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黃體酮對雄性大鼠腦出血后的神經(jīng)保護作用機制

2019-11-29 02:55:10左清嬌鄭曉梅周子薇
醫(yī)學研究生學報 2019年11期
關鍵詞:黃體酮腦水腫腦組織

左清嬌,鄭曉梅,涂 婷,先 耀,周子薇

0 引 言

卒中已經(jīng)成為中國人第一死因[1],出血性腦卒中病死率高、治愈率低,易遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙而影響患者的身心健康。腦出血的損傷機制主要有:血腫的直接占位效應、腦出血后繼發(fā)腦水腫、炎癥反應和細胞凋亡等[2-3]。如何有效降低腦出血后腦水腫和抑制炎性反應,已經(jīng)越來越受到重視。既往研究發(fā)現(xiàn)黃體酮對腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血等腦損傷有神經(jīng)保護作用,能減輕血腦屏障破壞和腦水腫、抗炎、抗神經(jīng)元凋亡等[4-5]。但黃體酮對腦出血是否有神經(jīng)保護作用的研究國內(nèi)外較少,現(xiàn)對腦出血大鼠模型予以黃體酮干預,觀察其對腦出血后腦組織含水量、神經(jīng)功能評分及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和核轉錄因子κB(nuclear factor-κB ,NF-κB)表達水平的影響,探討其對腦出血大鼠是否有神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑選取174只成年雄性SD大鼠,體重約(250±20)g,購自成都達碩實驗動物有限公司,試驗動物合格證號:scxk(川)2015-030,標準條件下飼養(yǎng):溫度20~28 ℃,12 h 光照周期,標準飼料喂養(yǎng)和自由飲水。黃體酮(美國Sigma公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),MMP-9和NF-κB 抗體(英國abcam 公司),MMP-9 抗體和GAPDH抗體(英國abcam公司),NF-κB抗體(美國CST公司),HRP標記山羊抗兔抗體(美國ASPEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦出血造模6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,俯臥位固定大鼠于腦立體定位儀上(深圳瑞沃德生命科技有限公司),暴露前囟,矢狀縫右側旁3 mm,前囟后0.2 mm,深6 mm 處為右側尾狀核部位,顱骨鉆孔,斷尾取血,采用“改良二次注血法”注血,第1 次注血20 μL 勻速注入,留針7 min,第2次注血30 μL 勻速注入,留針10 min,退針,縫合、消毒,假手術組操作方法相同,但不注血。采用Longa5 級評分法進行神經(jīng)功能評分,1~3 分視為造模成功[6]。

1.2.2 分組與給藥174 只成年雄性SD 大鼠隨機數(shù)字表法分為6組:假手術組,模型組,溶劑組,黃體酮低、中、高劑量組,每組29 只。將黃體酮粉末溶于22.5%羥丙基-β-環(huán)糊精溶劑中。黃體酮治療組于腦出血后2、6 h腹腔注射黃體酮溶液(4、8、16 mg/kg),劑量選擇參考文獻[7]的實驗方法,之后每日1次皮下注射;溶劑組給予等體積的HBC,假手術組和腦出血組給予等體積等滲鹽水。

1.2.3 神經(jīng)功能評分給藥后1、3、7 d 對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分,參照改良Garcia 評分方法,評估神經(jīng)功能損傷及恢復情況。分數(shù)越高表示損傷越輕,分數(shù)越低表示損傷越重[8]。

1.2.4 腦組織含水量(water content brain,BWC)測定深度麻醉大鼠,斷頭取腦,稱量濕重,烘烤箱內(nèi)烘烤,稱量其干重,采用干濕重法計算腦組織含水量[9],公式如下:

含水量=(濕重-干重)/濕重×100%

1.2.5 免疫組化檢測MMP-9 和NF-κB 的表達步驟簡述如下:①烘片脫蠟至水,PBS 沖洗,切片于EDTA 緩沖液中微波加熱行抗原修復,PBS 沖洗;②于3%過氧化氫溶液中10 min 將內(nèi)源性過氧化物酶滅活,③PBS 漂洗,5%BSA 封閉20 min,加一抗覆蓋組織,4 ℃過夜,PBS 漂洗,加二抗37 ℃孵育50 min,PBS 漂洗;④用DAB 溶液在顯微鏡下控制顯色;⑤沖洗、復染、梯度乙醇脫水、透明、封固。應用Image ProPlus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件測量MMP-9 和NF-κB的累積光密度值(IOD),對MMP-9 和NF-κB 蛋白的表達進行半定量分析。

1.2.6 Western blot 檢測腦組織MMP-9和NF-κB蛋白的表達步驟簡述如下:①造模后3d 處死大鼠,取腦組織于-80 ℃冰箱保存;②提取蛋白,BCA法檢測蛋白濃度;③SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉,除去封閉液,加入一抗和GAPDH 4 ℃孵育過夜,用TBST 洗3 次,加入二抗(HRP 標記的山羊抗兔),室溫孵育30 min,用TBST 在室溫下?lián)u床上洗4 次;④滴加增強型發(fā)光試劑(ECL),曝光、顯影、定影;⑤膠片存檔,使用AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng),GAPDH作為內(nèi)參,目的條帶的灰度值/GAPDH 條帶的灰度值分析蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS23 軟件進行統(tǒng)計分析,定量資料以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 檢驗,以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能評分比較與假手術組比較,其余各組各時間點神經(jīng)功能評分降低(P <0.01)。模型組和溶劑組神經(jīng)功能障礙差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組、溶劑組比較,黃體酮低、中、高劑量組各時間點神經(jīng)功能評分增高,以中劑量組最明顯(P <0.05),見圖1。

2.2 腦組織含水量比較與假手術組相比,其余各組各時間點大鼠腦組織含水量明顯增加(P <0.01)。模型組和溶劑組腦組織含水量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。黃體酮低、中、高劑量組各個時間點腦組織含水量較模型組和溶劑組降低(P <0.01),中劑量組最明顯(P <0.05),見表1。

2.3 各組大鼠腦組織MMP-9、NF-κB 蛋白表達測定結果與假手術組相比,其余各組MMP-9、NF-κB蛋白表達明顯增加(P <0.01)。模型組和溶劑組腦組織MMP-9、NF-κB 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。黃體酮低、中、高劑量組MMP-9、NF-κB蛋白表達較模型組和溶劑組降低(P <0.01),黃體酮中劑量組最明顯(P <0.05)。見表2。模型組和溶劑組見大量MMP-9陽性細胞表達,細胞質(zhì)棕黃色深染,NF-κB陽性細胞棕黃色,主要分布在細胞核,黃體酮各組MMP-9、NF-κB 陽性細胞表達較模型組和溶劑組少,免疫組化檢測結果見圖2、圖3。Western blot顯示與假手術組比較,其余各組MMP-9、NF-κB蛋白表達增高(P <0.01);黃體酮低、中、高劑量組MMP-9、NF-κB蛋白表達較模型組和溶劑組降低(P <0.01)。見表3,圖1。

圖1 各組大鼠各時間點神經(jīng)功能缺損評分Figure 1 Neurological severity scores of different groups of rats at different days

表1 各組不同時間大鼠腦組織含水量的比較(xˉ±s,%)Table 1 Comparison of brain water content in rats at different time points(xˉ±s,%)

表2 免疫組化測定各組大鼠腦組織不同時間點MMP-9、NF-κB蛋白表達的變化(xˉ±s)Table 2 Expression of the MMP-9,NF-κB protein in the brain tissue of different groups of rats at different time points by immunohistochemistry(xˉ±s)

圖2 鏡下觀察各組大鼠腦組織中MMP-9表達情況(免疫組化染色×400)Figure 2 1d The expression of MMP-9 in brain tissue of each group(IHC×400)

圖3 各組大鼠腦組織中NF-κB表達情況(免疫組化染色×400)Figure 3 The expression of NF-κB in brain tissue of each group(IHC×400)

表3 Western blot 法測定各組大鼠腦組織內(nèi)MMP-9、NFκB蛋白表達水平(xˉ±s)Table 3 Expression of MMP-9, NF-κB in the brain tissue by western blot assay(xˉ±s)

圖4 Western blot 檢測各組大鼠腦組織內(nèi)MMP-9、NF-κB蛋白表達Figure 4 The expression of MMP-9 、NF-κB in brain tissue of each group bywestern blot assay

3 討 論

目前腦出血后的腦損傷機制尚不明確,大量研究表明腦出血后腦水腫和炎性反應在繼發(fā)性腦損傷中起著重要作用。血腦屏障的完整性對于維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是必不可少的,MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶重要成員,大量研究表明MMP-9 通過參與緊密連接蛋白和微血管基底膜蛋白的降解破壞血腦屏障,導致腦水腫[10]。應用MMP-9 抑制劑可保護血腦屏障、減輕腦水腫[11],減輕腦出血后腦水腫有利于神經(jīng)功能恢復[9]。同時MMP-9 也是炎性介質(zhì)之一,NF-κB 是一種能夠調(diào)控多個炎性相關基因轉錄表達的重要轉錄調(diào)節(jié)因子,有研究表明MMP-9 啟動子區(qū)域存在NF-κB 轉錄因子結合位點,可通過NFκB 信號通路調(diào)節(jié)MMP-9 表達,抑制NF-κB 活性可降低MMP-9 的表達,抑制炎癥反應[12-13]。腦血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等均可表達NF-κB,腦出血后NF-κB活化,上調(diào)多種炎性因子表達[14]。而這些炎癥因子又是NF-κB 的激活劑,反過來增強NF-κB 轉錄,導致持續(xù)和增大炎癥反應[15]。NF-κB 可能是腦出血后炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)。

黃體酮是一種安全性好、不良反應少,可透過血腦屏障的神經(jīng)甾體[16]。大量研究表明黃體酮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著重要作用,在蛛網(wǎng)膜下腔出血中,黃體酮可抑制凋亡,減少氧化應激,減輕急性腦損傷[5],在腦梗死中,黃體酮可減少炎癥反應和神經(jīng)細胞凋亡,促進血管新生,改善大鼠神經(jīng)功能[17]。有研究發(fā)現(xiàn)黃體酮能通過降低血管內(nèi)皮生長因子和MMP-9 表達,保護血腦屏障和減輕腦水腫,延長缺血性卒中組織型纖溶酶原激活劑給藥的時間窗口并減少出血性轉化[18]。有研究發(fā)現(xiàn),黃體酮能降低中年雄性小鼠腦出血后病變體積,改善腦水腫,減輕炎癥反應,改善神經(jīng)功能損傷[19]。黃體酮對雄性大鼠腦出血是否有治療作用,目前國內(nèi)外研究較少。

本實驗通過建立大鼠腦出血模型探討黃體酮是否對大鼠腦出血后有神經(jīng)保護作用以及其機制,結果顯示:模型組大鼠MMP-9、NF-κB蛋白的表達較假手術組明顯升高,腦組織含水量升高,腦出血后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損,黃體酮低、中、高劑量組MMP-9、NF-κB 蛋白表達較模型組明顯下降,腦組織含水量也降低,神經(jīng)功能缺損有所改善。黃體酮可能通過降低MMP-9 表達,減輕血腦屏障的破壞,減輕腦水腫,下調(diào)炎癥相關蛋白NF-κB 表達,可能抑制其介導的炎性反應,減輕繼發(fā)性腦損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

黃體酮可能是一種有效的神經(jīng)保護劑,但需進一步了解黃體酮在治療腦出血方面作用機制,才能提高其轉化為一種治療腦出血藥物的可能性。

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