焦文陽,陸 寧,王蘭騰,關(guān) 甜,雷紅濤,沈 興

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)是血清主要的抗體成分,結(jié)構(gòu)由抗原結(jié)合片段(antigen-binding fragment,Fab)和可結(jié)晶片段(fragment crystallized,Fc)組成。其中Fab片段保留了抗體完整的抗原結(jié)合部位及互補(bǔ)決定區(qū),在臨床診斷治療[1-2]、免疫分析檢測[3-4]和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域,以其結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、免疫原性低、不與Fc受體結(jié)合、組織滲透力高等優(yōu)點(diǎn)[5]越來越受到重視,被認(rèn)為有取代完整抗體的潛質(zhì)。

目前,以天然抗體為原料,制備Fab片段的主要方法為酶解法,通過蛋白酶作用于IgG鉸鏈區(qū)附近的肽鍵,將完整的IgG水解為Fab片段和Fc片段[6],再利用親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等一系列的蛋白純化方法對酶解產(chǎn)物進(jìn)行純化,獲得單一的Fab片段。由于酶切條件對酶切位點(diǎn)專一性有較大影響、且Fab片段與Fc片段大小相近等原因,給實(shí)際的純化過程造成較大干擾,往往需要多種純化手段的組合使用才能得到純度較高的Fab片段。為減少Fab純化步驟,目前的研究集中于新型純化介質(zhì)的開發(fā),如Spooner等[7]開發(fā)了新型抗CH1親和層析樹脂,能夠一步從輕鏈二聚體中純化得到正確組裝的Fab片段;Gagnon等[8]使用鈣衍生化羥基磷灰石,利用Fab不能與鈣衍生形式的羥基磷灰石結(jié)合,能夠從木瓜蛋白酶消化液純化獲得95%以上的純度的Fab片段。除此之外,新型金屬離子親和層析介質(zhì)[9]、固定化抗Fab抗體[10]等介質(zhì)也被應(yīng)用于Fab純化。新型純化材料雖可提升Fab純化效率,但與此同時(shí)伴隨著普及程度低、商業(yè)化應(yīng)用少,成本高,特異性、穩(wěn)定性較差等問題。如何利用現(xiàn)有的、廣泛應(yīng)用的層析填料進(jìn)一步改進(jìn)Fab片段的純化效率,對研究高效制備Fab片段具有重要意義。

本研究前期獲得一株抗水體污染物MC-LR抗體,其Fab片段與凝膠過濾層析(gel filtration chromatography,GFC)介質(zhì)存在非常強(qiáng)烈的非特異性結(jié)合,無法流穿。在此基礎(chǔ)上利用凝膠過濾層析柱通過改變流動(dòng)相條件一步純化Fab片段,在不同離子強(qiáng)度和pH的流動(dòng)相中,考察Fab片段在凝膠過濾層析柱上的吸附選擇性,結(jié)合Fab片段本身性質(zhì)對二者的吸附機(jī)制進(jìn)行探討,以期為Fab片段高效純化方法的開發(fā)提供一種新的思路,同時(shí)為蛋白純化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微囊藻毒素-LR(MC-LR) 美國Enzo Life Sciences公司;基礎(chǔ)培養(yǎng)基及胎牛血清 美國Gibco公司;HiTrap Protein G HP預(yù)裝柱和Hiload Superdex 75(S-75)16/60層析柱 美國GE Healthcare公司;木瓜蛋白酶(酶比活為16～40 BAEE U/mg) 美國Thermo公司;TGXTMFastCastTM蛋白膠試劑盒(12%)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量(Maker) 美國Bio-Rad公司;檸檬酸、磷酸二氫鈉、氯化鈉等常用試劑(分析純) 天津大茂公司;甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(純度均大于90%) 美國Sigma公司;SPF級Balb/c小鼠 廣東省動(dòng)物中心;MC-LR雜交瘤細(xì)胞株 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

AKTA pure蛋白純化儀 美國GE Healthcare公司;Mulstiskan FC型酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;PowerPacTM通用電泳儀 美國Bio-Rad公司;NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì) 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MC-LR單克隆抗體的制備及酶解 復(fù)蘇MC-LR雜交瘤細(xì)胞株,使用完全培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基500 mL,胎牛血清50 mL)擴(kuò)大培養(yǎng),將細(xì)胞懸液(500 μL/只)注射到提前一周注射過500 μL石蠟的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)制備腹水。采用HiTrap Protein G HP預(yù)裝柱對腹水進(jìn)行親和層析,使用PBS緩沖液(20 mmol/L 磷酸緩沖液(PB),100 mmol/L NaCl,pH7.4)結(jié)合IgG,pH2.7的0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫,收集洗脫組分。使用木瓜蛋白酶酶解IgG,酶解條件為酶抗質(zhì)量比1∶80,半胱氨酸濃度25 mmol/L,pH7.0,反應(yīng)溫度37 ℃,反應(yīng)時(shí)間10 h[6]。

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對樣品進(jìn)行非還原和還原電泳分析,其中還原樣品中添加二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)并經(jīng)煮沸(5 min)處理,可以使抗體重鏈和輕鏈間的二硫鍵斷裂,從而顯示兩條鏈的分子量,而非還原樣品不做相應(yīng)處理,顯示本身分子量。使用TGXTMFastCastTM蛋白膠試劑盒配制12%的蛋白膠,0.5 mg/mL的樣品每孔上樣10 μL,電泳條件為恒流25 mA、30 min。蛋白膠使用考馬斯亮藍(lán)染色液染色[11],使用凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶。

1.2.2 凝膠過濾層析純化酶解液及Fab片段純度、收率分析 S-75凝膠層析預(yù)裝柱使用PBS緩沖液(同1.2.1)平衡,酶解液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣,流速為1 mL/min,收集各峰組分,一個(gè)柱體積后切換超純水洗脫,收集洗脫峰組分。各組分經(jīng)SDS-PAGE電泳分析(同1.2.1),將電泳分析為Fab片段的組分置于PBS緩沖液(同1.2.1)中,4 ℃透析1 d,-80 ℃冰箱中保存。

使用Image Lab軟件對Fab片段進(jìn)行純度分析。使用NanoDrop 2000c測定Fab片段在280 nm下吸光度,根據(jù)公式1算濃度c,再乘以體積便得到Fab片段質(zhì)量。一個(gè)IgG由2個(gè)Fab片段及一個(gè)Fc片段組成,結(jié)合Fc和Fab的理論分子量(55、45 kDa),10 mg IgG理論上可以得到約6.2 mg Fab片段。將實(shí)際Fab片段質(zhì)量除以理論Fab片段質(zhì)量,便可計(jì)算出Fab片段的回收率[12]。

c(mg/mL)=A280 nm×稀釋倍數(shù)/1.37

式(1)

1.2.3 間接ELISA檢測Fab片段效價(jià)與抑制 采用間接ELISA法(ic-enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)對Fab片段進(jìn)行效價(jià)與抑制的檢測。以MC-LR與載體蛋白OVA偶聯(lián)制備包被原,1 μg/mL包被酶標(biāo)板。Fab片段(10 mg/mL)從500倍起倍比稀釋,使用1 μg/mL MC-LR檢測Fab片段的抑制效果。根據(jù)公式2,取OD0值最接近1.0的抗體稀釋倍數(shù)的數(shù)據(jù)計(jì)算Fab片段對MC-LR的抑制率[13],并與腹水抑制率進(jìn)行比較。通常抑制率大于50%表明結(jié)果為陽性,抑制率越高,表明Fab片段對MC-LR的抑制效果越好。

抑制率(%)=(OD0-OD)/OD0×100

式(2)

式中:OD0為不添加藥物的光密度值;OD為添加藥物的光密度值。

1.2.4 Fab片段與S-75填料結(jié)合機(jī)制分析 分別配制0.25%、0.5%、1%、2%、4%和6%的SDS溶液,Fab片段分別在不同濃度SDS溶液下4 ℃孵育過夜,SDS-PAGE電泳驗(yàn)證250 kDa條帶組分。采用平板等電聚焦法測定Fab片段等電點(diǎn)pI[14]。分別在含有100 mmol/L NaCl和不含NaCl,pH為7.4和9.0的條件下,相互組合配制4種20 mmol/L Tris緩沖液(表1中緩沖液2～緩沖液5)。將4種緩沖液作為流動(dòng)相重新純化Fab片段,考察不同條件下Fab片段在S-75層析柱上不同的保留行為。

2 結(jié)果與分析

2.1 IgG純化和酶解片段的電泳分析

小鼠腹水進(jìn)行Protein G純化后的產(chǎn)物及木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PGAE電泳分析。IgG理論分子量約為150 kDa,經(jīng)還原后獲得約50 kDa的重鏈片段與約25 kDa的輕鏈片段。根據(jù)protein G親和純化產(chǎn)物的電泳顯示(圖1a),洗脫蛋白非還原電泳(泳道1)中除了少量高分子量的雜蛋白(約250 kDa),主要成分為120 kDa(150 kDa附近)處條帶,其在還原電泳中(泳道4)表現(xiàn)為50 kDa和25 kDa的條帶,分子量對應(yīng)IgG的輕鏈和重鏈,說明該條帶為IgG。與流穿蛋白相比較(泳道2、3),未見其余明顯雜帶,表示從小鼠腹水中經(jīng)Protein G純化得到了較純的IgG。從酶解產(chǎn)物電泳(圖1b,泳道1)可以看出,IgG經(jīng)由木瓜蛋白酶酶解主要生成了37 kDa上下的兩條帶及少量55 kDa和22 kDa附近條帶,120 kDa處的IgG含量極少,表示IgG基本酶解完全。酶解產(chǎn)物在還原泳道中(泳道2)表現(xiàn)為25 kDa附近三條帶及少量50 kDa處條帶。

圖1 Protein G親和純化及酶解產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of ascites purifiedby protein G and digestion products注:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量;a:1為洗脫蛋白非還原電泳;2為流穿蛋白非還原電泳;3為流穿蛋白還原電泳;4為洗脫蛋白還原電泳;b:1、2分別為酶解產(chǎn)物非還原及還原電泳。

2.2 Fab片段的純化

酶解產(chǎn)物經(jīng)過凝膠過濾層析介質(zhì)S-75分離,PBS緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)展現(xiàn)2個(gè)蛋白峰(P1、P2),流動(dòng)相切換為超純水后,在電導(dǎo)下降處出現(xiàn)第3個(gè)蛋白峰(圖2a)。由于P1組分紫外吸收信號(hào)值小于10 mAu,樣品濃度過低,使用SDS-PAGE分析不足以顯示條帶,因此選擇P2及P3進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2b)。Fc片段理論分子量約55 kDa,由兩條相同的部分重鏈組成,其在還原電泳中表現(xiàn)為約25 kDa的一條帶,P2組分中約40 kDa的條帶(泳道1、2)在還原電泳中表現(xiàn)為25 kDa上方的一條帶(泳道6、7),由此判斷為Fc片段,另外還有少量酶解碎片及未酶解的IgG(泳道2中120 kDa條帶和泳道7中50 kDa條帶及約23 kDa條帶);Fab片段由重鏈和輕鏈組成,其理論分子量約為45 kDa,但由于兩條鏈分子量不同,在還原電泳中表現(xiàn)為25 kDa附近兩條帶。P3組分主要有37 kDa附近條帶及少量250 kDa處條帶,對應(yīng)還原泳道(泳道8、9)為25 kDa上下兩條帶,由此初步判斷P3為Fab片段。Image Lab軟件分析顯示,Fab片段純度達(dá)到94.5%。P3組分經(jīng)濃縮、測定濃度、計(jì)算質(zhì)量,20 mg IgG得到了6.3 mg Fab片段,根據(jù)公式1計(jì)算其收率為51%。

圖2 S-75層析柱分離酶解產(chǎn)物譜圖及聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.2 S-75 chromatography andSDS-PAGE analysis of digestion products注:M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量;1、2為P2非還原電泳;3～5為P3非還原電泳;6、7為P2還原電泳;8、9為P3還原電泳。

2.3 Fab片段效價(jià)與抑制測定

使用ic-ELISA方法測定P3組分的效價(jià)與抑制,以不同稀釋倍數(shù)下450 nm的紫外吸光度值繪制效價(jià)抑制曲線圖(圖3),根據(jù)公式2計(jì)算出P3對MC-LR的抑制率為94%,與腹水活性相似(抑制率90%)。抑制率可以反映待測樣品特異性結(jié)合抗原的能力,Fab片段由于保留抗原結(jié)合區(qū)域,因此具有抗原結(jié)合能力,而Fc片段無法結(jié)合抗原。綜合P3組分和電泳分析及對MC-LR抑制率的測定,證明P3組分為Fab片段。此純化方法制備的Fab片段對MC-LR保持了良好的特異性,可為后續(xù)建立MC-LR快速免疫分析方法及結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)行抗體性能改造提供材料。

圖3 Fab片段(a)和腹水(b)對MC-LR的效價(jià)和抑制Fig.3 The titer and inhibition of the Fab fragment(a)and ascites(b)to MC-LR

2.4 Fab片段與S-75填料結(jié)合機(jī)制研究

為研究Fab片段與S-75間的吸附作用,研究蛋白等電點(diǎn)及聚集行為,改變流動(dòng)相條件對Fab片段的保留行為進(jìn)行分析。

表1 S-75色譜柱純化抗體Fab片段時(shí)不同的流動(dòng)相條件及Fab片段保留行為Table 1 The buffer conditions for S-75 and the retention behaviors of Fab fragment under different conditions

注:-代表不添加。2.4.1 Fab片段聚集研究 由于Fab片段的還原泳道(圖2b)僅有很純凈的重鏈和輕鏈兩條帶,因此推測非還原泳道(圖2b)中250 kDa的雜帶是Fab片段的聚集體。一般來說,蛋白質(zhì)越疏水,就越有可能形成聚集物[15]。SDS作為一種表面活性劑,能夠與蛋白質(zhì)疏水界面結(jié)合破壞疏水作用,從而減少蛋白聚集[16]。因此將Fab樣品分別在不同濃度的SDS溶液中孵育研究Fab片段的聚合。電泳結(jié)果顯示,相比于SDS溶液濃度為0.25%和0.5%的泳道,250 kDa條帶在濃度高于1%的SDS溶液中消失(圖4),僅存Fab單體條帶,證實(shí)250 kDa條帶為Fab片段的聚集體。隨著SDS添加濃度的增加,蛋白質(zhì)聚集率降低,推測Fab片段表面可能具有較強(qiáng)的疏水性引起其聚集。

圖4 Fab片段在不同濃度的SDS溶液中孵育過夜后非還原電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of Fab fragmentincubated in SDS solutions with different concentrations

2.4.2 Fab片段pI測定 Fab片段等電點(diǎn)聚焦圖譜見圖5。由樣品的遷移距離計(jì)算得到條帶1等電點(diǎn)為6.02,條帶2等電點(diǎn)為5.66。樣品中含有單體和聚集體,根據(jù)濃度判斷條帶對應(yīng)成分。由于條帶1組分濃度高于條帶2組分,結(jié)合SDS-PAGE凝膠圖(圖2)Fab片段濃度明顯高于聚集體,判斷抗體Fab片段等電點(diǎn)為6.02。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的等電點(diǎn)測試圖譜Fig.5 pI analysis of Fab fragment注:M為等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白,1:Fab片段;2:Fab片段聚集體。

圖6 四種不同的條件作為流動(dòng)相純化Fab片段的凝膠過濾層析譜圖Fig.6 S-75 chromatography of Fab fragment under different conditions注:a:緩沖液2;b:緩沖液3;c:緩沖液4;d:緩沖液5。

2.4.3 Fab片段在不同緩沖液下的凝膠過濾層析 結(jié)合Fab片段等電點(diǎn)及疏水性,改變流動(dòng)相不同離子強(qiáng)度與pH,不同條件下Fab片段在柱中保留行為如表1所示。為了排除最初使用的PBS緩沖液(緩沖液1)中緩沖液自身離子強(qiáng)度的干擾,使用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行離子強(qiáng)度與pH的研究。改變pH7.4的Tris-HCl緩沖液中的鹽濃度(緩沖液2、緩沖液3),結(jié)果顯示中性鹽濃度引起的離子強(qiáng)度改變不影響Fab片段的結(jié)合(圖6a、6b),表明pH7.4的條件下,即使離子強(qiáng)度非常低也無法解除Fab片段的吸附。pH增大至9.0,同時(shí)保持低離子強(qiáng)度不變(緩沖液4),Fab片段可以在48 mL時(shí)正常出峰(圖6c),而保持pH9.0,再次增加鹽濃度至100 mmol/L(緩沖液5),Fab片段重新與柱填料產(chǎn)生吸附(圖6d),表明同時(shí)升高pH和降低離子強(qiáng)度能夠解除Fab片段吸附。

3 討論

抗體酶解后產(chǎn)物成分較為復(fù)雜,現(xiàn)有純化方法較難實(shí)現(xiàn)Fab片段的一步分離。如唐思遠(yuǎn)[12]使用蛋白A純化人源IgG木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物,純化產(chǎn)物中除Fab片段外還含有其他酶解碎片,需要疊加離子交換進(jìn)行進(jìn)一步純化。多種純化手段的疊加使其分離操作繁瑣并影響產(chǎn)率。Nascimento等[17]使用蛋白A、蛋白L兩步純化酶解產(chǎn)物時(shí),經(jīng)第二步純化后的Fab片段與第一步相比有較大損失。本研究可以利用Fab片段與凝膠過濾層析填料S-75非特異性結(jié)合的特性一步純化獲得高純Fab片段。在之前的報(bào)道中,Fab片段在此填料中的保留體積為柱體積的40%～50%,如Quintero-Hern’ andez V等[18]使用S-75(10 mm×300 mm,柱體積30 mL)純化4種Fab片段,保留體積為14.8～15.9 mL;Liebscher等[19]純化Fab片段,在S-75(柱體積120 mL)中的保留體積約為60 mL。關(guān)于蛋白質(zhì)與凝膠過濾層析相互作用的報(bào)道多集中于蛋白提前或延遲出峰,通常影響凝膠過濾層析樣品理論出峰時(shí)間的因素主要有固定相和樣品之間的疏水作用、離子交換和離子排阻作用,如轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)在pH4.2時(shí)存在的離子交換作用和pH10低離子強(qiáng)度下存在的離子排阻作用使出峰時(shí)間推遲或提前[20]。而像本研究中的Fab片段與S-75介質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合導(dǎo)致無法流出的情況目前還未見報(bào)道。

二者結(jié)合可能與Fab片段本身獨(dú)特的性質(zhì)有關(guān),Fab片段在SDS溶液中孵育后的SDS-PAGE(圖5)證明SDS能夠使其形成的聚集物解聚。SDS參與破壞蛋白間疏水界面[16],提示此Fab片段表面疏水性較強(qiáng)。對于一些疏水性蛋白,緩沖液離子強(qiáng)度的增加會(huì)引起蛋白與凝膠過濾層析填料間的疏水作用[21-22]。低離子強(qiáng)度的緩沖液中水分子在蛋白質(zhì)疏水區(qū)域形成水化層,加入中性鹽提高離子強(qiáng)度時(shí)水化層中水分子被移去以溶劑化鹽離子,使蛋白表面疏水性增大[23]。本文在切換為超純水、離子強(qiáng)度為0的情況下消除了Fab片段與柱填料的吸附,推測該Fab片段的表面疏水性是與柱填料吸附的主要原因。

同時(shí),Superdex系列介質(zhì)表面存在少量負(fù)電荷[22],Fab片段的pI為6.03,在緩沖液pH大于pI時(shí),Fab表面同樣攜帶負(fù)電荷,與柱填料之間產(chǎn)生離子排阻作用,可以促進(jìn)其流出。而在pH7.4的流動(dòng)相中改變離子強(qiáng)度,Fab片段均被吸附,原因可能為此時(shí)離子排阻作用強(qiáng)度較弱,沒有超過疏水作用力。當(dāng)pH升高至9.0時(shí)蛋白表面負(fù)電荷增加,與填料間離子排阻作用增強(qiáng),在低離子強(qiáng)度下可以與疏水作用相抵消,Fab片段能夠隨緩沖液正常流出。pH9.0時(shí)增大離子強(qiáng)度使Fab片段與柱填料疏水作用增強(qiáng),大于離子排阻作用,導(dǎo)致Fab片段重新結(jié)合。

4 結(jié)論

通過凝膠過濾層析建立了酶解混合物中微囊藻毒素Fab片段的一步純化方法。所制備的Fab片段純度大于90%,對MC-LR抑制率達(dá)94%,Fab片段回收率為51%。在含有100 mmol/L NaCl和不含NaCl,pH7.4和pH9.0相互組合的四個(gè)20 mmol/L Tris緩沖液分別作為流動(dòng)相時(shí),只有pH9.0、不含NaCl的20 mmol/L Tris可以使Fab片段在48 mL正常流穿。結(jié)合Fab片段pI 6.03,易產(chǎn)生聚集且1% SDS溶液可以使其解聚的性質(zhì),初步分析是由于Fab片段具有較強(qiáng)的表面疏水性而與S-75填料產(chǎn)生疏水吸附,流動(dòng)相中低離子強(qiáng)度及遠(yuǎn)高于蛋白pI的pH可以影響疏水與離子排阻作用,從而使Fab片段消除吸附。Fab片段與S-75結(jié)合的現(xiàn)象及純化方法為疏水性Fab片段今后在凝膠過濾層析上實(shí)現(xiàn)新的純化模式提供參考。