劉金虎 趙翠燕 孫志藝 王宇 陳宏飛 方園

摘 ?????要： 評(píng)價(jià)全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品（SAPZFP）不同醇濃度提取物的活性成分含量及體外抗腫瘤活性差異。分別測(cè)定SAPZFP不同醇濃度提取物的醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量，并采用MTT法檢測(cè)不同醇濃度提取物抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖的能力。SAPZFP不同醇濃度提取物均具有體外抗腫瘤活性，其中75%醇提物抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、肺腺癌細(xì)胞株A549體外增殖的能力最強(qiáng)，IC50分別為0.066、0.022 mg·mL-1。綜上所述，SAPZFP的25%、50%、75%醇提物均具有體外抗腫瘤活性，且75%醇提物效果最優(yōu)。

關(guān) ?鍵 ?詞：SAPZFP;雙向固體發(fā)酵;醇溶性活性成分;A549;MCF-7;抗腫瘤

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）06-1170-04

Abstract： To evaluate the differences in the content of active constituents and anti-tumor activity in vitro of SAPZFPs different alcohol concentration extracts， the contents of alcohol-soluble total protein， total polysaccharide and total flavonoids in SAPZFPs different alcohol concentration extracts were determined， and MTT assay was used to detect the inhibitory effect of different alcohol concentration extracts on the proliferation of cancer cells in vitro. SAPZFPs different alcohol concentration extracts all showed anti-tumor activity in vitro， 75% alcohol concentration extract had the strongest inhibitory effect on the proliferation of mammary cancer cells strain MCF-7 and lung adenocarcinoma cells strain A549 in vitro. In summary， the 25%， 50% and 75% alcohol extracts of SAPZFP had anti-tumor activity in vitro， and the 75% alcohol extract had the best effect.

Key words： SAPZFP; Bidirectional solid fermentation; Alcohol-soluble active constituents; A549; MCF-7; Anti-tumor

球孢白僵菌（B.bassiana）是叢梗孢科（Moniliaceae）白僵菌屬（Beauveria spp.）的絲狀真菌，現(xiàn)代研究表明，該菌的次生代謝產(chǎn)物具有誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡以及抗腫瘤的作用[1]。我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥白僵蠶，便是家蠶幼蟲(chóng)經(jīng)白僵菌感染僵化致死而得到的干燥全蟲(chóng)，具有極高的藥用價(jià)值。隨著微生物發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步，真菌藥物得到發(fā)展，中藥一類(lèi)新藥槐耳菌質(zhì)與槐耳沖劑便是藥用真菌固體發(fā)酵工程的代表產(chǎn)物[2]。本課題組根據(jù)雙向固體發(fā)酵技術(shù)，以全蝎、白術(shù)、白頭翁三味中藥作為藥性基質(zhì)，以球孢白僵菌作為發(fā)酵菌株，制備全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品（SAPZFP）。前期研究表明，SAPZFP超聲水提液與未發(fā)酵品超聲水提液相比，具有更顯著的體外抗腫瘤活性。對(duì)于成分復(fù)雜的中藥來(lái)說(shuō)，不同溶劑提取液的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性與藥物安全性有很大差別[3]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量測(cè)定及MTT法檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)，對(duì)SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分含量及體外抗腫瘤活性進(jìn)行比較，確定更具藥理活性的SAPZFP提取方法，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

FA1204B型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;PHS-25型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;LGJ-18型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）;ST16R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）;UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）;YRE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;HERACELL 150i型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）;生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;CKX41型奧林巴斯顯微鏡（Made in Philippines）;DNM-9602型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）等。

1.2 ?試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼斯特生物技術(shù)有限公司）;牛血清蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;PBS（1×）pH7.2（SparkJade）;RPMI Medium 1640培養(yǎng)基（gibco）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;胰酶細(xì)胞消化液（酚紅，biosharp）;MTT（BioFROXX賽國(guó)生物科技）;福林酚（上海源葉生物科技有限公司）;二甲基亞砜，無(wú)水葡萄糖，亞硝酸鈉，六水氯化鋁，氫氧化鈉，苯酚，硫酸，硫酸銅，酒石酸鉀鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 ?藥材與細(xì)胞株

全蝎購(gòu)自山東省臨沂市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎（Buthus martensii Karsch）;白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根莖、白頭翁為毛茛科植物白頭翁（Pulsatilla chinensis （Bge.） Regel）的干燥根，均購(gòu)自河北省安國(guó)東方藥城，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）要求;球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供;乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及肺腺癌細(xì)胞株A549均由山東省立醫(yī)院提供。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?SAPZFP的制備

精密稱(chēng)定經(jīng)鈷 - 60滅菌的全蝎凍干粉[4]、白術(shù)粗粉、白頭翁粗粉各10.00 g，加入用無(wú)菌水稀釋至1×108個(gè)孢子·mL-1的二代球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）的孢子懸液，攪拌均勻，使?jié)穸冗m宜，于光照自然、溫度25 ℃、濕度大于95%的條件下，約培養(yǎng)7 d，待菌絲長(zhǎng)滿后適時(shí)取出，冷凍干燥即得SAPZFP，并低溫密封保存。

2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的制備

2.2.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取液的制備

取“2.1”項(xiàng)中SAPZFP約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇溶液20 mL，調(diào)節(jié)pH值為9，于頻率80 kHz、輸入功率500 W的條件下，40 ℃恒溫超聲提取50 min后，在4 000 r·min-1、4 ℃條件下離心15 min，將上清液用中速濾紙抽濾后，重復(fù)提取一次，兩次濾液合并，用蒸餾水定容至100 mL，即得SAPZFP的25%醇提液（每個(gè)條件做2個(gè)平行樣）。SAPZFP的50%及75%醇提液同法制備。

2.2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉的制備

按“2.2.1”項(xiàng)中方法制備SAPZFP的25%、50%、75%醇提液，于40 ℃恒溫旋蒸至無(wú)醇味，經(jīng)-18 ℃低溫凍結(jié)后，置于-60℃冷阱中預(yù)凍4 h。將預(yù)凍好的各醇提液置于冷阱腔上方凍干架，在真空度<10 Pa，冷阱溫度-60 ℃的條件下，真空干燥至物料溫度與室溫相同，即得SAPZFP的25%、50%、75%醇提物凍干粉。

2.3 ?SAPZFP不同醇濃度提取液的含量測(cè)定

2.3.1 ?醇溶性總蛋白的含量測(cè)定

采用Lowry法[5]進(jìn)行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總蛋白的含量測(cè)定，以吸光度A1為縱坐標(biāo)、牛血清蛋白質(zhì)量濃度C1（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A1=2.502 4C1+0.009 7（R2=0.998 4），質(zhì)量濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。分別取“2.2.1”項(xiàng)中SAPZFP不同醇濃度提取液1 mL，置10 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線，得SAPZFP不同醇濃度提取液的供試品溶液，精密量取1 mL，進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出醇溶性總蛋白的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測(cè)定3次。

2.3.2 ?醇溶性總多糖的含量測(cè)定

采用苯酚 - 硫酸法[6]進(jìn)行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總多糖的含量測(cè)定，以吸光度A2為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度C2（mg·mL -1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A2=15.149C2+0.004 7（R2=0.999 1），質(zhì)量濃度在0～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。分別取“2.2.1”項(xiàng)中SAPZFP不同醇濃度提取液3 mL，置50 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線，得SAPZFP不同醇濃度提取液的供試品溶液，精密量取2 mL，進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出醇溶性總多糖的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測(cè)定3次。

2.3.3 ?醇溶性總黃酮的含量測(cè)定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法[7]進(jìn)行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總黃酮的含量測(cè)定，以吸光度A3為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度C3 （mg·mL -1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A3=5.505 3C3-0.000 6（R2=0.999 6），質(zhì)量濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。分別取“2.2.1”項(xiàng)中SAPZFP不同醇濃度提取液3 mL，置25 mL具塞試管中，補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出醇溶性總黃酮的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測(cè)定3次。

2.4 ?不同醇濃度提取物凍干粉的體外抗腫瘤研究

2.4.1 ?腫瘤細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存在-80 ℃超低溫冰箱中的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、肺腺癌細(xì)胞株A549快速融化，并用常規(guī)方法復(fù)蘇。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、肺腺癌細(xì)胞株A549均加入含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的條件下靜置培養(yǎng)。適時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)和培養(yǎng)基的變化情況，及時(shí)換液，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化法，按1：2的比例進(jìn)行傳代。

2.4.2 ?不同醇濃度提取物凍干粉溶液的配制

取“2.2.2”項(xiàng)中SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉各約10 mg，精密稱(chēng)定，用無(wú)血清RPMI Medium 1640培養(yǎng)基配成2 mg·mL-1的初始藥物濃度，在超凈工作臺(tái)中，用0.22 μm的針式無(wú)菌過(guò)濾器濾過(guò)后，依次用無(wú)血清RPMI Medium 1640培養(yǎng)基2倍稀釋?zhuān)?、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉溶液，用于下述體外抗腫瘤研究。

2.4.3 ?MTT法檢測(cè)不同醇濃度提取物抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖的能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，用常規(guī)方法進(jìn)行消化，加入無(wú)血清RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，制成密度為1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每個(gè)板預(yù)留5個(gè)調(diào)零孔）。于37℃、5%CO2的條件下靜置培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，24 h后，棄去上清液，加藥組每孔加入“2.4.2”項(xiàng)中不同醇濃度提取物凍干粉配制的不同濃度藥物溶液100 μL（每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔），同時(shí)配制陰性對(duì)照組、100 μg·mL-1的順鉑陽(yáng)性對(duì)照組。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔在避光條件下加入MTT溶液（5 mg·mL-1）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入100 μL的DMSO溶液，37 ℃恒溫震蕩混勻后，選擇492 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色，根據(jù)各孔的吸光度（OD）值，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

抑制率（%）=[1-（加藥組OD值 - 調(diào)零組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值 - 調(diào)零組OD值）]×100%

同法檢測(cè)藥物抑制肺腺癌細(xì)胞株A549體外增殖的能力。

2.5 ?數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel （Office 2010）整合，并通過(guò)SPSS 17.0中Logit模型計(jì)算IC50。

3 ?結(jié) 果

3.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分分析

SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分含量見(jiàn)表1。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，SAPZFP的25%醇提物的各活性成分含量最高，隨著乙醇濃度的增加，醇溶性總蛋白、醇溶性總多糖、醇溶性總黃酮的含量依次降低。

3.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的體外抗腫瘤研究

3.2.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用

SAPZFP不同醇濃度提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見(jiàn)表2。

在各試驗(yàn)藥物濃度下，SAPZFP不同醇濃度提取物均對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的IC50分別為0.183、0.092、0.066 mg·mL-1。

3.2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549的抑制作用（表3）

在各試驗(yàn)藥物濃度下，SAPZFP不同醇濃度提取物均對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549的IC50分別為0.042、0.040、0.022 mg·mL-1。

4 ?結(jié) 論

利用藥用真菌的分解轉(zhuǎn)化能力對(duì)中藥及其復(fù)方進(jìn)行發(fā)酵炮制，可以增強(qiáng)藥效，增加安全性，擴(kuò)大適應(yīng)癥。藥用真菌雙向固體發(fā)酵是以具有活性成分的中藥及其復(fù)方作為藥性基質(zhì)，以藥用真菌作為發(fā)酵菌株的現(xiàn)代固體發(fā)酵[2]。一方面，藥性基質(zhì)能提供藥用真菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)，藥用真菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程也可以產(chǎn)生極具生理活性的次生代謝產(chǎn)物以及幾十種胞外酶，這種強(qiáng)大的酶系能對(duì)藥性基質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行破壁，加速有效成分的溶出，并能夠?qū)λ幮曰|(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而形成新的活性成分或改變各組分間的相互比例;另一方面，藥用真菌作為傳統(tǒng)中藥的一部分，療效確切，安全性較高，通過(guò)發(fā)酵有可能將藥性基質(zhì)中的有毒成分分解轉(zhuǎn)化，從而在一定程度上增加中藥及其復(fù)方的安全性[8]。

本文研究表明：SAPZFP不同醇濃度提取物中，25%醇提物的醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量最高;在體外抗腫瘤研究中，75%醇提物抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、肺腺癌細(xì)胞株A549的體外增殖能力最強(qiáng)，其IC50分別為0.066、0.022 mg·mL-1。由此可見(jiàn)，SAPZFP不同方法提取物的有效成分與藥理活性均存在差異，其中75%醇提物具有更好的體外抗腫瘤活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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