肖紅衛(wèi)，華文君，華再東，任紅艷，張立蘋，鄭新民，朱 喆，畢延震

（湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北省動物胚胎工程與分子育種重點實驗室，湖北武漢 430064）

隨著動物發(fā)育到性成熟，生殖細胞中的親本基因組需要通過包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、組蛋白替換等在內的一系列表觀遺傳修飾，變成高度特化的精子和卵母細胞[1]。受精后胚胎在早期發(fā)育階段經歷了全基因組重編程，擦除表觀修飾，形成全能性的合子，從而啟動胚胎發(fā)育[2-3]。前人通過一系列的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠受精后胚胎基因組激活發(fā)生在2-細胞（2-cell）胚胎階段[4-7]，在胚胎基因組激活前，合子發(fā)育由卵子發(fā)生過程中儲存在成熟卵母細胞質中的母源因子（包括mRNA 和蛋白質）所調控。母體基因表達是卵母細胞成熟和早期卵裂的重要生物學過程。Cui 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著卵母細胞的發(fā)育，大量基因在GV 期卵母細胞中的表達量與在MII 期卵母細胞中的表達量發(fā)生變化。在GV 卵母細胞中上調的基因更可能參與蛋白質代謝和修飾、有絲分裂細胞周期、電子傳遞或受精或屬于微管/細胞骨架蛋白家族。在MII 卵母細胞中特異性上調的基因更可能參與DNA復制、氨基酸代謝或G 蛋白偶聯(lián)受體和信號分子的表達。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，這些母源因子啟動早期胚胎發(fā)育，隨后基因組開始轉錄，表達新的基因和合成新的因子，并發(fā)生級聯(lián)反應，合成更多的細胞因子，保持早期胚胎繼續(xù)發(fā)育[8]。上述科學家通過大量的先進研究方法，驗證出小鼠胚胎發(fā)育過程中母源基因向合子基因轉換的時機在胚胎發(fā)育的2-cell 期，但是這些胚胎活檢方法復雜，容易受到分子檢測的假陽性的影響，需要能夠可以實時、直觀觀察小鼠胚胎發(fā)育過程中母源基因向合子基因轉換的時機方法。

EGFP基因來源于水母（Aequorea victoria）[9-13]，于熒光顯微鏡下觀察轉EGFP基因的胚胎，可以發(fā)現(xiàn)轉基因胚胎有綠光[13]。本研究利用EGFP基因作為報告基因，通過轉增強型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀/♂）分別與野生型小鼠進行交配所得到的胚胎，研究小鼠胚胎發(fā)育過程中母源基因向合子基因組轉換的時間節(jié)點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及胚胎來源 選擇6～8 周齡（20 g 左右）EGFP轉基因的公、母昆明小鼠，轉基因小鼠由湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物生物技術研究室提供[13]。6～8 周齡（20 g 左右）普通昆明小鼠包括5～6 周齡的健康母鼠和7～8 周齡的健康公鼠，由湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。自由采食，自由飲水，每籠飼養(yǎng)小鼠5 只，墊料為鋸木屑。環(huán)境溫度與濕度不限制；照度為每天13 h 光照:11 h 黑暗；噪音無；環(huán)境清潔度屬SPF動物房。動物飼養(yǎng)環(huán)境的級別屬SPF 級[13]。

1.1.2 主要試劑與儀器 孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）均購自寧波三生藥業(yè)有限公司；Olympus IX70 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1EGFP轉基因小鼠與普通昆明小鼠交配EGFP轉基因母鼠與普通昆明小鼠交配，以及EGFP轉基因公鼠與普通昆明小鼠交配。

1.2.2 胚胎采集 合籠第2 天檢查陰栓，見栓后4 h 內以及見栓后4～28 h，頸椎脫臼法處死母鼠，75% 酒精消毒后切開腹腔，剪下輸卵管及連接的一小段子宮，置于有PBS 的平皿中，顯微鏡下用注射器從輸卵管壺腹部、子宮角收集胚胎，并在鏡下清洗后置于有M16 液滴的培養(yǎng)皿中，置37℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察 把沖出的受精胚置于熒光顯微鏡下，用波長490 nm 的紫外光觀察，濾光片為ND25 和WIB。

1.3 實驗設計 本研究利用小鼠配子發(fā)育中的減數(shù)分裂以及受精的原理，在轉增強型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀）與野生型小鼠進行交配的實驗中，EGFP基因只能來自母鼠，所以用EGFP基因模擬母源基因；在轉增強型熒光蛋白（EGFP）基因小鼠（♂）與野生型小鼠進行交配的實驗中，EGFP基因只能來自公鼠，所以用EGFP基因模擬合子基因/父源基因。熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的時期就是母源基因向合子基因組轉換的時間節(jié)點。

2 結果與分析

2.1 轉EGFP基因母鼠與普通昆明小鼠交配 收集轉EGFP基因母鼠與普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在熒光顯微鏡下觀察所收集到的胚胎，可以觀察到熒光，熒光主要分布在受精胚以及周圍的顆粒細胞中（圖1）。說明作為轉入的外源基因在卵母細胞發(fā)育以及受精之前就已經表達。

圖1 EGFP 轉基因小鼠（母鼠）以及所取的胚胎

2.2 轉EGFP基因公鼠與普通昆明小鼠交配 收集轉EGFP基因公鼠與普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在熒光顯微鏡下觀察收集所得的胚胎，直到2-cell 期的胚胎時才可以見到有熒光（圖2），熒光主要分布在受精胚中（圖2 中的綠色熒光部分）。說明作為轉入的外源基因在卵母細胞受精之后才開始表達。

圖2 EGFP 轉基因小鼠（公鼠）以及所獲得的胚胎

2.3EGFP轉基因小鼠的后代 收集EGFP轉基因小鼠的胎兒，在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因后代小鼠胎兒中的熒光分布與胚胎發(fā)育初期中的分布特征并不一致，有全身呈現(xiàn)熒光的，也有在身體末端呈現(xiàn)熒光（圖3-A），或者只有很淺的熒光（圖3-B）。

圖3 EGFP 轉基因小鼠的后代

3 討 論

母體-合子轉變（Maternal-To-Zygotic Transition，MZT）過程是一個保守的過程，在此過程中母體環(huán)境通過顯著的重編程轉變?yōu)榕咛ヲ寗影l(fā)育的環(huán)境，這是繼續(xù)發(fā)育所必需的[1]。在卵子發(fā)生過程中，哺乳動物卵子會積累早期胚胎發(fā)生所需的蛋白質。數(shù)據(jù)表明母源因子在染色質重編程和胚胎基因組激活中起著至關重要的作用。Yang 等[14]通過斑馬魚早期胚胎中RNA5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾的全基因組分析發(fā)現(xiàn)，m5C mRNA修飾在MZT 期間動態(tài)調節(jié)母源基因轉錄物的分子機理。Zheng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，母源因子在早期切割小鼠胚胎發(fā)生中維持染色體穩(wěn)定性和整倍性的作用。Filia 在生長的卵母細胞中表達，編碼一種與MATER 結合的蛋白質，并參與卵裂期胚胎發(fā)育所必需的皮質下母體復合物。Filia 母體貯存的消耗削弱了胚胎植入前胚胎發(fā)育的非整倍性，這是由于異常的紡錘體組裝，染色體錯位和紡錘體組裝檢查點（SAC）失活引起的。為了確保正常的紡錘體形態(tài)發(fā)生，F(xiàn)ilia 通過RhoA 信號傳導途徑調節(jié)關鍵紡錘體組裝調節(jié)劑（即AURKA，PLK1 和微管蛋白）在微管組織中心的正確分配。同時，F(xiàn)ilia 蛋白需要將MAD2（SAC 的一個重要組成部分）放置到動粒上，以實現(xiàn)SAC 功能[15]。Tsunemoto 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細胞和植入前胚胎中3 種小鼠母體基因（H1oo，Npm2和Zar1）的啟動子區(qū)域在卵母細胞中顯示出轉錄活性，但在受精胚胎中沒有。Cui 等[8]、Sekita 等[17]證明，反轉錄轉座子衍生的Rtl1（反轉錄轉座子樣1），也稱為Peg11（父本表達11），對于維持胎兒毛細血管必不可少，并且其損失和其過量產生導致晚胎和/或新生兒老鼠的致死率。然而，卵受精后到胚胎基因組轉錄激活存在著一定的過渡期，小鼠胚胎發(fā)育時基因組的激活時間確定是研究的難點。本研究以EGFP轉基因鼠為研究對象，以EGFP蛋白為基因組激活的標志物，在熒光顯微鏡下觀察，小鼠胚胎在2-cell 期出現(xiàn)熒光，因此判斷2-細胞胚胎期為基因組激活的時間點，這一結果與前人[6-7]的結果一致。

Zhou 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在著床后早期的時間窗口內可能參與特異性調控關鍵基因的轉錄，與基因轉錄共同協(xié)調決定了不同細胞譜系的發(fā)育潛能特化過程。本實驗中收集到EGFP轉基因小鼠胎兒體內的熒光分布與胚胎發(fā)育初期中的分布特征并不一致，可能是因為多細胞生物體由具有相同基因組的不同細胞類型組成，在器官組織發(fā)育過程中，無論在發(fā)育過程還是疾病狀態(tài)下，表觀遺傳因素（不改變DNA 序列的情況下）在細胞命運決定中起著指導性作用，細胞類型和功能異質性往往通過調控基因表達來實現(xiàn)[19]。