李先艷 李茹 張晴 桑田

摘 ?????要： 為培育出耐高溫的氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans，簡稱T.f菌），通過低溫等離子體誘變試驗探討T.f菌高溫誘變的可行性，研究結(jié)果表明：低溫等離子誘變過后的T.f菌經(jīng)PCR鑒定確認(rèn)為氧化亞鐵硫桿;T.f菌生長規(guī)律符合在有限環(huán)境容量下微生物的“S”型生長曲線;低溫等離子的誘變可以提高T.f菌對高溫的耐受性，但誘變功率60、70 W的誘變效果無明顯差異;T.f菌活性均隨溫度的升高而減小，誘變過后的菌株也無法逆轉(zhuǎn)這一生長規(guī)律;35、38、42 ℃三個誘變溫度相比較，38 ℃誘變效果最好，誘變組Fe2+氧化率比對照組高13%。

關(guān) ?鍵 ?詞：氧化亞鐵硫桿;低溫等離子體;鄰啡羅啉比色法

中圖分類號：Q691.5 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0712-04

Abstract： To cultivate high temperature resistant thiobacillus ferrooxidans （T.f.），the feasibility of high temperature mutagenesis of T.f strain was investigated by low temperature plasma mutagenesis test. Experimental results showed that strains after low temperature plasma mutagenesis were confirmed as T.f by PCR identification.The oxidation rate of Fe2+ was proportional to the activity of T.f and its growth activity changed with "S" type over time.Therefore， the growth pattern of T.f was consistent with the "S" growth curve of microorganisms under limited environmental capacity. Although low temperature plasma mutagenesis produced high temperature resistant T.f strain， there was no significant difference in the mutagenic effects of 60 and 70 W.The activity of T.f bacteria decreased with increasing temperature，and Mutagenesis did not reverse this growth law. Among three mutagenic temperatures of 35， 38 and 42 ℃，the mutagenic effect at 38℃ was the best， Fe2+ oxidation rate of the mutagenized group was 13% higher than the control group at 38 ℃.

Key words： Thiobacillus ferrooxidans; Low temperature plasma; Phenanthroline colorimetry

氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans，簡稱T.f菌）是一種嗜酸性專性好氧化能自養(yǎng)菌，適宜在溫度30 ℃左右、pH值為2～2.5的環(huán)境中生長，能夠通過氧化S2-、S0及Fe2+的化合物等來獲得生長所需要的能量[1，2]。一直以來T.f菌在生物冶金和生物處理污泥中的重金屬方面應(yīng)用廣泛，并已取得一定進(jìn)展，近期的一個熱門研究方向是利用T.f菌的脫硫性能進(jìn)行煙道脫硫，但目前尚在實驗室研究階段，并未能實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。其中如何使T.f菌在煙道的高溫環(huán)境下正常工作是一個技術(shù)難點，高溫條件下T.f菌的生物活性會大大降低，生長速度緩慢[3]，甚至直接死亡。本實驗通過低溫等離子體誘變技術(shù)（這種誘變技術(shù)通過中性活性粒子來改變微生物遺傳特性，可直接改變核苷酸水平的分子結(jié)構(gòu)也可通過作用于細(xì)胞而間接影響胞內(nèi)遺傳物質(zhì)，故誘變所得突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性）對T.f菌進(jìn)行誘變，通過實時監(jiān)測誘變后菌液的pH值、Fe3+和Fe2+的濃度變化情況，研究菌種的生長規(guī)律與氧化效率，進(jìn)一步論證利用低溫等離子體技術(shù)誘變耐高溫T.f菌的可行性，找出合適的誘變條件，培養(yǎng)出可適應(yīng)煙道高溫環(huán)境的菌種，為推動T.f菌的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 ?實驗部分

1.1 ?菌種來源與培養(yǎng)基

菌種來自于陜西延安黃陵某煤礦排水口采集酸性水樣。

9K液體培養(yǎng)基[4]：A液：3 g磷酸氫二銨，0.1 g氯化鉀，0.5 g硫酸鎂，0.01 g硝酸鈣，400 mL蒸餾水，pH調(diào)至2.0、120 ℃高溫滅菌30 min;B液：44.78 g硫酸亞鐵，600 mL蒸餾水，pH調(diào)至2.0，紫外滅菌30 min，滅菌完成后A液、B液混合。9K固體培養(yǎng)基則加入15 g瓊脂溶于200 mL蒸餾水，其他條件不變。

1.2 ?儀器與材料

UV-1800紫外可見分光光度計（上海析譜儀器有限公司）;低溫等離子反應(yīng)器DBD-300（南京蘇曼等離子體科技有限公司）。

1.3 ?實驗方法

1.3.1 ?培養(yǎng)菌液

9K液體培養(yǎng)基接入10%氧化亞鐵硫桿菌菌液（菌液質(zhì)量濃度在108 g/L左右），pH調(diào)至2.0，于30 ℃恒溫水浴振蕩箱中120 r/min轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每6 h測定菌液的吸光度[5]，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.3.2 ?低溫等離子體誘變

去除Fe3+：吸取適量對數(shù)期菌液于離心管中，4 000 r/min 離心30 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀，再次離心，重復(fù)此步驟3次，制成無鐵細(xì)菌懸液。

誘變：將細(xì)菌懸液用無菌水稀釋至OD 600 nm值略大于1，即細(xì)菌個數(shù)約為108個/mL，將稀釋過的懸液均勻涂布在載玻片上，使用無菌風(fēng)吹干[6]。待細(xì)菌懸液在載玻片上形成菌斑后，放入石英器皿中置于等離子體反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行誘變。誘變時間設(shè)置為60 s，等離子發(fā)射源與樣品的間距設(shè)置為4 mm，將誘變功率設(shè)置為自變量，分別為30，40，50，60W，70，80 W每組做3個平行，共計18個樣，以不誘變的菌種作為對照組。誘變結(jié)束以后用無菌水沖洗菌斑[7]，接種在9K固體培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)（防止T.f菌在光源的照射下自我修復(fù)），計算死亡率，并利用PCR技術(shù)鑒定是否為氧化亞鐵硫桿菌。

性能測定：挑取長勢良好的誘變后菌落接種在9K液體液體培養(yǎng)基中，于35、38、42 ℃條件下120 r/min恒溫震蕩箱中培養(yǎng)，每24小時測一次菌液的亞鐵（Fe2+）、總鐵（TFe）以及pH值。待Fe2+完全被細(xì)菌氧化以后，對菌液做除Fe3+處理，第一次為一期培養(yǎng)，再按照上述步驟進(jìn)行二期、三期培養(yǎng)，依此類推。

1.4 ?分析方法

亞鐵（Fe2+）：鄰啡羅啉比色法（GB7873-87，3）[8，9]。

準(zhǔn)確吸取鐵標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3、4、5 mL于6支50 mL比色管中，分別加入5 mL 22%醋酸銨緩沖溶液，搖晃均勻，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%鄰菲羅啉溶液，加水至50 mL刻度，靜止20 min后測定OD 510 nm值，繪制鐵溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用移液槍吸取20 μL菌液于50 mL的比色管中，迅速加入兩滴濃硫酸（防止Fe2+被氧化產(chǎn)生操作誤差）[10]，在按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟測定溶液的吸光度，通過鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)亞鐵的含量，計算出亞鐵的濃度。

總鐵（TFe）[11]：在菌液樣本中加入2 mL 2 mol/L鹽酸羥胺，搖晃均勻后加入5 mL 22%醋酸銨緩沖溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%鄰菲羅啉溶液2 mL，再次搖晃均勻，測定510 nm處的吸光度，根據(jù)鐵溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)總鐵的含量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌種鑒定

經(jīng)30、40、50、60、70、80 W誘變后的菌種中，30 W誘變組的死亡率為70%，40 W誘變組的死亡率為76%，50 W誘變組的死亡率為81%，60 W誘變組的死亡率為92%，70 W誘變組的死亡率為94%，80 W誘變組的死亡率達(dá)到了100%。低死亡率說明誘變力度不夠，大部分原始細(xì)菌可以存活下來，達(dá)不到預(yù)期誘變效果。細(xì)菌整體死亡，說明誘變功率太大，得不到有效誘變菌株。因此本實驗選用了60 W誘變組與70 W誘變組作為分析對象，并對誘變后存活的菌株做PCR鑒定。

從60 W誘變組與70 W誘變組中分別挑取兩株長勢形態(tài)均良好的菌株，分別命名為L1、L2、Q1、Q2交送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行PCR擴增測序，將測序結(jié)果由NCBI-Blast進(jìn)行對比，對比結(jié)果表明四株菌均為氧化亞鐵硫桿菌，將與分離出的四株菌序列一致性在95%～100%的16SrDNA序列，用Clustal X2.1進(jìn)行剪切，使得所有序列大小一致，再用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多重序列對比分析，以Neighbor-Joining的數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩個大枝，Q1、L1、L2和Thiobacillus ferrooxidans strain TGS為一枝，Q1與Thiobacillus ferrooxidans strain XJF-8為一枝，由此可見選出的四株菌均為氧化亞鐵硫桿菌。

2.2 ?38 ℃培養(yǎng)條件下等離子誘變T.f菌結(jié)果分析

實驗分別以35、38、42 ℃的高溫條件培養(yǎng)誘變菌種，分別測定了在培養(yǎng)期間各溫度條件下pH值，F(xiàn)e2+濃度和TFe濃度的變化情況，以38 ℃培養(yǎng)條件為例分析誘變后T.f菌各時期的生長活性，測定結(jié)果如表1-3所示。

由表1可知，在三期培養(yǎng)中pH值的變化規(guī)律都是呈先增大后減小的趨勢，這是因為菌種在適應(yīng)新環(huán)境以后，開始快速生長，消耗大量Fe2+并將其氧化為Fe3+，這一過程使培養(yǎng)基中的H+濃度減小，pH值升高。當(dāng)細(xì)菌經(jīng)過對數(shù)期之后，消耗Fe2+的速度開始減慢，F(xiàn)e3+逐漸水解生成沉淀，產(chǎn)生大量H+，產(chǎn)生H+的速度遠(yuǎn)大于消耗H+的速度，因此pH值上升。由表2可知Fe2+濃度隨培養(yǎng)時間的增長而減少，表3中TFe濃度在每個培養(yǎng)時期的前1～2 d變化不大，第三天開始呈現(xiàn)減少的趨勢，TFe濃度減小是由于Fe3+的水解，但Fe3+水解周期長，短期實驗達(dá)不到預(yù)期效果。因此能反應(yīng)T.f菌生長狀態(tài)的主要是Fe2+的氧化速率（見表4），F(xiàn)e2+濃度越低，F(xiàn)e2+的氧化速率越快，T.f菌的活性就越強。Fe2+的氧化速率與T.f菌活性呈正比，隨時間呈“S”型變化，因此T.f菌生長規(guī)律符合在有限環(huán)境容量下微生物的“S”型生長曲線。由表4可見，實驗組Fe2+的氧化速率略大于對照組，說明誘變組的活性強于對照組，這可能是由于高溫抑制了對照組菌種的生長活性，而誘變組對高溫表現(xiàn)出了較強的耐性。

通過表5可見對照組與誘變組相比較，誘變組在第2、3 d Fe2+的氧化率均高于對照組，呈現(xiàn)出了較為顯著的優(yōu)勢，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是T.f菌剛接種到新的環(huán)境有一個爭奪養(yǎng)料和適應(yīng)環(huán)境的過程。在第2、3 d以后，誘變組相比于對照組更適應(yīng)高溫環(huán)境，生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，而對照組生長受到高溫環(huán)境的抑制，部分細(xì)菌死亡，存活的細(xì)菌生長緩慢，F(xiàn)e2+氧化速率低，氧化周期也相對較長。但60 W誘變組與70 W誘變組總體Fe2+氧化率變化無明顯差距，這表明等離子體的誘變可以增加T.f菌對高溫的耐受性，但誘變功率對細(xì)菌高溫耐受程度的影響無明顯差異。由表6可知TFe三期培養(yǎng)最終的沉淀率并與太大差異，這是由于Fe3+的水解反應(yīng)才剛剛開始，且本身水解周期較長，早期數(shù)據(jù)無參考價值。

2.3 ?35、38、42 ℃培養(yǎng)條件下低溫等離子誘變T.f菌結(jié)果對比分析

取各高溫培養(yǎng)條件下第三期Fe2+的氧化率為樣本，如見表7所示，F(xiàn)e2+氧化速率隨溫度的增加而減小，誘變過后的菌株也無法逆轉(zhuǎn)T.f菌活性隨溫度升高而減小的趨勢。在35 ℃條件下T.f菌活性最強，氧化速率最快，但誘變組與對照組亞鐵氧化率差別不大，均可以在第2 d氧化完全部Fe2+。這可能是因為培養(yǎng)溫度35 ℃與T.f菌最適生長溫度相近，誘變組與對照組生長受抑制程度小。在38 ℃條件下，誘變組顯示出了較為明顯的優(yōu)勢，在生長穩(wěn)定的第3 d誘變組Fe2+氧化率比對照組高13%。42 ℃條件下，誘變組與對照組的亞鐵氧化率均受到抑制，直到第5 d誘變組與實驗組的亞鐵仍未氧化完全，這表明在42 ℃高溫條件下絕大部分T.f菌失活，只有少部分存活下來的T.f菌生長緩慢，生長活性低。

3 ?結(jié) 論

（1）低溫等離子誘變過后的T.f菌經(jīng)PCR鑒定后為氧化亞鐵硫桿，故等離子體誘變氧化亞鐵硫桿菌是可行的;

（2）Fe2+的氧化速率與T.f菌活性呈正比，隨時間呈“S”型變化，因此T.f菌生長規(guī)律符合在有限環(huán)境容量下微生物的“S”型生長曲線。

（3）低溫等離子的誘變可以提高T.f菌對高溫的耐受性，但誘變功率對細(xì)菌高溫耐受程度的影響無明顯差異。

（4）誘變前后T.f菌活性均隨溫度的升高而減小，誘變過后的菌株也無法逆轉(zhuǎn)這一生長規(guī)律。

（5）35、38、42 ℃三個誘變溫度相比較，38 ℃誘變效果最好，誘變組Fe2+氧化率比對照組高13%。

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