細胞也可利用VEGF-A 刺激的炎癥反應誘導血管通透性增加，促進腫瘤的遷移和擴散[70]。VEGF-D 通過調節(jié)集束淋巴管內皮產生的前列腺素促進腫瘤轉移[71]。二甲雙胍可通過mTOR 途徑抑制VEGF 介導的血管生成，同時還能降低血液循環(huán)中VEGF 水平[15]。Wang 等[72]的研究表明，二甲雙胍對VEGF介導的腫瘤血管生成有雙重作用：一方面，其通過靶向人表皮生長因子受體2信號途徑減少腫瘤細胞分泌VEGF，且此作用并不依賴AMPK；另一方面，二甲雙胍對VEGF信號有抑制作用。

環(huán)加氧酶2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）生物合成途徑中的關鍵酶。Ristim?ki 等[73]取膀胱移行細胞癌患者樣本做COX-2 免疫組化，發(fā)現COX-2 在非侵襲性腫瘤細胞中有較高的表達。PGE2在包括膀胱癌在內的不同癌癥的腫瘤干細胞再生中起著重要作用[74]。COX-2/PGE2 可能通過激活JAK2/信號轉導子和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路而在腫瘤干細胞再生中發(fā)揮重要作用[75]。Liu 等[76-77]研究證實，二甲雙胍能通過抑制動物和細胞模型中的COX-2/PGE2/STAT3 軸，抑制膀胱癌腫瘤干細胞再生和前列腺癌上皮間充質轉化。

H19 是胚胎發(fā)育和胎盤發(fā)育過程中表達最高的基因之一，除骨骼肌和心臟以外，其在其他成體組織中的表達極低[78]。H19 在大多數正常成人組織中無表達，但在多種惡性腫瘤中都有表達[79]，包括乳腺癌[80]、卵巢癌[81]和子宮內膜癌[82]等。Yan等[83]將人卵巢癌細胞A2780 和人子宮漿液性癌（子宮內膜癌高度侵襲性變體）細胞ARK2 用二甲雙胍10 mmol·L-1刺激48 h 后，用定量甲基化特異性PCR檢測到H19啟動子甲基化增加，從而下調H19的轉錄來抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，提示這可能是二甲雙胍的一種新機制。

5 結語與展望

二甲雙胍是一種具有多種作用位點的藥物，它可不依賴AMPK，通過改善胰島素敏感性，下調Rag活性和Redd1 表達抑制mTOR 信號通路影響腫瘤細胞的生長和增殖，下調Rac活性、CDC42和MMP的表達抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲（圖1）。然而，Howell 等[84]的研究揭示了二甲雙胍抑制mTORC1有2 種作用模式：在低劑量（0.5 mmol·L-1）下，二甲雙胍需要AMPK 和TSC 復合物才能抑制mTORC1；而在高劑量（＞1 mmol·L-1）下，AMPK與TSC復合物相互獨立，即AMPK的敲除不會影響二甲雙胍對mTORC1 的抑制。提示二甲雙胍是否依賴AMPK可能與其使用劑量密切關聯。此外，也有研究表明，VEGF可通過AMPK磷酸化果糖-6-磷酸氨基轉移酶1 而減弱果糖-6-磷酸氨基轉移酶1/己糖胺途徑的生血管作用[85]。因而，二甲雙胍是否依賴AMPK 發(fā)揮生物學效應值得進一步確證。臨床上，二甲雙胍的穩(wěn)態(tài)血藥濃度＜1 mg·L-1，在最大劑量下血漿濃度也不超過4 mg·L-1（約為0.03 mmol·L-1），而在大部分研究中使用二甲雙胍的濃度為1～10 mmol·L-1，遠遠高出臨床指導劑量，這部分實驗現象是否只由高濃度二甲雙胍作用產生也值得思索。闡明二甲雙胍抗腫瘤的詳細機制將為其作為腫瘤的輔助治療[86-87]、提高癌癥患者生存率、甚至協(xié)助高患癌風險的糖尿病患者預防癌癥提供堅定的理論基礎。

圖1 二甲雙胍不依賴腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的抗腫瘤機制.