劉紹雄，劉春麗，尚陸娥，李建英，王明月，吳廣彪，羅孝坤

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南昆明650221；3.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心，云南 昆明 650021；4.施甸康宏農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，云南 保山 678000）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]，又名木耳、光木耳、黑菜[2-3]，是我國(guó)重要的食用菌栽培品種。黑木耳肉質(zhì)脆嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及鈣、磷、鐵等人體所需的礦質(zhì)元素[4]，被稱為“素中之葷”[2]。同時(shí)黑木耳還富含木耳多糖、黑色素、腺苷類物質(zhì)和甾醇等藥用成分，具有潤(rùn)肺清腸、降血糖、降血脂、抗血栓、抗輻射、抗氧化、抗腫瘤等多種功效[4-5]，享有“黑色瑰寶”的美譽(yù)，深受廣大消費(fèi)者的青睞，市場(chǎng)前景廣闊。

黑木耳在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛栽培，尤其以東北地區(qū)為主產(chǎn)區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)黑木耳產(chǎn)量達(dá)751.85萬噸，是全國(guó)栽培產(chǎn)量第二大的食用菌品種，東北黑龍江和吉林兩省黑木耳產(chǎn)量約占全國(guó)黑木耳總產(chǎn)量的60%以上[6]。云南地處低緯高原，獨(dú)特的氣候條件促使云南黑木耳栽培優(yōu)勢(shì)明顯。云南黑木耳栽培出耳時(shí)間多集中于10月至次年4月，在冬季相對(duì)較低的溫度和全日光條件下出耳，黑木耳品質(zhì)突出，云南生產(chǎn)的高品質(zhì)黑木耳，即云耳，享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。但云南黑木耳栽培規(guī)范化程度不高，栽培技術(shù)參差不齊，在排場(chǎng)出耳管理階段病害尤為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響栽培產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。本文中，通過對(duì)云南黑木耳排場(chǎng)出耳管理階段病害嚴(yán)重的保山地區(qū)基地，開展常見病害調(diào)查及病原菌分離鑒定研究，分析病害發(fā)生原因及病原鑒定，以期能為云南黑木耳栽培管理及病害防治提供理論依據(jù)，為篩選抗病性強(qiáng)的優(yōu)良菌株提供供試菌株材料。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況及樣品采集

1.1.1 采樣點(diǎn)概況

以云南黑木耳排場(chǎng)出耳管理階段病害嚴(yán)重的保山地區(qū)基地西邑 （E：99°29′41″，N：24°9′17 ″，海拔 1 656 m）、芒寬 （E：98°8′8″，N：25°53′9 ″，海拔738 m），作為病害調(diào)查和病原菌采集樣點(diǎn)。

1.1.2 樣品采集

采樣時(shí)間為2018年1月～3月，采集黑木耳染病的菌棒基質(zhì)和耳片。共采集病害樣品9份，對(duì)采集的樣品進(jìn)行編號(hào)，放入冰盒中保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。同時(shí)詳細(xì)記錄采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、發(fā)病時(shí)間、病害癥狀特點(diǎn)等。

1.2 病原菌分離、純化與鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15 g～20 g，蒸餾水 1 000 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀 1.0 g、硫酸鎂 0.5 g、氯霉素 0.1 g、瓊脂15 g～20 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 菌種分離與純化

1）細(xì)菌性病原菌的分離、純化

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。在超凈無菌工作臺(tái)內(nèi)，用接種針在爛耳耳片上輕輕蘸一下，在培養(yǎng)基平板上劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h～24 h后蘸取單菌落于平板上進(jìn)行純化后，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2）真菌性病原菌的分離、純化

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基。在超凈無菌工作臺(tái)內(nèi)，從染病的菌棒基質(zhì)上直接挑取一小塊置于培養(yǎng)基平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d～5 d挑取病原菌邊緣菌落至平板上進(jìn)行純化后，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株鑒定

細(xì)菌采用16S rDNA序列分析[7]，真菌采用rDNA ITS序列分析[8-9]，樣品送昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序，用DNAMAN進(jìn)行序列拼接，從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株序列，并用BioEdit進(jìn)行序列對(duì)齊，最后用MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，以確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳常見病害調(diào)查結(jié)果

病害侵染情況見圖1。黑木耳常見病害調(diào)查結(jié)果見表1。

圖1 黑木耳病害癥狀Fig.1 Symptoms of Auricularia heimuer disease

表1 病害調(diào)查結(jié)果Tab.1 Investigation results of Auricularia heimuerdiseases

由表1可知，共采集黑木耳病害樣本9份，其中芒寬6份、西邑3份。芒寬發(fā)生病害更為嚴(yán)重。從發(fā)病發(fā)生階段來看，主要集中在刺孔催芽和排場(chǎng)出耳階段。

由圖1可以看出，病害癥狀主要是耳片爛耳和菌棒感染。爛耳耳片變軟，有膠質(zhì)流出，逐漸腐爛，有臭味。菌棒感染表面產(chǎn)生霉層，侵染部分呈現(xiàn)綠色、紅色或白色菌皮，菌棒腐爛變軟或形成厚厚菌皮層，導(dǎo)致菌棒出耳較少或不出耳。從發(fā)病規(guī)律來看，主要發(fā)生在刺孔后、下地排場(chǎng)后或采收第一潮耳后，氣溫升高、濕度增大，起初菌棒無明顯現(xiàn)象，菌棒逐漸變軟，表面開始被感染，然后迅速蔓延至整個(gè)菌棒。

根據(jù)病害癥狀及發(fā)生規(guī)律分析病害發(fā)生原因：黑木耳出耳后，溫度過高，噴水過多或下雨濕度過大，耳片變軟，易被細(xì)菌性病原菌侵染，耳片逐漸腐爛，變臭；菌絲刺孔后菌絲新陳代謝加快，菌絲呼吸作用加強(qiáng)，菌棒內(nèi)料溫升高，當(dāng)環(huán)境溫度較高時(shí)，菌絲催芽期間會(huì)出現(xiàn)高溫?zé)?，造成菌絲抗病能力下降；環(huán)境中的致病性強(qiáng)的病原菌會(huì)從接種孔，催芽孔進(jìn)入侵染菌棒；此外，當(dāng)排場(chǎng)下地時(shí)，黑木耳菌棒在露天條件下出耳，氣溫較高，菌棒內(nèi)溫度升高，造成菌絲高溫?zé)瑢?dǎo)致菌絲抗病能力下降或造成菌絲死亡，高溫高濕條件下，菌棒表面或菌棒底部水分過高，競(jìng)爭(zhēng)性真菌病害侵染培養(yǎng)料，然后迅速蔓延侵染整個(gè)菌棒。

2.2 黑木耳病原菌分離

從每個(gè)染病黑木耳耳片或菌棒中各分離出1個(gè)病原菌，編號(hào)為AHD-01～AHD-09。分離情況詳見表2、圖2、圖3。

圖2 病原細(xì)菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of pathogenic bacteria

圖3 病原真菌菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of pathogenic fungi

表2 黑木耳病原菌分離情況Tab.2 Isolation of pathogenic bacteria from Auricularia heimuer

由表2、圖2、圖3可知，從西邑、芒寬2個(gè)采集地點(diǎn)采集的9個(gè)病害樣品中分離到9株病原菌菌株，黑木耳耳片爛耳病害分離得到病原細(xì)菌菌株AHD-01，從菌落形態(tài)特征來看初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus） 細(xì)菌[10]。黑木耳菌棒感染、爛棒病害分離得到8株病原真菌。其中菌株AHD-02、AHD-03、AHD-06從菌落形態(tài)特征來看初步鑒定為木霉屬（Trichoderma） 真菌[11]，菌株AHD-04、AHD-08初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌[12-14]。結(jié)合AHD-05菌株菌落形態(tài)特征和圖1-5子實(shí)體形態(tài)，初步鑒定為蠟孔菌屬（Ceriporia） 真菌[15]。AHD-07初步鑒定為節(jié)叢孢菌屬 （Arthrobotrys） 真菌[16]。AHD-09初步鑒定為耙齒菌屬（Irpex） 真菌[17]。

2.3 基于rDNA序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將病原菌菌株AHD-01的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行序列Blast分析，獲取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，詳見圖4。

由圖4可知，菌株AHD-01與東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis） 聚為一類，通過DNAMAN進(jìn)行同源性對(duì)比對(duì)，該菌株與菌株Bacillus toyonensis（MG574860.1） 同源性達(dá) 99.51%，因此將該病原菌菌株AHD-01鑒定為東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。

將 AHD-02、 AHD-03、 AHD-04、 AHD-05、AHD-06、AHD-07、AHD-08、AHD-09八個(gè)病原菌菌株的ITS序列在GenBank中進(jìn)行序列Blast分析，獲取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，詳見圖5。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果見下表3。

表3 基于ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖5和表3可知，AHD-02和AHD-03為側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。AHD-04為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。AHD-05為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）。AHD-06為長(zhǎng)枝木霉（Trichodermacf.longibrachiatum）。AHD-07為圓錐節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys conoides）。AHD-08為亞粘團(tuán)鐮孢菌（Fusarium subglutinans）。AHD-09為白囊耙齒菌 (Irpex lacteus）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

云南黑木耳排場(chǎng)出耳管理階段常見病害癥狀主要是耳片爛耳和菌棒感染，主要發(fā)生在刺孔后、下地排場(chǎng)后或采收第一潮耳后。氣溫升高、濕度增大，起初菌棒無明顯現(xiàn)象，后菌棒變軟，表面逐漸被感染，迅速蔓延至整個(gè)菌棒。病害發(fā)生原因?yàn)榫舸炭缀缶z呼吸作用加強(qiáng)或露天出耳，溫度較高，菌棒內(nèi)料溫升高，造成高溫?zé)咕z抗病能力下降或造成菌絲死亡，競(jìng)爭(zhēng)性真菌迅速蔓延侵染整個(gè)菌棒；露天出耳時(shí)，溫度過高，噴水過多或雨天濕度過大，耳片變軟，易被細(xì)菌性病原菌侵染導(dǎo)致爛耳。

通過對(duì)分離的病原菌進(jìn)行rDNA序列分析表明，導(dǎo)致黑木耳爛耳的病原菌AHD-01為東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。導(dǎo)致菌棒感染的病原菌AHD-02和AHD-03為側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola），AHD-04為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），AHD-05為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata），AHD-06為長(zhǎng)枝木霉 （Trichodermacf.longibrachiatum），AHD-07為圓錐節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys conoides），AHD-08為亞粘團(tuán)鐮孢菌（Fusarium subglutinans），AHD-09為白囊耙齒菌 (Irpex lacteus）。

3.2 討論

閆寶松等[18]研究表明，高溫、高濕通風(fēng)不良造成的細(xì)菌感染是導(dǎo)致爛耳的主要原因之一，本研究中發(fā)現(xiàn)高溫、高濕引起黑木耳爛耳的病原菌為東洋芽孢桿菌 （Bacillus toyonensis）。顏一紅[19]、劉正慧[20]、曹現(xiàn)濤[21]、崔紅麗[22]等研究表明，木霉屬的側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），節(jié)從孢屬（Arthrobotrys）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum） 是食用菌中主要病原真菌，在食用菌生產(chǎn)中易侵染菌棒導(dǎo)致爛棒，在香菇、木耳、平菇、杏鮑菇等食用菌栽培中極易發(fā)生，這與本研究中的結(jié)果一致。

本研究中，發(fā)現(xiàn)黑木耳菌棒受到撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）、白囊耙齒菌 （Irpex lacteus） 侵染后形成厚厚菌皮，這2種病原菌均為大型真菌，多生長(zhǎng)于闊葉樹倒木、枯立木、枯枝上。本研究中黑木耳栽培樣地周圍均是森林，可能是黑木耳高溫?zé)缶z生長(zhǎng)較弱或死亡，四周環(huán)境中的病原菌孢子侵染菌棒造成病害。前人研究表明，撕裂蠟孔菌能分泌藥物成分，可用于預(yù)防和治療貧血、糖尿病、胃病、癌癥和心臟病等疾病，還能用于生物造紙、農(nóng)藥降解、廢水處理等，開發(fā)潛力巨大[23-28]。白囊耙齒菌制成的藥物制劑能明顯抑制慢性腎炎病人的紅細(xì)胞及尿蛋白，是一種極具有市場(chǎng)開發(fā)潛力的抗腎炎藥物。因此，本研究中分離獲得的撕裂蠟孔菌、白囊耙齒菌菌株可為后期菌種開發(fā)利用提供種質(zhì)資源。