陳茂婷1 書劍琴1 李文敏1 胡琪琪1 王光志1 歐 洪2

1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，四川 成都 611137

毛茛科烏頭屬植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx．)為常用藥用植物，其干燥子根附子具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效，母根川烏具有祛風除濕、溫經(jīng)止痛等功效，均為著名川產(chǎn)道地藥材[1]。主產(chǎn)區(qū)為四川江油、布拖。其中江油市作為烏頭的道地產(chǎn)區(qū)，已有一千多年的栽培歷史。隨著川烏、附子的需求量日益增大，烏頭的種植規(guī)模也逐漸增大，但在栽培過程中，發(fā)現(xiàn)多種植物病害。其中，對附子藥材產(chǎn)量影響較大的有霜霉病、根腐病和白絹病，這幾種病害常常相互交叉影響，嚴重時可引起50%以上的減產(chǎn)[2]。

霜霉病是一種發(fā)病率較高的葉類病害，具有發(fā)病時間早、傳播速度快、防治困難等特點。在經(jīng)濟作物和農(nóng)作物中有較深入的研究[3-4]，并且研制出了防治效果較好的生防試劑[5-6]，但在藥用植物中的研究較少。烏頭霜霉病病原菌是余永年在1979年發(fā)現(xiàn)的一種新的病原菌[7]，病原物主要是鞭毛菌亞綱卵菌目霜霉科霜霉屬烏頭霜霉PeronosporaaconiteYu. 。本課題組在前期的工作中，基于顯微結構、超微結構和分子生物學技術，對烏頭霜霉病的病原物進一步進行了準確鑒定，并建立了該病原物的快速檢測技術[8-9]。但目前缺乏關于烏頭霜霉病病原菌的繁殖方式及傳播機制的研究，防治問題依然困難。

病害防治是植物栽培過程中很重要的環(huán)節(jié)，及時有效地防止病害發(fā)生能提高藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了找到適當?shù)姆椒ㄗ韪舨≡姆敝?，減少病原菌的傳播，本實驗通過調(diào)查不同種源地烏頭幼苗的患病情況，采用光學顯微觀察烏頭不同部位的石蠟切片，掃描電子顯微觀察烏頭病葉，對烏頭霜霉病病原菌的繁殖方式和傳播機制進行了初步探究。

1 材料

1.1 植物來源 于2015年11月從北川縣小壩鄉(xiāng)(104°10′33.70″E，32°00′18.13″N，海拔1413m)、青川縣房石鎮(zhèn)(104°57′20.11″E，32°21′50.52″N，海拔1133 m)、青川縣大壩鄉(xiāng)(105°09′24.16″E，32°30′10.52″N，海拔906 m)安縣茶坪鄉(xiāng)(104°15′29.04″E，31°42′49.94″N，海拔1041 m)采集烏頭種苗，隨機選擇各地部分種根浸泡于F.A.A固定液中，將其余種根種植于實驗田里，每種源地幼苗各栽培40株。2016年2月底，待實驗田里烏頭出苗后，觀察并采集烏頭霜霉病病株。從四川省江油市普照村優(yōu)質(zhì)無公害附子GAP生產(chǎn)基地(104°41′27.24″E，31°43′47.00″N，海拔512 m)，采用“隨機采樣法”[10]，每個點采集3份不同發(fā)病程度的烏頭霜霉病病株。置采樣箱中保濕，并及時帶回實驗室備用。同時，在周圍5 m范圍內(nèi)無霜霉病株地點采集健康烏頭植株。

1.2 試劑 拿大樹膠(BDH Chemicals Ltd.)；番紅(上?；瘜W試劑有限公司)；固綠(上海標本模型廠)；石蠟(成都雅榮生化設備部)；麝香草酚(成都化學試劑廠)；無水乙醇、二甲苯、甲醛、冰醋酸和丙三醇均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.3 儀器 DM2000型光學顯微鏡、DFC-495科研數(shù)碼攝像頭(德國LEICA公司)；JSM-6390LV電子掃描電鏡(日本電子株式會社)；PCD-E3000恒溫鼓風干燥箱(上?，樮帉嶒炘O備有限公司)；HM335E型切片機；AP280-123型包埋機(德國MICROM公司)。

2 方法

2.1 不同種源地烏頭霜霉病發(fā)病情況 在實驗田里，采取高壟種植，劃分4塊樣地，每塊樣地種植不同種源地烏頭種苗。待幼苗出土后，觀察并記錄霜霉病發(fā)病情況。

2.2 烏頭患病組織石蠟切片顯微觀察 將2015年浸泡的種根、感染霜霉病的葉、莖進行石蠟切片，置于光學顯微鏡下觀察不同組織中病原菌的形態(tài)特征，并拍照。

① 固定：將患病組織修剪成合適大小塊狀(0.5 cm×0.5 cm)，放入FAA固定液中固定 48 h。

② 脫水：將固定后的材料用蒸餾水沖洗，然后依次轉移至濃度為50%、75%、85%、95%的乙醇溶液中分別脫水1 h，最后轉移至無水乙醇脫水1 h。

③ 透明：將材料依次轉移至25%二甲苯+75%無水乙醇溶液、50%二甲苯+50%無水乙醇溶液、75%二甲苯+25%無水乙醇溶液、純二甲苯中各透明30 min。最后再轉移至純二甲苯透明15 min。

④ 浸蠟：將材料依次轉移至提前加熱熔融的75%二甲苯+25%石蠟、50%二甲苯+50%石蠟、25%二甲苯+75%石蠟中各2 h，最后轉移至純蠟在63 ℃烘箱中保溫過夜，第二天轉移至純蠟中再浸蠟3 h。

⑤ 包埋：提前將包埋用的正方形塑料盒和夾取用的鑷子放在恒溫箱中預熱。將材料從純蠟中迅速取出并放在塑料盒中央，倒入純蠟。提前打開冷卻臺開關，迅速將塑料盒平穩(wěn)移至冷卻臺，30 min后關閉冷卻臺，將蠟塊倒出，選取葉片所在部位將其切成正方形小蠟塊，將小蠟塊用加熱的刀片熱熔后粘貼在小木塊上。

⑥ 切片：將粘貼著蠟塊的小木塊安裝在切片機的夾物臺上；調(diào)整好石蠟塊與刀片之間的角度與位置(刀片與石蠟切片約15°左右)；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器，使材料的切片厚度為10 μm；在適宜搖轉速度(通常為40～60 r/min)下將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶，當蠟帶達到程鵬飛 20 cm時，用毛筆輕輕地將蠟帶挑起，輕輕平放在干燥紙上，光滑的切面朝下，將蠟帶切成小段。

⑦ 粘片：在洗凈后干燥的載玻片(無水乙醇浸泡然后用蒸餾水沖洗將其擦干)上滴一小滴蛋白粘貼劑，涂勻后，再滴加兩滴蒸餾水；將蠟帶光滑平整的一面貼于載玻片的中央；然后將制作好的片子放在42 ℃恒溫烘箱中烘干約 4 h。

⑧ 脫蠟：將裝有純二甲苯的玻璃瓶放在約40°熱水中加熱，然后將載玻片放入純二甲苯中脫蠟兩次，每次15 min。

⑨ 復水染色：將脫蠟后的載玻片依次轉移至75%二甲苯+25%無水乙醇溶液、50%二甲苯+50%無水乙醇溶液、25%二甲苯+75%無水乙醇溶液、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中每級3 min，然后置于番紅中染色30 min；依次轉移至50%、75%、85%、95%乙醇中各2 min，然后置于固綠中染色15 s；轉移至95%乙醇中 2 min；再次轉移至100%乙醇中 2 min，兩次；然后依次轉移至75%無水乙醇+25%二甲苯溶液、50%無水乙醇+50%二甲苯溶液、25%無水乙醇+75%二甲苯溶液中各2 min，最后移至純二甲苯中2min，兩次。

⑩ 封片：在平臺上放一張干凈的吸水濾紙，從二甲苯中取出染色完成的載玻片放在紙上；迅速在切片的中央偏左的位置滴加2～3滴樹膠，封片過程中注意蓋玻片的放置，避免產(chǎn)生氣泡。待整張片子做好后，轉移至42 ℃恒溫烘箱中烘干。

2.3 患病組織超微形態(tài)觀察 取患不同等級霜霉病的葉片，用無菌剪刀將各組葉片剪成小塊(約5 mm×5 mm)，將樣品用導電雙面膠粘在樣品臺上，用掃描電子顯微鏡觀察(倍數(shù)為×85～×1500，加速電壓為30 kV)病原菌在葉片上的生長狀態(tài)、萌發(fā)方式以及不同患病等級葉片的差異。

3 結果與分析

3.1 不同種源烏頭霜霉病發(fā)病情況 對實驗田中種植的烏頭進行霜霉病病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同種源地烏頭幼苗霜霉病發(fā)病情況不同。4塊實驗田中，青川縣房石鎮(zhèn)和大壩鄉(xiāng)烏頭種苗試驗地中觀察到發(fā)病植株(圖1，A、B)，房石鎮(zhèn)種源地烏頭幼苗霜霉病發(fā)病率較高，達到40%。其他實驗田中均未發(fā)現(xiàn)患病植株(圖1，C)。采集病葉，用無菌解剖針挑取少許病葉背面上的菌絲，用水做浮載劑進行常規(guī)裝片，對病葉上菌絲進行鏡檢，發(fā)現(xiàn)病原菌孢囊梗(圖1，D、F)、孢子囊形態(tài)大小(圖1，E)與課題組前期研究結果一致。因種植過程中，管理條件均一致，而霜霉病發(fā)病情況不同，說明烏頭霜霉病的發(fā)病可能與種源有聯(lián)系。霜霉病原菌可能存在于烏頭種苗或者根際土壤中，其卵孢子在組織或土壤中越冬后，到來年春天萌發(fā)，侵染烏頭幼苗。不同種源地的烏頭種苗或根際土壤所攜帶的病原菌數(shù)量不同，所以導致不同種源地幼苗的發(fā)病率不一致。

3.2 組織切片觀察 通過對不同種源地種根、病葉、莖進行石蠟切片觀察，在患病烏頭莖(圖2)、葉(圖3)中均發(fā)現(xiàn)了卵孢子。其中在青川大壩鄉(xiāng)的種根中發(fā)現(xiàn)了卵孢子(圖4)，其余種根中未能發(fā)現(xiàn)。卵孢子呈卵圓形、橢圓形、不定形等形狀，直徑平均為(26±2)μm。卵孢子外壁較厚，且內(nèi)部含有豐富的內(nèi)含物。卵孢子主要存在于組織細胞間隙(圖2，B)，未見卵孢子進入細胞內(nèi)。余永年等[1]報道的烏頭霜霉卵孢子直徑為22.4～37.8 μm，平均值大小(28.76±2.96 )μm，較本文中觀察到的稍大，但本文觀察到的卵孢子直徑在報道范圍之內(nèi)，結果基本一致。

圖1 霜霉病發(fā)病情況及顯微特征

圖2 烏頭莖中卵孢子形態(tài)

圖3 烏頭葉中卵孢子形態(tài)

圖4 烏頭根中卵孢子形態(tài)

3.3 病原菌超微形態(tài)觀察 取不同生長階段的烏頭葉片進行電子掃描顯微鏡觀察，結果表明，不同生長期葉片上的氣孔和病原菌孢囊梗、孢子囊等在數(shù)量和形態(tài)表現(xiàn)上不同。在健康的葉片上，葉背面(圖5，A)和葉正面(圖5，B)各結構均正常，保衛(wèi)細胞正常發(fā)育，氣孔和葉表皮細胞上未見病原菌孢囊梗、孢子囊或孢子等。霜霉病發(fā)病較輕的烏頭葉上，在病葉背面能夠觀察到少量的孢子囊，部分氣孔中萌發(fā)出了孢囊梗，成熟的孢囊梗分支末端上生有孢子囊(圖6，A)。在發(fā)病嚴重的葉被上，能夠觀察到大量散落在葉背上的孢子囊以及從氣孔中萌發(fā)的孢囊梗(圖6，B)，大量的孢子囊和孢囊梗交錯在一起覆蓋在葉背上(圖6，C)，即形成肉眼觀察下的霜霉菌灰色霉層。

圖5 烏頭健康葉電鏡觀察

圖6 烏頭病葉電鏡觀察

3.4 病原菌侵染過程 烏頭霜霉病主要為葉類病害，在葉上的感染與定殖是一個復雜的過程。本文通過電子顯微鏡觀察烏頭病葉葉背上的病原菌形態(tài)特征，以及病原菌如何在寄主上生長。在烏頭葉背面的氣孔中觀察到了卵孢子萌發(fā)出的孢囊梗(圖7，A)，病原菌會從寄主中吸取營養(yǎng)，使得孢囊梗不斷的生長，有時一個氣孔中會伸出多條孢囊梗(圖7，B)，當孢囊梗生長到一定的階段，開始進行二叉分支(圖7，C)，發(fā)育成熟后在分支頂端產(chǎn)生孢子囊(圖7，D)，當孢子囊成熟后就會脫離孢囊梗，形成游動孢子囊(圖7，E)。孢子囊成熟脫落后，受到風、雨水等的影響，在適宜的條件下，孢子囊開始萌發(fā)出芽管，芽管會從氣孔或者葉片傷口等空隙中侵入葉內(nèi)(圖7，F(xiàn))。

圖7 病原菌侵染過程

4 討論

烏頭霜霉病傳播方式復雜，且在國內(nèi)外研究較少，其病原菌是霜霉科霜霉屬烏頭霜霉(PeronosporaaconitiYu)，它的繁殖速度較快，對寄主的影響較大。病原菌的繁殖主要包括有性和無性繁殖兩種方式。有性階段主要是通過產(chǎn)生雄器和藏卵器來完成。本實驗文通過對病葉、病莖進行石蠟切片，觀察到了病原菌的卵孢子。卵孢子主要存在于細胞間隙之中，多呈球形，外壁較厚，含有豐富的內(nèi)含物和卵周質(zhì)，豐富的卵周質(zhì)可以為卵孢子的萌發(fā)提供營養(yǎng)。本實驗中只觀察到了受精后的卵孢子，還缺乏對雄器和藏卵器結合方式的研究。無性繁殖主要靠產(chǎn)生孢子囊來進行。本實驗通過電子顯微鏡對烏頭霜霉病葉進行觀察，發(fā)現(xiàn)孢子囊以萌發(fā)芽管而不是產(chǎn)生游動孢子的形式進行繁殖，這不同于一些其他霜霉科病原菌[12-13]。孢囊梗從氣孔中伸出，主干生長到一定階段便開始進行二叉式多次分支，直到孢囊梗成熟便不再生長，這不同于腐霉科孢囊梗的無限生長[12]。孢子囊生長于成熟孢囊梗分支的頂端，成熟后從孢囊梗上脫落，借著風力、雨水等傳播，在適宜的條件下萌發(fā)出芽管循環(huán)侵害寄主葉片。

在對烏頭病葉正面和背面比對后發(fā)現(xiàn)，孢子囊和孢囊梗基本只產(chǎn)生于葉背，葉正面基本觀察不到，其原因可能是葉背上氣孔較多，而病原菌主要是以通過氣孔等孔隙侵入寄主進行循環(huán)傳播侵害。對采集的不同種源地烏頭種苗石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在烏頭根中未發(fā)現(xiàn)卵孢子，且根組織結構正常，說明烏頭種根中未攜帶病原菌。對于實驗田中房石鎮(zhèn)、大壩鄉(xiāng)種源烏頭幼苗發(fā)病率較高的情況，初步認為可能是由于采集種根時根際土中帶有病原菌卵孢子，卵孢子在土壤中越冬后，春天溫度適宜時開始萌發(fā)侵染烏頭[14]。

據(jù)調(diào)查，烏頭霜霉病病原菌在15～20 ℃時迅速生長繁殖，在此溫度下霜霉病傳播較快[15]。并且，孢子囊的產(chǎn)生與萌發(fā)都需要一定的濕度條件[16]，因此，春天是烏頭霜霉病發(fā)生與流行的最佳時期。在此階段，田間管理應該注意及時排水，防止霜霉病的傳播。在收集種根時及時檢測根際土中的病原菌卵孢子也是有效降低烏頭患病率的一個重要途徑。

綜上，本實驗明確了烏頭霜霉病發(fā)病與種苗是否帶菌有關，其傳播可能是烏頭霜霉卵孢子在種苗內(nèi)越冬，春天萌發(fā)侵染烏頭，為烏頭霜霉病的防治技術提供了理論基礎。