王天石，王馨夢(mèng)，付莉*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000）

胃癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)疾病中發(fā)病率最高的腫瘤之一[1]。目前，臨床治療胃癌的主要手段包括手術(shù)切除、放療、化療等[2]，其中化療藥物主要為小分子藥物，具有較高的毒副作用。為降低化療藥物的毒副作用并延長(zhǎng)患者生存期，臨床上常采用具有抗腫瘤活性的食品進(jìn)行輔助治療。因此，開(kāi)發(fā)出具有抑制腫瘤作用的食品，利用食品進(jìn)行防癌和抗癌更具有實(shí)際意義。當(dāng)今很多國(guó)家都投入巨款開(kāi)發(fā)和使用抗腫瘤食品[3]，我國(guó)也逐漸開(kāi)始重視該方面的研究。

蜂王漿是由5～15 日齡的成年工蜂上顎腺、咽下腺和腦后腺分泌的一種漿狀黏稠物質(zhì)，是蜂王幼蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育期和雄蜂幼蟲(chóng)發(fā)育前期的唯一食物，營(yíng)養(yǎng)非常豐富[4-5]。蜂王漿主要作為保健食品、膳食補(bǔ)充劑及化妝品的原材料，并有潛力成為治療藥物的原材料[6]。營(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為，蜂王漿具有多種生物活性，如抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、增強(qiáng)記憶力[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]、抗菌[11]、修復(fù)組織損傷[12-13]等。蛋白質(zhì)是生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而蜂王漿的重要醫(yī)療保健作用和生物學(xué)功能如抗腫瘤、抗氧化、抗菌等，可能與其中的蜂王漿蛋白密切相關(guān)[14]。JIANG 等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂王漿蛋白對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞具有抗衰老作用；彭瑜等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蜂王漿凍干粉可以提高小鼠脾細(xì)胞的增殖能力。

蛋白質(zhì)作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)入人體后會(huì)被胃蛋白酶、胰蛋白酶、腸肽酶水解，形成多肽、小肽、氨基酸等，其中小肽具有多種生理活性，如抑制細(xì)胞變性、激活細(xì)胞活性、修復(fù)人體變性細(xì)胞等，并且具有低毒性、高活性、易吸收、易穿透腫瘤細(xì)胞等特點(diǎn)[17]。因此，本文通過(guò)體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，探究蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞的影響作用，為其對(duì)抗腫瘤機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為天然抑制腫瘤細(xì)胞物質(zhì)的篩選提供方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蜂王漿（黑龍江省尚志市密山蜂場(chǎng)）；胃癌細(xì)胞SGC-7901、腎上皮細(xì)胞293T（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜、胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰蛋白酶（3 000 U/g）、磷酸鹽緩沖液（均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰酶、改良杜氏伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT］粉末、胎牛血清（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；青霉素、鏈霉素（北京百奧萊博科技有限公司）；p53（53 kDa）抗體、PARP-1（120 kDa）抗體（英國(guó)Abcam公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平，超聲波振蕩器（KQ3200DB 型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），立式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），pH計(jì)（PHS-3C型，上海雷磁儀器廠），真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-18 型，北京松源華興生物技術(shù)有限公司），電熱鼓風(fēng)恒溫箱（DHG-9245A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），倒置顯微鏡（DMI4000B型，德國(guó)萊卡光學(xué)儀器有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus 公司），低速離心機(jī)（L500型，湖南湘儀離心機(jī)有限公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（HBS-1096A 型，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur 型，美國(guó)Becton Dickinson公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物的制備及其消化率的測(cè)定

采用藍(lán)瑞陽(yáng)等[18]的方法并加以修改：40 g 蜂王漿→堿液浸提（料液體積比1∶8，提取90 min，pH 10，提取溫度40 ℃）→離心分離（去沉淀）→調(diào)節(jié)提取液pH值至等電點(diǎn)4.4，沉淀1 h→離心分離→去上清液，留沉淀→透析→冷凍干燥→蛋白制備物。

采用佟立濤等[19]的方法：用蒸餾水配制一定濃度的蜂王漿蛋白溶液，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0，加入胃蛋白酶，在37 ℃恒溫條件下消化酶解2 h。用0.1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH 值至5.3，于100 ℃、5 min后終止酶反應(yīng)，加入胰蛋白酶，再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至7.8，在37 ℃恒溫條件下消化酶解2 h；于100 ℃、5 min 后終止酶反應(yīng)，冷卻，離心，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）檢測(cè)蛋白濃度，然后冷凍，干燥，用0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）溶解劑稀釋至適量濃度，測(cè)定其對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。

式中：M1為樣品的蛋白質(zhì)總質(zhì)量，g；M0為水解液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含有100 μg/mL 青霉素和50 μg/mL 鏈霉素）培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901 和腎上皮細(xì)胞293T。培養(yǎng)條件為在含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)進(jìn)行傳代[20]。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將胃癌細(xì)胞SGC-7901 和腎上皮細(xì)胞293T 接種于6 孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度約為2.5×105個(gè)/孔，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，在胃癌細(xì)胞中加入不同質(zhì)量濃度（0.05、0.1、0.2 mg/mL）的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)，在腎上皮細(xì)胞中加入0.2 mg/mL 的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)。48 h 后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄[21]。

1.3.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞SGC-7901 和腎上皮細(xì)胞293T 按1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，在胃癌細(xì)胞中分別加入0.05、0.1、0.2 mg/mL蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)，在腎上皮細(xì)胞中加入0.2 mg/mL 的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)。連續(xù)培養(yǎng)7～10 d 后，當(dāng)培養(yǎng)孔中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，停止培養(yǎng)。吸棄上清液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS）清洗2～3次。加入4%多聚甲醛固定10 min，吸棄多聚甲醛，用PBS沖洗2～3次，最后每孔用結(jié)晶紫染色液染色15 min，吸棄染色液，用PBS清洗2次后，用相機(jī)拍照觀察集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果[22]。

1.3.5 MTT 實(shí)驗(yàn)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，調(diào)整細(xì)胞濃度，使用96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度約為2 000 個(gè)/孔。于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度（0.05、0.1、0.2 mg/mL）的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物，另設(shè)DMSO 空白對(duì)照組，孵育24～48 h后，在倒置顯微鏡下觀察。然后，每孔加入15 μL MTT 溶液（質(zhì)量濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。最后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570 nm 處測(cè)量各孔的吸光度。同時(shí)，設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。

1.3.6 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，接種于6孔板中，每孔2 mL，于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入含有不同質(zhì)量濃度（0.05、0.1、0.2 mg/mL）蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物的新鮮培養(yǎng)基溶液，每孔2 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加PBS 重懸、潤(rùn)洗1 次，再1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL 預(yù)冷的70%乙醇，輕輕混勻，4 ℃固定至少20 min，接著1 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷的PBS 潤(rùn)洗2 次，棄去PBS，加1 mL 碘化丙啶（PI）染液，37 ℃水浴30 min，最后3 000 r/min離心30 s，去掉部分上清液，與沉淀混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[23]。

1.3.7 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，接種到6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，加入不同質(zhì)量濃度的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌1次，然后加入1 mL結(jié)合緩沖液（1×）吹打混勻，離心10 min，棄上清液，再加入1 mL 結(jié)合緩沖液（1×）混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106mL-1。每管取100 μL 懸液，加5 μL 膜聯(lián)蛋白V-PE（細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒）輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加5 mL 7-氨基放線(xiàn)菌素D（7-AAD）染液輕輕混勻，室溫避光孵育5 min，加入500 μL PBS混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[24]。

1.3.8 蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

收集經(jīng)不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物誘導(dǎo)后的胃癌細(xì)胞SGC-7901，用PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min，1.2×104r/min 離心20 min 后收集上清液，進(jìn)行蛋白定量，然后加入5×上樣緩沖液煮樣5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene fluoride, PVDF）膜上，室溫封閉2 h，與一抗（1∶5 000 p53、1∶5 000 PARP-1和1∶1×104actin）4 ℃孵育16～18 h，用含吐溫的Tris緩沖鹽水（Tris buffered saline with Tween,TBST）洗膜3次，每次5 min，與二抗室溫孵育2 h，取出PVDF膜，用TBST 洗3 次，每次5 min。最后一次洗膜后，留少量TBST，將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）試劑盒內(nèi)的A 液與B 液等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間并分析[25]。采用Image J 軟件計(jì)算蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/肌動(dòng)蛋白（actin）條帶灰度值。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的蜂王漿蛋白消化產(chǎn)物的消化率

體外消化模擬實(shí)驗(yàn)可以準(zhǔn)確模擬體內(nèi)消化生理過(guò)程，操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好。經(jīng)檢測(cè)，樣品中蛋白質(zhì)總量為2 g，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解作用后，水解液中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量為0.57 g，蜂王漿蛋白的體外消化率達(dá)到71.5%。從此結(jié)果可以得知，蜂王漿蛋白是一種易消化的物質(zhì)，適用于人體的消化吸收。

2.2 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

如圖1 所示：與DMSO 對(duì)照組相比，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)腎上皮細(xì)胞293T 形態(tài)、密度均無(wú)可見(jiàn)影響；DMSO 對(duì)照組胃癌細(xì)胞SGC-7901 形態(tài)飽滿(mǎn)，排列緊密，而經(jīng)過(guò)蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物干預(yù)48 h 后的胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮，密度降低，數(shù)目減少。且在蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)，胃癌細(xì)胞數(shù)目最少，皺縮最為明顯，0.1 mg/mL 質(zhì)量濃度的影響次之。由此得出，在誘導(dǎo)時(shí)間相同情況下，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞形態(tài)的影響具有濃度依賴(lài)趨勢(shì)，對(duì)正常細(xì)胞可能未產(chǎn)生影響，而對(duì)胃癌細(xì)胞具有抑制作用，且抑制效果與蜂王漿蛋白濃度呈正相關(guān)。

2.3 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞集落形成能力的影響

如圖2～3 所示，在誘導(dǎo)時(shí)間相同條件下，與DMSO對(duì)照組相比，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)腎上皮細(xì)胞293T的集落形成能力沒(méi)有抑制效果，反而有促進(jìn)作用，而對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 的集落形成能力具有明顯抑制效果，其中在蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)，抑制效果最為明顯，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)效果次之。由此得知，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞的集落形成能力具有抑制作用，且具有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。

2.4 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products on cell morphology

圖2 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞集落形成能力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products on cell colony forming ability

圖3 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞集落形成數(shù)目的影響Fig.3 Effect of different concentrations of royal jelly proteinin vitro digestion products on cell number

由表1可知，與DMSO對(duì)照組相比，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，抑制率隨濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，其中，在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，經(jīng)24 h和48 h培養(yǎng)后蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞抑制率最高，分別達(dá)到（57.58±3.48）%和（62.84±1.98）%。由此表明，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制能力具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

2.5 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)經(jīng)蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物干預(yù)后的細(xì)胞周期分布進(jìn)行了檢測(cè)。如圖4及表2所示，與DMSO空白對(duì)照組相比，隨著蜂王漿蛋白質(zhì)量濃度的升高，胃癌細(xì)胞SGC-7901 中G1期細(xì)胞占比升高，S期細(xì)胞占比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明蜂王漿蛋白作用于SGC-7901 細(xì)胞48 h 后，DNA 合成受阻，細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖受到抑制。

2.6 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

本實(shí)驗(yàn)采用7-AAD和PE雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5 所示。添加蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)后，與空白對(duì)照組相比，各組早期凋亡率和晚期凋亡率均有增加；當(dāng)蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，凋亡率最高。SGC-7901 細(xì)胞凋亡率隨蛋白體外消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度升高而逐漸增加，表明蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率的影響Table 1 Effect of different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products on proliferation inhibition rate of gastric cancer cells

表2 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物誘導(dǎo)48 h后對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響Table 2 Effects of different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products on cycle of gastric cancer cells induced for 48 h

圖4 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物誘導(dǎo)48 h后胃癌細(xì)胞的流式細(xì)胞周期圖Fig.4 Cycles of gastric cancer cells induced by different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products for 48 h by flow cytometry

圖5 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞48 h后的流式細(xì)胞凋亡圖Fig.5 Apoptosis of gastric cancer cells induced by different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products for 48 h by flow cytometry

2.7 蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 信號(hào)通路蛋白p53 和PARP-1 的影響

如圖6 所示：0.1 mg/mL 的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物能顯著激活p53 蛋白的表達(dá)（P＜0.05），且隨著蛋白消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高，p53 蛋白表達(dá)量增加。0.05 mg/mL 的蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物能顯著下調(diào)PARP-1 蛋白的表達(dá)（P＜0.05），且隨著蛋白體外消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，PARP-1 蛋白表達(dá)量減少。此結(jié)果從蜂王漿蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 的作用方面進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，表明蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖確實(shí)具有抑制作用，說(shuō)明蜂王漿蛋白具有成為一種新型抗胃癌食品添加劑的潛力。

圖6 不同質(zhì)量濃度蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)胃癌細(xì)胞中p53和PARP-1表達(dá)的影響Fig.6 Effect of different concentrations of royal jelly protein in vitro digestion products on expression levels of p53 and PARP-1 in gastric cancer cells

3 討論

胃癌是臨床上威脅人類(lèi)健康最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位于所有腫瘤的第6位，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[26]。在食品領(lǐng)域，已有采用黑茶藨子（黑加侖）、綠豆、獼猴桃等多種天然產(chǎn)物來(lái)探究對(duì)胃癌細(xì)胞影響的研究。本實(shí)驗(yàn)中，以蜂王漿蛋白為原料，采用體外消化模擬實(shí)驗(yàn)制備蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物，通過(guò)細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察和集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物對(duì)腎上皮細(xì)胞293T的形態(tài)沒(méi)有造成影響，而對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的形態(tài)和集落形成能力具有明顯抑制效果。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂王漿蛋白體外消化物對(duì)SGC-7901 的生長(zhǎng)增殖具有明顯的抑制作用，且具有時(shí)間、劑量依賴(lài)性，與王勇姿等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出蜂王漿蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響效果一致。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡過(guò)程發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物誘導(dǎo)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901中G1期細(xì)胞占比升高，S 期細(xì)胞占比降低，DNA 合成受阻，引發(fā)細(xì)胞凋亡增多。這與陳立軍等[28]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出蜂王漿在體內(nèi)抑制腫瘤的機(jī)制與其促進(jìn)腫瘤組織壞死和細(xì)胞凋亡有關(guān)的結(jié)論一致。

p53蛋白被稱(chēng)為基因組的守護(hù)者，當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，p53 在DNA 的損傷修復(fù)中起著重要作用，是腫瘤的抑制基因[29]。PARP-1 是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族中的一員，其催化活性約占家族酶活性的90%以上[30]，在多種癌細(xì)胞及組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，蜂王漿蛋白顯著上調(diào)了SGC-7901細(xì)胞中p53 蛋白的表達(dá)，同時(shí)，下調(diào)了PARP-1 蛋白的表達(dá)，且蛋白表達(dá)水平與蜂王漿濃度相關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)表明蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖并引起凋亡，其機(jī)制可能與p53蛋白表達(dá)上調(diào)、PARP-1蛋白表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，為胃癌的藥物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，蜂王漿蛋白體外消化產(chǎn)物作為新一代抗腫瘤天然食品具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。