趙晨陽 李瓊

作者單位：423000 郴州 郴州市第一人民醫(yī)院1婦科，2產(chǎn)科

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是其發(fā)生的主要原因［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達(dá)與宮頸癌的惡性表型及不良預(yù)后密切相關(guān)，微小RNA（miRNA）也與宮頸癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等相關(guān)，可作為宮頸癌診斷、預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)和治療的潛在靶點(diǎn)［3-4］。MAFG反義RNA 1（MAFG-AS1）是一種lncRNA，在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)［5］。MO 等［6］基于 lncRNA 蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的lncRNA功能注釋發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1與胃癌代謝相關(guān)過程有關(guān)。MAFG-AS1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖［7］。但lncRNA MAFG-AS1與宮頸癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)miR-143可通過靶向K-ras抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖［8］。TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示lncRNA MAFG-AS1 3′UTR區(qū)域與miR-143-3p有結(jié)合位點(diǎn)。本文探討lncRNA MAFG-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及其是否通過靶向調(diào)控miR-143-3p發(fā)揮作用，為宮頸癌精準(zhǔn)靶向治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集郴州市第一人民醫(yī)院2016年1月至2019年1月手術(shù)切除的20例宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診；⑵術(shù)前1個(gè)月未經(jīng)放化療。排除合并其他惡性腫瘤者及有嚴(yán)重心、肝、腎等器官功能障礙者。本研究經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料和儀器

宮頸癌細(xì)胞Hela購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。Lipofec-tamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、BCA試劑盒購自Sigma公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所有抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞Hela用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)，加入胰蛋白酶，消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)轉(zhuǎn)染。將 miR-NC、miR-143-3p、si-NC、si-MAFGAS1、pcDNA和pcDNA-MAFG-AS1分別轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，并分別記為miR-NC組、miR-143-3p mimics組、si-NC組、si-MAFG-AS1組、pcDNA組和 pcDNAMAFG-AS1組；將si-MAFG-AS1分別與anti-miR-NC和anti-miR-143-3p共同轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，記為si-MAFG-AS1+anti-miR-NC組和si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染。

1.5 qRT-PCR檢測miR-143-3p和MAFG-AS1 mRNA的表達(dá)水平

收集以上各組細(xì)胞，提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系。miR-143-3p和MAFGAS1分別以U6和GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-143-3p正向引物序列：5'-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGCAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-CGCTTCGGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；MAFG-AS1 正向引物序列：5'-CGGGAGGAAGATAAACGGGG-3'，反向引物序列：5'-TGACCACGGAACACCTTCAG-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物序列：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況

收集以上各組細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗人Cyclin D1抗體（稀釋比例為1:1 000）、兔抗人p21抗體（稀釋比例為 1:800）、兔抗人p27抗體（稀釋比例為 1:800）、兔抗人Bcl-2抗體（稀釋比例為1:800）、兔抗人Bax抗體（稀釋比例為1:800）、兔抗人Cleaved-Caspase-3抗體（稀釋比例為1:1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（稀釋比例為 1:2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，曝光顯影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

以上各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μL（5 g/L）MTT 溶液，繼續(xù)孵育 4 h；加入 150 μL DMSO振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值（OD）。細(xì)胞增殖率（%）=［實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值］×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞并重懸。按試劑盒說明書先后加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm處和發(fā)射波長530 nm處熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測MAFG-AS1對(duì)miR-143-3p的靶向調(diào)控

TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示MAFG-AS1 3′UTR區(qū)域存在miR-143-3p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn) MAFG-AS1的 3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體（WT-MAFG-AS1和MUT-MAFG-AS1），取對(duì)數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞接種于24孔板（5×104個(gè)/孔），待細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)，將WT-MAFG-AS1和MUT-MAFG-AS1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后再分別轉(zhuǎn)染miR-143-3p和miR-NC。隨后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAFG-AS1和miR-143-3p在不同宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織中MAFG-AS1 mRNA表達(dá)水平升高（0.905±0.115vs2.835±0.164，t=43.091，P<0.001，圖 1A），miR-143-3p表達(dá)水平降低（0.944±0.075vs0.382±0.071，t=24.336，P<0.001，圖 1B）；與正常宮頸細(xì)胞株相比，宮頸癌細(xì)胞Hela中MAFG-AS1 mRNA的表達(dá)升高（P<0.001，圖 1C），miR-143-3p表達(dá)降低（P<0.001，圖 1D）。

圖1 MAFG-AS1和miR-143-3p在不同宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expressions of MAFG-AS1 and miR-143-3p in cervical cancer tissues and cell lines

2.2 下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖活性

qRT-PCR檢測結(jié)果（圖2A）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞中 MAFG-AS1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（t=18.581，P<0.001）。MTT法檢測結(jié)果（圖2B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞增殖活性顯著降低（t48h=11.713，P48h<0.001；t72h=13.904，P72h<0.001）。Western blot檢測結(jié)果（圖2C）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=13.396，P<0.001），而p21和p27蛋白表達(dá)水平顯著升高（tp21=13.396，Pp21<0.001；tp27=15.949，Pp27<0.001）。

圖2 下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of down-regulation of MAFG-AS1 expression on proliferation of cervical cancer Hela cells

2.3 下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖3A）顯示，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞凋亡率高于 si-NC 組（21.43±2.14vs6.57±0.68，t=19.854，P<0.001）。Western blot檢測結(jié)果（圖3B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=20.572，P<0.001），Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（tBax=13.768，PBax<0.001；tCleaved-Caspase-3=16.994，PCleaved-Caspase-3<0.001）。

2.4 miR-143-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活和凋亡的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果（圖4A）顯示，與miR-NC組相比，miR-143-3pmimics組 Hela細(xì)胞 miR-143-3p的表達(dá)水平顯著升高（t=19.409，P<0.001）。MTT法檢測結(jié)果（圖4B）顯示，miR-143-3p mimics組Hela細(xì)胞增殖活性較miR-NC組顯著降低（t48h=7.905，P48h<0.001；t72h=10.535，P72h<0.001）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖4C）顯示，相較miR-NC組，miR-143-3p mimics組Hela細(xì)胞凋亡率顯著升高［（7.46±0.69）%vs（19.37±1.84）%，t=18.182，P<0.001］。Western blot檢測結(jié)果（圖 4D）顯示，與miR-NC組相比，miR-143-3p mimics組Hela細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（tCyclinD1=11.649，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=15.205，PBcl-2<0.001），p21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（tp21=17.493，Pp21<0.001；tBax=14.575，PBax<0.001）。

圖3 下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down-regulation of MAFG-AS1 expression on apoptosis of cervical cancer Hela cells

2.5 MAFG-AS1靶向調(diào)控miR-143-3p的表達(dá)

熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5A）顯示，與miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-143-3p的WT-MAFG-AS1 Hela細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（t=17.972，P<0.001）；轉(zhuǎn)染miR-143-3p的MUT-MAFG-AS1 Hela細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.498，P=0.625）。qRT-PCR檢測結(jié)果（圖5B）顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-MAFG-AS1組細(xì)胞miR-143-3p表達(dá)水平顯著降低（t=10.198，P<0.001）；si-MAFG-AS1 組細(xì)胞miR-143-3p表達(dá)水平較si-NC組顯著升高（t=21.477，P<0.001）。

2.6 抑制miR-143-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果（圖6A）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞miR-143-3p的表達(dá)水平顯著升高（t=16.312，P<0.001）；與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細(xì)胞miR-143-3p的表達(dá)水平顯著降低（t=10.651，P<0.001）。MTT法檢測結(jié)果（圖6B）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞增殖活性顯著降低（t48h=11.245，P48h<0.001；t72h=14.945，P72h<0.001）；與 si-MAFGAS1+anti-miR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細(xì)胞增殖活性顯著升高（t48h=7.965，P48h<0.001；t72h=11.347，P72h<0.001）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖6C）顯示，相較于si-NC組，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞凋亡率顯著升高［（7.25±0.71）%vs（22.43±2.48）% ，t=17.654，P<0.001］； 與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細(xì)胞凋亡率顯著降低 ［（23.69±2.51）%vs（14.76±1.52）%，t=9.130，P<0.001］。Western blot檢測結(jié)果（圖6D）顯示，與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Hela細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（tCyclinD1=15.372，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=22.687，PBcl-2<0.001），而p21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（tp21=16.012，Pp21<0.001；tBax=14.14，PBax<0.001）；與 si-MAFG-AS1+antimiR-NC組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-143-3p組Hela細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高（tCyclinD1=12.540，PCyclinD1<0.001；tBcl-2=17.755，PBcl-2<0.001），p21、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低（tp21=10.776，Pp21<0.001；tBax=9.303，PBax<0.001）。

圖4 miR-143-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of miR-143-3p overexpression on proliferation and apoptosis of cervical cancer Hela cells

圖5 MAFG-AS1靶向調(diào)控miR-143-3p表達(dá)Fig.5 MAFG-AS1 targeted the regulation of miR-143-3p expression

3 討論

研究報(bào)道分子靶向藥物在宮頸癌治療中具有巨大潛力［9］。CUI等［10］研究發(fā)現(xiàn) MAFG-AS1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，MAFG-AS1可通過調(diào)控miR-147b和NDUFA4表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制細(xì)胞凋亡。lncRNA MAFG-AS1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)亦上調(diào)，且可通過調(diào)控miR-339-5p/MMP15促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；且抑制增殖相關(guān)蛋白Bcl-2和Cyclin D1表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Cleaved-Caspase-3、p21、p27表達(dá)。

miRNA在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［12］。研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織和細(xì)胞中miR-143-3p低表達(dá)，上調(diào)miR-143-3p表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。E3泛素連接酶可通過靶向miR-143促進(jìn)宮頸癌生長［14］。miR-143-3p也參與了各種癌癥進(jìn)展，如miR-143-3p可促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展［15］，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［16］。在乳腺癌細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-143-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［17］。本研究結(jié)果同樣顯示miR-143-3p在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，miR-143-3p過表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖6 抑制miR-143-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)MAFG-AS1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖活性和凋亡的影響Fig.6 Inhibition of miR-143-3p expression reversed the effect of down-regulating MAFG-AS1 expression on proliferation and apoptosis of Hela cells

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA主要作為miRNA的前體，與miRNA競爭性結(jié)合mRNA及通過“海綿效應(yīng)”調(diào)控miRNA；而miRNA可直接結(jié)合lncRNA或通過中間因子間接調(diào)控lncRNA，兩者共同形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［18］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MAFG-AS1可通過調(diào)控miR-147b和miR-339-5p而影響結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展［12-13］。lncRNA-UCA1可以靶向調(diào)節(jié)mi-R143而影響前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡［19］；lncRNA-SARCC通過改變miR-143-3p信號(hào)抑制腎細(xì)胞癌進(jìn)展［20］。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNAMAFG-AS1可靶向調(diào)控miR-143-3p表達(dá)，且抑制miR-143-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)下調(diào)MAFG-AS1對(duì)Hela細(xì)胞抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。

綜上所述，lncRNA MAFG-AS1可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與靶向miR-143-3p有關(guān)，lncRNA MAFG-AS1有望成為宮頸癌的預(yù)防和治療新靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，且lncRNA MAFG-AS1調(diào)控miR-143-3p而影響宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的下游分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。