吳海虹，劉 芳*，靳盼盼，孫芝蘭，徐為民

（江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

青蝦（Macrobrachium nipponense），別稱河蝦，是我國淡水水域中分布廣、產量較高、經濟價值及營養(yǎng)價值高的一種蝦[1]。青蝦蝦仁是青蝦加工的主要產品，是一種高蛋白、低脂食品，含有人體必需的氨基酸及鈣、鐵、鋅、硒等微量元素[2]。青蝦在捕撈、運輸、加工及貯藏過程中極易受細菌侵襲而腐敗變質[3-4]，因此需要采取合理的方式對青蝦蝦仁產品進行保鮮加工。雖然冷凍蝦仁的保質期較長，但是冷凍和解凍處理會影響蝦仁的色澤、質地和風味，同時造成蝦仁的汁液流失[5]。隨著消費者對低溫肉制品接受度的提高，冷鮮蝦仁產品的加工和保鮮工藝研究顯得極為重要[6-7]。

近年來，大量研究表明，植物來源的一些抗菌物質，如多酚等具有抑制或殺死細菌等微生物的特性，并且能夠賦予食品香氣，矯正其異味，是一類食用安全的天然香料；因此可以用來有效地控制食品的腐敗[8-9]。閔娟等研究發(fā)現4 種植物提取物（龍須菜寡糖、大蒜、迷迭香和生姜提取物）可明顯延長馬鮫魚的貨架期[10]；Huang Zhan等研究發(fā)現肉桂精油能明顯影響冷藏草魚魚片貯藏后期的微生物組成及產品品質[11]。高通量測序作為一種新興的分子生物學技術，具有數據產出通量高、分析全面、靈敏、快速等特點，目前已被用來研究食品中的菌群多樣性變化[12-14]。本實驗以青蝦蝦仁為研究對象，研究3 種植物源抗菌劑（香芹酚、百里香酚及紫蘇醇）對蝦仁的保鮮效果；同時利用Illumina MiSeq高通量測序技術進一步分析3 種抗菌劑對蝦仁貯藏前期和后期腐敗菌多樣性的影響，分析3 種抗菌劑對蝦仁中的不同腐敗菌抑菌效果的強弱。本研究可為未來青蝦蝦仁抗菌保鮮劑的研發(fā)及冷藏保鮮工藝的改進提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蝦蝦仁來源于鹽城冠華水產有限公司，取樣后真空包裝置于冰水中運輸至實驗室后進行后續(xù)樣品處理。

香芹酚、百里香酚和紫蘇醇（純度＞99%）湖北鑫潤德化工有限公司；細菌基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；通用引物515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’、806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，由北京諾禾致源公司合成。

1.2 儀器與設備

UniCen MR臺式冷凍離心機 德國Herolab公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；T-25數顯勻漿器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌劑的配制及樣品處理

將香芹酚、百里香酚與紫蘇醇分別加入0.1 g/100 mL的海藻酸鈉溶液中配成具有一定凝膠性的保鮮液，使其含量均為0.5 g/kg，選擇0.1 g/100 mL的海藻酸鈉溶液作為陰性對照。將每份青蝦蝦仁200 g放置于保鮮袋，然后按料液比1∶2加入不同的保鮮液，將各組樣品分別置于4 ℃和10 ℃貯藏，每組樣品各3 個重復。在貯藏期間內（4 ℃貯藏選擇0、2、4、6 d；10 ℃貯藏選擇0、1、2、3 d）分別從各樣品袋中取出20 g蝦肉用于后續(xù)實驗。

1.3.2 菌落總數測定

按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法進行蝦仁樣品中菌落總數的測定。取10 g蝦仁樣品置于離心管中，加入90 mL生理鹽水，振蕩混合均勻，取合適梯度的稀釋液100 μL涂布于計數平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》的方法進行蝦仁樣品中揮發(fā)性鹽基氮（volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測定。稱取10 g蝦仁樣品，絞碎后，置于90 mL蒸餾水中，振蕩浸漬30 min，取過濾后的濾液進行TVB-N含量的檢測。

1.3.4 樣品總DNA的提取

取初始樣品、4 ℃貯藏6 d和10 ℃貯藏3 d后的對照和處理組樣品，參照Hinton等的提取方法收集菌體后提取總DNA[15]，具體如下：將青蝦剪碎放入裝有250 mL 0.1 g/100 mL蛋白胨和0.85 g/100 mL生理鹽水的無菌均質袋中，200 r/min振蕩30 min。待振蕩結束后，2 000 r/min低溫離心5 min，去除蝦殼、肌肉等成分，然后10 000×g離心10 min收集菌體。DNA提取方法參照DNA Kit說明書進行。將提取得到的DNA樣品進行質量測定后置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MiSeq測序和數據分析

微生物多樣性檢測選取細菌16S rDNA V3～V4區(qū)，DNA樣本送至北京奧維森基因科技有限公司，利用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺測序。細菌16S rDNA V3～V4擴增引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’）。通過Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，下機數據經過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除打分低于20、堿基模糊、引物錯配或測序長度小于150 bp的序列。根據barcodes規(guī)類各處理組序列信息聚類為用于物種分類的操作分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），OTU相似性設置為97%[16]。對比silva數據庫，得到每個OTU對應的物種分類信息[17]。再利用Mothur軟件（version 1.31.2）[18]進行Alpha多樣分析（包括Shannon、ACE和Chao1 3 個指數）?；赪eighted Unifrac距離，使用R（v3.1.1）軟件包的pheatmap進行聚類分析。經過UniFrac算法利用系統進化的信息來比較樣品間物種群落差異，并進行Beta多樣性分析。

1.4 數據處理與分析

所有實驗測定重復3 次，利用Origin 8.0軟件進行圖形分析處理，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 3 種抗菌劑對青蝦蝦仁貯藏期間菌落總數的影響

圖 1 3 種抗菌劑對青蝦蝦仁4 ℃（A）和10 ℃（B）貯藏過程中菌落總數的影響Fig. 1 Effects of three antimicrobial agents on total viable count in shrimp meat during storage at 4 (A) or 10 ℃ (B)

Cai Luyun[19]、Manju[20]等研究提出，水產品中菌落總數界限值為7（lg（CFU/g）），并將該值作為評價水產品是否腐敗變質及貨架期是否到終點的標志。由圖1A、B可知，在4 ℃和10 ℃貯藏時對照樣品的菌落總數隨貯藏時間延長一直處于顯著增加的狀態(tài)（P＜0.05），并且當4 ℃貯藏到4 d以及10 ℃貯藏到2 d時，對照樣品的菌落總數均超過7（lg（CFU/g）），說明未經處理的青蝦蝦仁保質期較短，而整個貯藏期間，所有處理組的菌落總數均沒有顯著性增長，且均低于7（lg（CFU/g））。蝦仁經3 種保鮮劑處理后，產品在貯藏初期的菌落總數均顯著低于初始對照組的菌數（P＜0.05），說明這3 種抗菌劑都對樣品中的腐敗菌起到了良好的殺菌作用，對低溫貯藏的蝦仁保鮮起到了良好效果。對于這3 種抗菌劑，在貯藏的特定時間內，香芹酚和百里香酚處理組菌落總數均顯著低于紫蘇醇處理組（P＜0.05），說明前兩者的殺菌效果更好。Samirah等研究也發(fā)現含有百里香精油的甘薯淀粉涂層能明顯延長貨架期[21]。香芹酚、百里香酚和紫蘇醇都是含有苯環(huán)類的芳香族抗菌物，其抑菌機理可能都與改變靶向菌細胞膜的通透性，造成細胞壁的裂解有關[22]。即使香芹酚和百里香酚為同分異構體，但是針對不同的菌來講，其抑菌效果略有差異[23]。由于食品中污染的菌群比較復雜，因此不同植物抗菌劑的保鮮效果要根據具體的食品體系來確定。

2.2 3 種抗菌劑對青蝦蝦仁貯藏期間TVB-N含量的影響

圖 2 3 種抗菌劑對青蝦蝦仁4 ℃（A）和10 ℃（B）貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig. 2 Effects of three antimicrobial agents on TVB-N content in shrimp meat during storage at 4 (A) or 10 ℃ (B)

根據GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》的規(guī)定，TVB-N含量限量標準為不超過20 mg/100 g[24]。從圖2A、B可以看出，在4 ℃和10 ℃貯藏時對照樣品的TVB-N含量一直處于顯著增加的狀態(tài)（P＜0.05），并且當以4 ℃貯藏到6 d以及10 ℃貯藏到3 d時，對照樣品的TVB-N含量均超過20 mg/100 g，而所有處理樣品的TVB-N含量都低于20 mg/100 g，說明抗菌劑處理后能通過抑制腐敗菌的生長來抑制TVB-N含量的增加速度。在相同貯藏溫度和時間時，香芹酚和百里香酚處理組的TVB-N含量都顯著低于紫蘇醇處理組（P＜0.05）。

經抗菌劑處理后樣品的TVB-N含量緩慢增加，這可能是因為只要樣品中有活的腐敗菌存在，就會消耗樣品中的蛋白類物質，產生生物胺等[25]，從而增加了TVB-N的含量，并且主導生物胺合成的一些氨基酸脫羧酶在低溫下仍然具有一定的活性[26]。因此要綜合菌落總數和TVB-N含量這兩個指標來確定食品的腐敗情況。

2.3 3 種抗菌劑對青蝦蝦仁貯藏后期菌群多樣性的影響

2.3.1 測序數據統計與OTU分析結果

圖 3 序列分布（A）和樣品稀疏曲線（B）圖Fig. 3 Sequence distribution (A) and sample curves (B)

采用Illumina MiSeq高通量測序獲得了初始青蝦蝦仁樣品及3 種抗菌劑保鮮后樣品菌落的原始序列數據后，經Trimmomatic及FLASH軟件優(yōu)化數據后得到了27 個樣本共1 700 183 條有效序列，序列平均長度主要集中在200～260的區(qū)間長度內（圖3A）。隨著樣品量的不斷增大，在樣品量大于20 000時，OTU曲線（圖3B）趨于平坦，說明測序數據量合理，且測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。對各個樣品測得的OTU進行了數據的重疊分析，結果見圖4。從圖4韋恩圖可以看出，各組之間的數據都有相同的數據，說明各組之間存在重復的細菌菌群。

2.3.2 Alpha多樣性指數分析結果

樣品的Alpha多樣性指數分析結果可以反映微生物群落的豐度和多樣性。選取Alpha多樣性指標的Chao1、Observed_species、PD_whole_tree及Shannon指數進行數據分析，其中Chao1指數反映菌種豐富度，Observed_species和PD_whole_tree指數反映測序深度，而Shannon指數反映樣品的多樣性，結果見圖5。由于樣品的菌種豐度、測序深度與取樣數量有關，很難真實反映樣品的實際情況，所以主要根據Shannon指數分析微生物多樣性的變化，從圖5D可以看出，初始C1樣品的Shannon指數最高，而貯藏后期對照和抗菌劑處理的樣品Shannon指數較低，說明初始樣品的菌群多樣性較高，但是隨著低溫貯藏時間延長，某些嗜冷菌能夠繼續(xù)生長，成了貯藏后期的優(yōu)勢菌群，同時抗菌劑的處理也會對一些菌群起到殺菌作用，因此貯藏后期樣品以某些優(yōu)勢腐敗菌為主，其多樣性就比初始樣品少。

2.3.3 物種組成和聚類分析結果

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP Classifier算法對OTU代表序列進行比對分析，并在屬水平上注釋了各樣品中菌群的物種信息，結果見圖6。初始樣品的菌群多樣性較高，主要有不動細菌屬（Acinetobacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、漫游球菌屬（Vagococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、庫特氏菌屬（Kurthia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等，在4 ℃和10 ℃貯藏后期，未經處理的樣品菌群多樣性高于其他處理組，但是均低于初始樣品的菌群多樣性。4 ℃和10 ℃貯藏后期各樣品菌群組成相似，比例稍有不同，主要的菌為Streptococcus、索絲菌屬（Brochothrix）、肉桿菌屬（Carnobacterium）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、Chryseobacterium、Flavobacterium、Acinetobacter、Pseudomonas等，其中Brochothrix、Psychrobacter和Pseudomonas的比例都高于初始對照組，說明這三者在低溫貯藏的樣品中仍能繼續(xù)繁殖，而其他初始樣品中優(yōu)勢菌如Arcobacter、Shewanella和Aeromonas等在貯藏后期的比例很低。

由圖6可知，對于貯藏末期的樣品來說，3 種抗菌劑處理的樣品的菌群組成相似，并且組成相對單一，主要以Pseudomonas為主，其余菌比例都比對照組低，說明這3 種抗菌劑對菌的抑制效果不同，均對貯藏后期樣品的優(yōu)勢菌如Flavobacterium、Brochothrix、Psychrobacter和Carnobacterium等起到了良好的抑制作用，而對假單胞菌和不動桿菌等的抑菌效果較弱。Zhang Yuemei等利用高通量測序分析了肉桂精油對真空包裝鯉魚冷藏期間細菌多樣性的影響，發(fā)現肉桂醛對貯藏后期的優(yōu)勢菌Aeromonas和Lactococcus有著很好的抑菌效果[27]。這說明通過高通量測序能很直接地看出抗菌劑對食品中常見腐敗菌抗菌效果，為復合抗菌劑研發(fā)提供了更好的參考。

圖 6 物種組成分析直方圖Fig. 6 Histogram of species composition analysis

圖 7 樣本聚類直方圖Fig. 7 Sample clustering histogram

根據屬水平上的物種組成和相對豐度，通過UPGMA方法對各樣品進行了聚類分析，結果見圖7。所有對照組樣品都在一個的分支上，說明這對照組初期和貯藏3（10 ℃）、6（4 ℃） d的樣品的菌種組成和相對豐度類似；而其他所有處理組在一個分支上，說明3 種抗菌劑處理樣品的菌群組成類似。

2.3.4 樣品菌群變化的熱圖分析結果

由于熱圖（Heatmap圖）可以用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數據信息，可以直觀地將數據大小以定義的顏色深淺表示出來，因此，將聚類后數據的進一步呈現在Heatmap圖上，結果見圖8。高豐度和低豐度物種分塊聚集后，顏色梯度及相似程度可以反映不同樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性，初始樣品的優(yōu)勢菌群如Shewanella、Arcobacter和Aeromonas等在貯藏后期樣品中的比例都明顯降低，說明這些菌在低溫時不能生長，不可能成為后期腐敗樣品中的優(yōu)勢菌群。一些貯藏初期的非優(yōu)勢菌如Psychrobacter和Brochothrix等，在貯藏后期的未處理樣品中成了優(yōu)勢菌群，說明這些菌能在低溫條件下繼續(xù)繁殖，但是在3 種抗菌劑處理后的樣品菌群中的比例較低，說明這些抗菌劑處理抑制了這類菌的生長。從圖8可以很明顯地看到，Pseudomonas是所有抗菌劑處理后的樣品貯藏后期的優(yōu)勢菌群，說明該菌不僅適合低溫生長，并且這3 種抗菌劑對該菌的抑制效果較弱，因此在以后青蝦蝦仁貯藏過程中可以將這些植物來源的保鮮劑同其他保鮮劑進行復配使用，以便對Pseudomonas等一些腐敗菌也能起到抑菌作用，達到更好的保鮮效果。Abdollahzadeh等研究發(fā)現百里香精油和Nisin的復合物對魚糜中李斯特菌的抑制效果更好[28]。van Haute等研究發(fā)現某些精油如肉桂、牛至和百里香精油等同泡菜汁的復合物的抑菌效果比單一精油的效果要好[29]，這也說明不同來源的抗菌物質間可能存在協同的抗菌效果。Liu Fang等研究發(fā)現Nisin和聚賴氨酸的復合物對糞腸球菌具有協同抑菌效果，兩者的同時使用能顯著降低單低單一抗菌劑的使用濃度[30]。

Zhang Huang等利用高通亮測序分析發(fā)現Aeromonas、Pseudomonas和Shewanella是冷藏草魚貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌，而肉桂精油只對Aeromonas和Shewanella具有良好的抑菌效果，這就使得Pseudomonas成了處理組樣品貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌[31]。該研究結果與本研究結果類似，說明植物源抗菌劑對Pseudomonas的抑制效果較弱，或者該菌在低溫貯藏時的生長速度較快；因此需要采用復合抗菌劑或者物理殺菌手段來抑制該菌的生長，延長水產類產品的貨架期。吳燕燕等利用高通量測序平臺研究了氣調包裝的調理啤酒鱸魚片在微凍貯藏過程中的微生物群落多樣性分析，研究也發(fā)現Pseudomonas是造成該產品腐敗變質的主要菌之一，并且氣調包裝在一定程度上能延緩該菌的生長，但是不能徹底地抑制該菌生長[32]。

圖 8 OTU及其屬分類學水平Heatmap圖Fig. 8 Heatmap of OTU at genus level

2.3.5 青蝦蝦仁貯藏過程中菌群變化的主成分分析結果

圖 9 不同青蝦樣品細菌菌群的主成分分析Fig. 9 Principal component analysis of bacterial flora of different shrimp meat samples

由圖9可知，通過主成分分析可以樣品分成3 組，橫軸表示第一主成分（PC1），縱軸表示第二主成分（PC2），百分數代表主成分對樣品差異的貢獻率大小。第一主成分與第二主成分的貢獻率分別為45.33%和26.25%，說明這兩個主成分是解釋樣品微生物群落結構組成差異的主要因子。圖中樣品之間距離越近，表示樣品群落結構組成越相似。對照C1組的3 個樣品聚合在一起，4 ℃貯藏6 d后（C4D6組）的3 個樣品同10 ℃貯藏3 d后（C10D3組）的3 個樣品聚合在一起，而3 種抗菌劑處理后的所有樣品聚合在一起，說明抗菌劑處理后的樣品的菌群組成相似，并且都與未處理組有明顯差異，說明3 種抗菌劑的處理能通過抑制某些腐敗菌的生長來控制后期菌群的組成和含量，達到對產品貯藏保鮮的目的。

3 結 論

本研究利用0.5 g/kg的香芹酚、百里香酚與紫蘇醇（溶劑為0.1 g/100 mL海藻酸鈉）對青蝦蝦仁進行4 ℃和10 ℃低溫貯藏保鮮。結果發(fā)現，對照組的青蝦蝦仁在4 ℃貯藏6 d和10 ℃貯藏3 d后均已腐敗變質，而同期3 種保鮮液處理組的菌落總數都顯著低于對照樣品，在貯藏期間均低于7（lg（CFU/g）），說明這3 種抗菌劑均對腐敗菌起到了良好的殺菌作用，能對低溫貯藏的蝦仁保鮮起到一定作用。對于這3 種抗菌劑，在貯藏的特定時間內，香芹酚和百里香酚的保鮮效果要優(yōu)于紫蘇醇。

通過Illumina Miseq高通量測序分別研究了兩種貯藏溫度下3 種抗菌劑對樣品中腐敗菌群多樣性的影響，研究發(fā)現到貯藏末期時，蝦仁中的菌群組成發(fā)生了明顯的變化。初始樣品中的優(yōu)勢菌群有Shewanella、Arcobacter、Flavobacterium、Acinetobacter和Chryseobacterium等，貯藏后期的優(yōu)勢菌群為Streptococcus、Brochothrix、Carnobacterium、Psychrobacter、Flavobacterium和Pseudomonas等，說明Psychrobacter、Brochothrix和Pseudomonas等在低溫貯藏期間增長迅速。3 種抗菌劑處理后樣品內的菌群變化情況類似，三者均能顯著抑制Psychrobacter和Brochothrix的生長，而對Pseudomonas等沒有很好的抑菌作用。以上結果說明香芹酚、百里香酚、紫蘇醇這3 種抗菌劑均能通過抑制青蝦蝦仁中多種優(yōu)勢腐敗菌的生長來延長產品的貨架期。