曹影麗　劉琪　柴震震　楊侃侃　梁月巧　宋祥軍　邵穎　涂健　祁克宗

摘要： cGAS作為一種新型的胞質(zhì)DNA受體，在宿主抵抗DNA病毒而觸發(fā)的天然免疫中起著至關(guān)重要的作用。血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）是無囊膜的一種雙鏈DNA病毒，可引起雞肝炎-心包積液綜合征。為明確雞cGAS（chcGAS）基因功能，探究在雞肝癌（LMH）細(xì)胞中過表達(dá)chcGAS以及FAdV-4感染前后細(xì)胞定位的變化情況。本研究針對chcGAS序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分析該基因序列與其他物種之間的同源性以及預(yù)測該基因的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-chcGAS進(jìn)行原核表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定，利用激光共聚焦觀察FAdV-4感染LMH細(xì)胞前后chcGAS細(xì)胞定位變化。結(jié)果表明，本試驗(yàn)克隆得到大小為1 317 bp的 chcGAS基因，與其他物種同源性為50.5%～84.4%，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白質(zhì)的形式在上清液處表達(dá)，目的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為75 000，與預(yù)期大小相符。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4感染可導(dǎo)致定位于細(xì)胞核膜上的chcGAS蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究FAdV-4與cGAS-STING信號通路的關(guān)聯(lián)調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： cGAS；血清4型禽腺病毒（FAdV-4）；序列分析；原核表達(dá)；亞細(xì)胞定位

中圖分類號： S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0453-08

Cloning and expression characteristics of chicken cGAS gene and changes in subcellular localization before and after FAdV-4 infection

CAO Ying-li， LIU Qi， CHAI Zhen-zhen， YANG Kan-kan， LIANG Yue-qiao， SONG Xiang-jun， SHAO Ying， TU Jian， QI Ke-zong

（Anhui Key Laboratory of Veterinary Pathobiology and Disease Control/Anhui Province Animal Food Quality and Biosafety Engineering Laboratory， Hefei 230036， China）

Abstract： cGAS plays a key role in the hosts innate immune response against DNA viruses as a receptor for DNA recognition within the cytoplasm. Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV-4） is a double-stranded DNA virus without an envelope， and can cause hepatitis-pericardial effusion syndrome in chicken. In order to clarify the function of chicken cGAS （chcGAS） gene， the overexpression of chcGAS in chicken liver cancer （LMH） cells and the changes of cell location before and after FAdV-4 infection were investigated. In this study， the primers were designed according to the chcGAS sequence， and the chcGAS gene was amplified by PCR. The homology between the gene sequence and other species was analyzed， and the domain was predicted. The recombinant plasmid pET-32a-chcGAS was constructed for prokaryotic expression， identified by SDS-PAGE and Western blot， and the localization changes of chcGAS in LMH cells before and after FAdV-4 infection were observed by laser confocal microscopy. The results showed that the chcGAS gene with a size of 1 317 bp was successfully cloned， and the homology with other species was 50.5%-84.4%. The results of SDS-PAGE analysis indicated that chcGAS protein was mainly expressed in the supernatant in the form of soluble protein. The relative molecular mass of target protein was 75 000， which was consistent with the expected size. The results of subcellular localization showed that FAdV-4 infection could lead to transfer of chcGAS protein localized on the nuclear membrane into the cytoplasm. These results can provide a scientific basis for further studying the correlation regulatory mechanism between FAdV-4 and cGAS-STING signaling pathways.

Key words： cGAS;fowl adenovirus serotype 4（FAdV-4）;sequence analysis;prokaryotic expression;subcellular localization

當(dāng)外界的病原微生物或其產(chǎn)物進(jìn)入機(jī)體時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs）活化，進(jìn)而產(chǎn)生I型干擾素（IFN）和一些促炎細(xì)胞因子^[1-3]。在過去的幾年里，模式識(shí)別受體研究領(lǐng)域?qū)|(zhì)DNA感受器作為重要研究方向^[4-6]。PRRs是一類天然免疫分子，是天然免疫受體識(shí)別的重要組成部分^[7-8]。2013年Wu等^[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中存在某種物質(zhì)可以通過識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)的DNA激活I(lǐng)FN-β信號通路，質(zhì)譜檢測分析后發(fā)現(xiàn)是一種新的物質(zhì)，這種物質(zhì)為環(huán)磷酸鳥苷-腺苷（cGAMP），并且該物質(zhì)可以通過與干擾素刺激基因（STING）結(jié)合從而激活I(lǐng)FN信號通路。也有研究結(jié)果表明，cGAS可以作為一種廣譜胞質(zhì)DNA受體識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)DNA并激活I(lǐng)FN信號通路^[10]。常規(guī)情況下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在的DNA較少，故以cGAS為主的胞質(zhì)DNA感受器處于未活化的狀態(tài)。但當(dāng)細(xì)胞處于某些應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，比如DNA病毒感染，其胞質(zhì)內(nèi)的DNA含量上升，隨后可通過cGAS-STING通路發(fā)揮抗病毒作用。目前，普遍認(rèn)為cGAS定位于細(xì)胞質(zhì)中，而Barnett 等^[11]指出，cGAS并非傳統(tǒng)意義上的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，而是通過其N端磷酸肌醇結(jié)合域的作用從而出現(xiàn)膜定位的一種蛋白質(zhì)，并提到在靜息狀態(tài)下，cGAS定位在細(xì)胞膜，而識(shí)別DNA病毒感染后可出現(xiàn)由細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。

目前，關(guān)于鳥類中cGAS的研究也有報(bào)道。楊潔^[12]的研究結(jié)果表明，cGAS和STING信號軸對DNA病毒、RNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒均有抗病毒作用，證明其廣泛的抗病毒功能和在雞先天免疫中的關(guān)鍵作用。Oliveira 等^[13]的研究結(jié)果表明，在雞巨噬細(xì)胞中，cGAS/STING通路不但能產(chǎn)生I型干擾素以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)DNA刺激，而且對調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞效應(yīng)器功能[包括組織相容性復(fù)合體（MHC-II）和共刺激分子的表達(dá)]至關(guān)重要。在禽痘病毒（一種禽DNA病毒）感染的情況下，發(fā)現(xiàn)cGAS/STING途徑與I型干擾素的產(chǎn)生及MHC-II轉(zhuǎn)錄有關(guān)。禽腺病毒4型屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是無囊膜的雙鏈 DNA 病毒。血清4型禽腺病毒（FAdV-4）是肝炎-心包積液綜合征的主要病原體。作為一種DNA病毒，目前Wang等^[14]通過在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞cGAS基因（chcGAS）來研究其亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，chcGAS主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。通過過表達(dá)chcGAS基因和RNA干擾chcGAS基因，證明了chcGAS對外源性雙鏈DNA（dsDNA）以及來自DNA損傷反應(yīng)的自身dsDNA有反應(yīng)，從而激活了STING/TBK1/IRF7介導(dǎo)的先天免疫。目前，對于 chcGAS的研究著重在其作為胞質(zhì) DNA感受器觸發(fā)一系列通路方面的探索，但關(guān)于雞cGAS在體外的蛋白質(zhì)表達(dá)以及雞cGAS在DNA病毒感染后細(xì)胞內(nèi)定位、轉(zhuǎn)位的研究較少。cGAS對胞質(zhì)內(nèi)DNA的識(shí)別是非特異性的，幾乎可以識(shí)別所有的雙鏈DNA ^[15-16] 。

本研究擬通過克隆chcGAS的完整開放閱讀框序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得chcGAS蛋白，此外，通過對比chcGAS被FAdV-4感染前后細(xì)胞定位的變化更進(jìn)一步闡述chcGAS在觸發(fā)天然免疫激活中的作用，以期為進(jìn)一步研究FAdV-4與cGAS-STING信號通路的關(guān)聯(lián)調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和毒株

雞肝癌（LMH）細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所劉光清研究員贈(zèng)送。FAdV-4 AH-F19株 ^[17]（登錄號：MN781666）由本實(shí)驗(yàn)室分離并經(jīng)過鑒定后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 菌株和質(zhì)粒

感受態(tài)細(xì)胞DH5α、Rosseta（DE3）購于南京擎科生物科技有限公司。pET-32a、pCAGGS-HA、pmCherry-C1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存于-20 ℃冰箱。

1.3 主要試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、ECL發(fā)光顯色工作液、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，2×Hiff Canace? Gold PCR Master Mix購自上海翌圣生物科技有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司，PAGE蛋白凝膠快速配制試劑盒、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、雅酶三色預(yù)染Marker購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，EcoR I限制性內(nèi)切酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。同源重組連接酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，鼠抗HA單克隆抗體、鼠抗His單克隆抗體購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗羊抗鼠、山羊抗鼠IgG-HRP購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 序列分析與結(jié)構(gòu)域預(yù)測

從NCBI中下載已發(fā)表的一些物種的cGAS序列，通過Megalign軟件進(jìn)行同源性分析并利用MEGA5.0對各物種序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。用SMART在線網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測chcGAS的結(jié)構(gòu)域。

1.5 引物設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中發(fā)表的chcGAS基因序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增的上下游引物，引物合成序列見表1。按照RNA提取試劑盒說明書提取LMH細(xì)胞中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板擴(kuò)增chcGAS特異性引物。

1.6 重組質(zhì)粒chcGAS載體的構(gòu)建

根據(jù)chcGAS基因序列，利用CE DesignV1.04軟件依次設(shè)計(jì)pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS同源臂引物，引物合成序列見表1。

PCR反應(yīng)體系（50 μl）：2×Hiff Canace^?Gold PCR Master Mix 25 μl、ddH₂O 19 μl、 DNA模板2 μl、上下游引物各2 μl 。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。利用PCR擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的chcGAS基因，PCR產(chǎn)物分別切膠回收，將其克隆到經(jīng)EcoR I酶切的pET-32a、pCAGGS-HA、pmCherry-C1空載體中。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定正確后移交到測序公司進(jìn)行測序。重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定后分別命名為pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS。

1.7 pET-32a-chcGAS誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

將pET-32a-chcGAS與pET-32a空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布到氨芐抗性的固體培養(yǎng)板，次日分別挑取單菌落至溶菌肉湯（LB）液體培養(yǎng)基中。用搖床37 ℃、180 r/min搖4～5 h后轉(zhuǎn)接到大容積的LB液體培養(yǎng)基中，再次用搖床37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀值為0.6～0.8時(shí)，添加0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）于15 ℃、120 r/min誘導(dǎo)表達(dá)，取誘導(dǎo)20 h后的菌體，用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行洗菌，隨后超聲裂解至液體清亮，離心后分別吸取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，而后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后進(jìn)行觀察和分析。通過分析確定重組蛋白質(zhì)表達(dá)可溶性。

1.8 Western-blot檢測

將誘導(dǎo)后處理好的蛋白質(zhì)樣品，在 SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，恒流100 mA轉(zhuǎn)膜1.0 h。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入配制好的5%脫脂奶粉封閉液中，隨后移入4 ℃冰箱過夜封閉，用磷酸緩沖液（PBST）洗滌2～3次，按照1∶5 000（體積比）加入鼠抗His單克隆抗體作為一抗，常溫下孵育1.5 h，在用PBST洗滌2～3次，同樣按照1∶5 000（體積比）加入山羊抗鼠lgG-HRP作為二抗，常溫孵育1.0 h，用PBST洗滌2～3次，隨后用辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光劑（HRP-ECL）底物發(fā)光顯色工作液進(jìn)行顯色。

1.9 chcGAS感染前后亞細(xì)胞定位

為了觀察chcGAS在FAdV-4感染前后亞細(xì)胞定位變化，設(shè)置2組試驗(yàn)，分為感染組和對照組（未感染），分別將2組長滿的LMH細(xì)胞接種于鋪上細(xì)胞爬片的12孔板中，觀察細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右將pCAGGS-HA-chcGAS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，對照組24 h后棄培養(yǎng)液，換成新鮮的維持培養(yǎng)液，感染組在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后接種FAdV-4 AH-F19株，37 ℃培養(yǎng)1 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，感染8 h后分別收取感染組和對照組樣品，通過間接免疫熒光步驟，分別使用HA標(biāo)簽鼠抗多克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC綠色熒光抗體作為二抗，而后利用激光共聚焦觀察分析chcGAS在LMH細(xì)胞中的定位情況。

為了進(jìn)一步證實(shí)chcGAS的定位，同樣將pmCherry-C1-chcGAS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到LMH細(xì)胞，以相同的方法對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行收樣，利用pmCherry-C1載體自帶紅色熒光在激光共聚焦顯微鏡下觀察chcGAS定位情況，觀察是否與pCAGGS-HA-chcGAS重組質(zhì)粒定位情況一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析與結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過Megalign比對分析物種間cGAS核苷酸同源性，結(jié)果顯示，chcGAS與其他物種cGAS的同源性為50.5%～84.4%（圖1）。將chcGAS與其他物種cGAS核苷酸序列比對并對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，chcGAS與鴨子cGAS位于同一分支上，親緣關(guān)系較近；但與魚類cGAS和哺乳類cGAS不在同一分支上，表明親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)（圖2）。利用SMART在線網(wǎng)站預(yù)測chcGAS的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，編碼區(qū)包括2個(gè)低復(fù)雜區(qū)域（Low-Complexity region， LCR），分別為第3至第39氨基酸與第68至第81氨基酸，還包括1個(gè)高度保守的 Mab-21結(jié)構(gòu)域 （第129至第429氨基酸）（圖3）。

2.2 chcGAS基因擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增chcGAS基因得到目的條帶（圖4），目的片段大小為約1 317 bp，顯示與預(yù)期條帶大小一致，經(jīng)測序比對后與目的基因序列完全一致。

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切鑒定后在核酸凝膠電泳上顯示的條帶大小與預(yù)期的載體大小和目的基因大小一致（圖5），并且經(jīng)測序比對分析后與目的基因序列完全一致，堿基未見缺失或者突變，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 pET-32a-chcGAS表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將pET-32a-chcGAS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中后，成功表達(dá)出相對分子質(zhì)量為75 000的目的蛋白質(zhì)（圖6），分析結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)在包涵體和上清液都有表達(dá)且主要集中在上清液表達(dá)。

2.5 重組蛋白質(zhì)的Western-blot鑒定

利用Western-blot對蛋白質(zhì)進(jìn)一步鑒定分析，結(jié)果（圖7）顯示，在PVDF膜上有一條明顯條帶且位置大小與預(yù)期目的蛋白質(zhì)大小一致。說明重組蛋白質(zhì)可以被抗His標(biāo)簽的一抗識(shí)別。

2.6 chcGAS感染前后亞細(xì)胞定位分析

通過在LMH細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-chcGAS和pmCherry-Cl-chcGAS來研究chcGAS的細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，未感染FAdV-4時(shí)chcGAS主要分布在細(xì)胞核的核膜上，感染FAdV-4后，可以觀察到chcGAS從細(xì)胞核的核膜向細(xì)胞質(zhì)里轉(zhuǎn)移（圖8、圖9）。

3 討論

cGAS作為近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種新型胞質(zhì)DNA受體，其功能為識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)的DNA。然而雞cGAS基因的相關(guān)研究較少，通過Megalign比對分析物種間cGAS核苷酸同源性，結(jié)果顯示，chcGAS與其他物種cGAS的同源性為50.5%～84.4%，且具有2個(gè)在第3至第39氨基酸和第68至第81氨基酸的低復(fù)雜區(qū)域和1個(gè)高度保守的具有第129至第429氨基酸的Mab-21結(jié)構(gòu)域，表明chcGAS與其他物種具有差異。本研究對chcGAS基因進(jìn)行了克隆。首先，通過構(gòu)建pET-32a-chcGAS原核表達(dá)載體，其次，經(jīng)過多種對比分析后從大腸桿菌表達(dá)菌株中挑選了Rosetta（DE3）表達(dá)菌株，最后以15 ℃、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 0.5 mmol/L、誘導(dǎo)20 h為最適誘導(dǎo)條件，成功表達(dá)了chcGAS蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組蛋白質(zhì)chcGAS主要以可溶性蛋白質(zhì)的形式在上清液處表達(dá)，利用His標(biāo)簽抗體經(jīng)Western-blot鑒定，在PVDF膜上顯示有單一的條帶且與預(yù)期目的蛋白質(zhì)條帶大小相符。

在正常情況下DNA只存在于細(xì)胞核和線粒體中，但在病毒感染后會(huì)游離在細(xì)胞質(zhì)中，隨后被位于細(xì)胞質(zhì)中的cGAS識(shí)別，繼而激活cGAS-STING通路發(fā)揮抗病毒作用^[10]。目前為止報(bào)道人和小鼠cGAS調(diào)控較多^[18]，以往的研究中，普遍認(rèn)為人cGAS僅僅分布在細(xì)胞質(zhì)中^[19]，并行使DNA識(shí)別受體的功能^[20-21]。但近期有試驗(yàn)結(jié)果表明，人cGAS定位在細(xì)胞膜上，并指出有外源DNA感染細(xì)胞時(shí)cGAS發(fā)生移位即可從細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中從而識(shí)別一些DNA而后激活天然免疫。雞cGAS還沒有得到足夠的研究，尤其雞cGAS的細(xì)胞定位、功能及精確調(diào)控機(jī)制還未完全研究清楚。先前Wang等^[14]通過在雞胚成纖維細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)記的cGAS來研究雞cGAS的亞細(xì)胞定位，定位分析結(jié)果表明，chcGAS分布在細(xì)胞質(zhì)中。本研究使用pCAGGS-HA-chcGAS和pmCherry-C1-chcGAS 2個(gè)重組質(zhì)粒在LMH細(xì)胞中對chcGAS進(jìn)行定位，結(jié)果顯示，chcGAS是定位在細(xì)胞核的核膜上，此外還通過FAdV-4感染chcGAS對細(xì)胞定位進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，在FAdV-4感染后chcGAS定位可從細(xì)胞核的核膜上轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，后續(xù)將通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)chcGAS的LMH細(xì)胞系對這一結(jié)果進(jìn)行更加深入地研究驗(yàn)證。通過chcGAS定位了解其在天然免疫中發(fā)揮的作用，同時(shí)也為后續(xù)研究chcGAS的功能提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）