朱衛(wèi)星，成聰聰，甘國興，申 雪，袁月梅，姚美村*

(1. 清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510； 2. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

金盞銀盤(Bidensbiternata(Lour.) Merr. et Sherff.)是菊科鬼針草屬植物，以全草入藥，始載于唐代《本草拾遺》，味苦、平，無毒[1-2]，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒之效，臨床用于治療風(fēng)熱感冒、毒蛇咬傷、腸癰、濕熱瀉痢，也可外用于痔瘡等[3]。研究發(fā)現(xiàn)鬼針草屬植物主要含黃酮類、聚炔苷、苯丙素類、氨基酸及揮發(fā)油等多種成分，具有抑菌、保護(hù)心血管、抗炎鎮(zhèn)痛、抗干眼、抗衰老等多種藥理活性，常用于感冒、闌尾炎、痢疾、胃痛、高胰島素血癥等疾病的防治[4-7]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，藥物治療疾病的研究已進(jìn)入到細(xì)胞層面和基因水平[8]。不同于化學(xué)藥單靶點、高選擇性的特征，中藥具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，這種復(fù)雜性常常使得中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚[9]，很大程度上限制了對中藥的深入研究。但隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，通過網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示藥物多成分協(xié)同作用的機(jī)理已成為可能；而且這種研究方法與中醫(yī)藥整體觀和辨證論治等不謀而合，為中藥研究從系統(tǒng)生物學(xué)角度提供了新的思路與研究方法[10-11]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路和方法，以傳統(tǒng)藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，網(wǎng)絡(luò)功能模塊識別為技術(shù)手段，利用相關(guān)軟件構(gòu)建“成分-靶點和成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，分析和預(yù)測鬼針草屬植物金盞銀盤治療多種疾病的分子機(jī)制，為金盞銀盤研究的深入開展和臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 金盞銀盤活性成分選擇

經(jīng)過前期實驗結(jié)果和查閱文獻(xiàn)，本研究選擇金盞銀盤中16個活性成分作為研究對象，其中將新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C異構(gòu)體分別整合作為一個成分，最終確定12個活性成分進(jìn)行研究。結(jié)果見表1。

1.2 活性成分潛在靶點預(yù)測

將上述化合物導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫，尋找主要活性成分相關(guān)的潛在靶點，其中Okanin-O-glucoside，Okanin，Tricin-7-O-β-D-glucoside，Tri-caffeoylquinic acid等4個成分利用PubChem BioActivity Analysis Service[12]獲得其潛在作用靶標(biāo)。將候選化合物對應(yīng)的靶點蛋白根據(jù)Uniport進(jìn)行統(tǒng)一編號，同時獲得靶點相應(yīng)的基因名稱，共獲得58個靶點。

表1 金盞銀盤的活性成分

1.3 關(guān)鍵靶點的GO生物學(xué)過程注釋

應(yīng)用STRING v10.5 數(shù)據(jù)庫對金盞銀盤中關(guān)鍵靶點進(jìn)行基因本體Gene Ontology(GO)富集，分析靶點蛋白在體內(nèi)可能的生物學(xué)過程。選擇GO中生物過程、分子功能和細(xì)胞組成3個模塊對基因進(jìn)行注釋，并繪制GO富集分析中相關(guān)條目的條形圖，以便更直觀的解釋。

1.4 信號通路分析

應(yīng)用STRING v10.5數(shù)據(jù)庫對金盞銀盤中關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG信號通路富集，物種和背景均為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，研究靶點蛋白與可能疾病之間的關(guān)系，明確金盞銀盤可能的藥理機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 成分—靶點網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的12個活性成分和靶點構(gòu)建“成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。其中包含70個節(jié)點(12個活性成分節(jié)點和58個靶點節(jié)點)，共189條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，每條邊代表成分與靶點的潛在聯(lián)系，而一個節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連路線的條數(shù)，表2列出了化合物—靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點及度值，其中前列腺素G / H合成酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，P35354)，蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，P18031)，胰蛋白酶1(Trypsin-1，P07477)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(DNA topoisomerase II，P11388)，凝血因子Xa(Coagulation factor Xa，P00742)等靶點出現(xiàn)的頻率較高，表明活性成分在靶點上具有協(xié)同性，且貢獻(xiàn)多重藥理作用，可能是金盞銀盤發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

圖1 金盞銀盤中的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Compound-target networks in B. biternata

蛋白編號 Protein number靶點蛋白 Target protein度值 Value基因靶點 Gene targetP35354Prostaglandin G/H synthase 27PTGS2P18031mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 16PTPN1P07477Trypsin-13PRSS1P11388DNA topoisomerase II3TOP2AP00742Coagulation factor Xa3F10P11473Vitamin D3 receptor isoform VDRA2VDRP01375Tumor necrosis factor2TNFQ9NPD5Solute carrier organic anion transporter family member 1B32SLCO1B3Q9Y6L6Solute carrier organic anion transporter family member 1B12SLCO1B1P23219Prostaglandin G/H synthase 12PTGS1

2.2 GO功能富集分析

GO富集分析作為一種基因功能分類的系統(tǒng)，金盞銀盤活性成分的GO生物學(xué)過程富集結(jié)果見圖2。結(jié)果表明58個靶點可以參與體內(nèi)638個生物學(xué)過程，其中分子功能、細(xì)胞組分及生物過程3個部分分別富集到33，26，579個條目。其分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、催化活性及受體結(jié)合等方面；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞器、膜封閉腔、外泌體、細(xì)胞質(zhì)及囊泡等方面；生物過程主要涉及對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、單一生物代謝、代謝過程調(diào)節(jié)、內(nèi)源性刺激、細(xì)胞對化學(xué)刺激反應(yīng)及對含氧化合物的反應(yīng)等方面。

圖2 GO條目在生物過程、細(xì)胞組成、分子功能上的分布(FDR<0.05)Fig. 2 GO terms for biological processes, cell composition and molecular functions(FDR<0.05)

2.3 KEGG信號通路分析

利用STRING平臺對58個關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG通路富集，根據(jù)FDR(FDR<0.05)得到113條信號通路，運(yùn)用京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋和分析，共包括6大類，其中與人類疾病相關(guān)通路共49條，與有機(jī)體系相關(guān)通路共37條，與環(huán)境信號處理系統(tǒng)共14條，與細(xì)胞過程相關(guān)通路共4條，與代謝相關(guān)通路共8條，與遺傳信息處理相關(guān)通路共1條。表3根據(jù)FDR值列出最為顯著的22條通路分析結(jié)果，分析表明阿米巴原蟲病(S1)在人類疾病(傳染病)相關(guān)通路中最為顯著、5-羥色胺能突觸(S4)在神經(jīng)系統(tǒng)信號通路中富集最為顯著且在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中HIF-1信號通路(S9)r及TNF信號通路(S10)較為顯著，表明這些通路分別與傳染病、神經(jīng)系統(tǒng)及炎癥疾病等密切相關(guān)(見圖3)。

表3 潛在作用通路

續(xù)表3

編號Number通路名稱Pathway通路分類Classification基因數(shù)Gene numberFDRS17hsa05161:Hepatitis BHuman Diseases72.30E-06S18hsa04064:NF-kappa B signaling pathwaySignal transduction62.88E-06S19hsa05144:MalariaHuman Diseases52.91E-06S20hsa04620:Toll-like receptor signaling pathwayOrganismal Systems65.88E-06S21hsa05166:HTLV-I infectionHuman Diseases86.88E-06S22hsa05145:ToxoplasmosisHuman Diseases69.86E-06

圖3 信號通路富集分析Fig. 3 Frichment analysis of signal pathway

利用Cytoscape 軟件構(gòu)建金盞銀盤主要活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，12個成分，58個蛋白與113條信號通路之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖4。由圖可見，金盞銀盤的活性成分可通過不同的靶點蛋白在不同代謝通路及疾病中發(fā)揮作用，這與中藥“多組分，多靶點”的作用機(jī)理相一致。

3 討論

為探究金盞銀盤的作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念對金盞銀盤中活性成分進(jìn)行了靶點預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，挖掘金盞銀盤活性成分、靶點蛋白、信號通路3個節(jié)點網(wǎng)絡(luò)的特征信息。結(jié)果表明，金盞銀盤中12個活性成分，可作用于不同的靶點，關(guān)聯(lián)的信號通路有113條，這說明中藥確有多成分-多靶點-多通路的作用特點。在成分靶點分析中，前列腺素G / H合成酶2(P35354)、蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(P18031)、胰蛋白酶1(P07477)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(P11388)、凝血因子Xa(P00742)等靶點的關(guān)聯(lián)度較高，提示這些靶點可能是金盞銀盤活性成分發(fā)揮作用的主要靶標(biāo)。而在關(guān)聯(lián)信號通路分析中發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲病(S1)、5-羥色胺能突觸(S4)、HIF-1信號通路(S9)、TNF信號通路(S10)等在人類疾病(傳染病)通路、神經(jīng)系統(tǒng)信號通路及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的富集最為顯著，這可能與金盞銀盤在治療炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病方面的作用相關(guān)。

圖4 金盞銀盤中的活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Compound—target protein—signaling pathway network in B. biternata

通過對金盞銀盤活性成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化和抗炎可能是金盞銀盤中主要的藥理作用。金盞銀盤中蘆丁、金絲桃苷、綠原酸等成分，可作用于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基(PIK3CG)、白細(xì)胞介素-8(IL8)、腫瘤壞死因子(TNF)、淀粉樣β蛋白(APP)、前列腺素G / H合成酶2(PTGS2)等關(guān)鍵靶點，參與調(diào)控Toll樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，這可能是其參與抗氧化、抗炎的可能機(jī)制之一。林海英[13]通過采用急性炎癥模型和免疫炎癥模型來研究鬼針草總黃酮的抗炎作用機(jī)制，結(jié)果表明鬼針草總黃酮可降低模型大鼠中TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8的表達(dá)，其抗炎機(jī)制可能直接通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放來實現(xiàn)。胡宗福等[14]研究顯示綠原酸具有清除氧自由基的作用，且清除能力與濃度相關(guān)。都波等[15]也通過體外抗氧化實驗來說明金盞銀盤黃酮類成分對自由基有較好的清除作用。以上文獻(xiàn)研究均可說明金盞銀盤具有明顯的抗氧化和抗炎作用。

肝纖維化是一個病理生理過程，白細(xì)胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等均可能參與慢性肝損傷所致的肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，與失常期肝硬化密切相關(guān)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)鬼針草中總黃酮具有保肝、抗肝纖維化的作用[18]，對CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化可抑制其氧自由基的形成，從而達(dá)到治療作用[19]；本研究發(fā)現(xiàn)金盞銀盤能作用于白細(xì)胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、轉(zhuǎn)錄因子p65、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子等關(guān)鍵靶點，并顯著投射到磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)與NF-κB兩個KEGG信號通路中，說明金盞銀盤等鬼針草屬植物抗肝纖維化的靶點與信號通路是客觀存在的。

糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素分泌相對或絕對不足而引起的高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，常導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，如神經(jīng)病變、腦血管病變、腎病等[20-22]。其中糖尿病腎病是糖尿病微血管病變重要的并發(fā)癥，與mTOR信號通路及HIF-1信號通路等密切相關(guān)[23]，在糖尿病腎病小鼠中，HIF-1可能是導(dǎo)致腎臟纖維化和腎小球硬化的主要影響因子[24]。在糖尿病中胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特點，鬼針草總黃酮通過干預(yù)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來改善細(xì)胞胰島素抵抗的作用[25]；Andeysen等[26]研究表明，綠原酸類物質(zhì)在動物體內(nèi)有降糖作用，其機(jī)制可能與抑制葡萄糖-6-磷酸位移酶和葡萄糖吸收有關(guān)；本研究也發(fā)現(xiàn)金盞銀盤能作用于胰島素受體、腫瘤壞死因子、蛋白激酶及磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、PKA催化亞基受體等靶點，參與生物代謝、內(nèi)源性刺激及調(diào)節(jié)蛋白激酶活性等GO生物過程，調(diào)控PI3K/AKT/mTOR、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、HIF-1等相關(guān)信號通路，進(jìn)一步證明金盞銀盤具有治療糖尿病及其并發(fā)癥的療效，可為深入研究其作用機(jī)制提供參考。

已有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸具有顯著的體外抗病毒作用，對枯草桿菌、軍團(tuán)菌等能顯著抑制其生長[27]，且鬼針草水提物與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用可降低其最小抑菌濃度[28]。本研究還發(fā)現(xiàn)金盞銀盤可在阿米巴病、軍團(tuán)病、甲型流感、瘧疾等KEGG通路顯著富集，推測其抑菌、抗病毒及預(yù)防感冒的作用機(jī)制可能與這些通路相關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)金盞銀盤能作用于前列腺素合成酶、Caspase-3、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄因子p65等靶點，參與催化活性、蛋白結(jié)合等分子功能，以及細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖、脂多糖調(diào)節(jié)等生物過程，涉及5-羥色胺能突觸、腫瘤調(diào)控、花生四烯酸代謝、神經(jīng)退行性疾病等KEGG信號通路，因此推測金盞銀盤可能還具有抗腫瘤、抗?jié)?、治療胃腸道疾病、參與花生四烯酸代謝、對心血管系統(tǒng)的保護(hù)等作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，對金盞銀盤提取物的主要成分、靶點、信號通路進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)金盞銀盤不僅具有抗炎及抗氧化、對肝臟保護(hù)、治療糖尿病等藥效作用，還可能具有抗腫瘤、治療胃腸道疾病、保護(hù)心血管等作用，這對于解釋金盞銀盤的多成分、多靶點、多途徑的藥理作用提供了科學(xué)支持，為更深入研究和開發(fā)提供了參考。