焦 悅,王思曼,趙喜蘭,張培培,鄭慧敏,李在峰,劉大群，2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，中國(guó) 北京 100081)

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起的小麥常見(jiàn)病害之一，該病害為氣傳真菌病害，嚴(yán)重危害小麥的生長(zhǎng)發(fā)育，在流行年份造成的產(chǎn)量損失可達(dá)50%左右[1]。目前，化學(xué)防治能有效控制小麥葉銹病，但過(guò)量使用化學(xué)藥劑不僅會(huì)造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，還容易使小麥葉銹菌產(chǎn)生抗性。因此，培育和合理利用抗病品種是解決該病害最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的措施[2]。一般小麥對(duì)葉銹病的抗性分為小種專(zhuān)化抗性和非小種專(zhuān)化抗性，小種專(zhuān)化抗性由單基因或少數(shù)基因控制，又叫垂直抗性或苗期抗性，這種抗性易隨病原菌生理小種的變異而喪失。非小種專(zhuān)化抗性由多個(gè)微效基因控制，也稱(chēng)為水平抗性或成株期抗性，在苗期表現(xiàn)感病，在成株期具有較低的發(fā)病嚴(yán)重度并且抗性持久[3-4]，亦稱(chēng)為慢銹性。非小種專(zhuān)化抗病基因目前廣泛用于培育具有持久抗病性品種[5]。目前，已發(fā)現(xiàn)的小麥抗葉銹基因有100多個(gè)，被正式命名的有79個(gè)[6]，大部分為苗期抗病基因，其中Lr34[7]、Lr46[8]、Lr67[9]和Lr68[10]為非小種專(zhuān)化抗病基因，亦稱(chēng)為成株期慢銹基因。

目前，人們一般利用基因推導(dǎo)并借助分子標(biāo)記鑒定小麥抗葉銹基因。由LOEGERING等[11]提出的基因推導(dǎo)法，是以FLOR[12]提出的基因?qū)蚣僬f(shuō)為依據(jù)，在含有已知小麥葉銹病抗性基因的近等基因系(或單基因系)和試驗(yàn)材料上接種不同毒力的菌種，然后分別將試驗(yàn)材料的侵染型與近等基因系的侵染型進(jìn)行對(duì)比，以此推導(dǎo)出供試材料中所攜帶的抗病基因。BROWDER[13]利用近等基因系成功推導(dǎo)出了Lr1和Lr10。LI等[14]鑒定了102個(gè)中國(guó)小麥材料，推導(dǎo)出Lr1、Lr2a、Lr3bg、Lr3ka、Lr14a、Lr16、Lr17a、Lr18、Lr20、Lr23、Lr24、Lr26、Lr34、LrZH84共14個(gè)基因可能存在于65個(gè)品種(系)中，在 37個(gè)品種(系)中可能含有未知抗病基因。GAO等[15]運(yùn)用基因推導(dǎo)結(jié)合分子標(biāo)記在四川省小麥材料中鑒定出Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr30、Lr36、Lr15、Lr37和Lr46共9個(gè)抗病基因。對(duì)50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)的抗葉銹病基因進(jìn)行苗期和成株期抗性鑒定，為培育抗病品種提供遺傳信息支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)、36個(gè)含有已知小麥抗葉銹基因的載體品種(單基因系)，苗期感病對(duì)照品種(CK)為鄭州5389、成株期慢銹對(duì)照品種(CK)為SAAR，以上材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥銹病研究中心提供。用于苗期基因推導(dǎo)的20個(gè)葉銹菌生理小種為PHST、PRSQ、FHTQ、PHJM、KHGQ、PHTT①、TGTT、PHQS、FHJQ、NHKT、PHTT②、THGS、FGGJ、DGGS、FGBR、CBGB、KHTP、FBJN、FHGN、FHJQ；用于成株期慢銹性鑒定的 4個(gè)強(qiáng)毒力生理小種混合菌種為T(mén)HTS、THTQ、PHPS、THTT。參照LONG等[16]提出的四字母命名法對(duì)生理小種進(jìn)行命名。菌種材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥銹病研究中心進(jìn)行擴(kuò)繁和保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苗期抗葉銹性鑒定 苗期試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，將50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)、含有已知小麥抗葉銹病基因的36個(gè)載體品種(單基因系)及苗期感病對(duì)照品種(CK)鄭州5389，按順序播種于穴盤(pán)內(nèi)，每孔6～8粒小麥，共播種20套。待小麥長(zhǎng)到一葉一心時(shí)，將20個(gè)葉銹菌分別接種到麥苗上，并將接種后的小麥在黑暗條件下保濕。第二天將麥苗置于25 ℃左右日光溫室內(nèi)，待鄭州5389發(fā)病完全，進(jìn)行苗期鑒定。侵染型鑒定參照 ROELFS等[17]提出的方法加以完善，具體侵染型鑒定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)每個(gè)材料進(jìn)行2次重復(fù)。最后根據(jù)基因?qū)蚣僬f(shuō)，推導(dǎo)出供試材料中可能攜帶的抗葉銹病基因。

表1 葉銹菌侵染型鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 成株期抗葉銹性鑒定 50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)分別于2016年10月、2017年10月中旬播種于河北省保定市和河南省周口市試驗(yàn)田。每個(gè)品種(系)播種50粒左右，行長(zhǎng)1.5 m、行距0.3 m。每播種9行小麥材料之后播種1行鄭州5389作為對(duì)照(CK)，試驗(yàn)圃周?chē)シN鄭州5389作為誘發(fā)行，試驗(yàn)期間每年的4月上旬、中旬分別在周口市和保定市對(duì)誘發(fā)行接種葉銹菌混合菌種。當(dāng)對(duì)照鄭州5389葉片上葉銹病斑面積占總?cè)~片的50%時(shí)，開(kāi)始調(diào)查小麥葉銹病的發(fā)病情況。采用PETERSON等[18]提出的方法進(jìn)行鑒定，每7 d調(diào)查1次，當(dāng)對(duì)照品種嚴(yán)重度達(dá)到100%時(shí)，將調(diào)查結(jié)果作為最終嚴(yán)重度(Final disease severity，F(xiàn)DS)。統(tǒng)計(jì)50個(gè)品種(系)在2個(gè)環(huán)境下的FDS。利用軟件SAS對(duì)FDS進(jìn)行方差分析，通過(guò)FDS與慢銹對(duì)照(CK)SAAR的嚴(yán)重度進(jìn)行比較，篩選小麥慢銹品種(系)。

1.2.3 小麥抗葉銹病基因分子鑒定 參照SHARP等[19]提出的CTAB法提取50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)、鄭州5389及36個(gè)載體品種的基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，再用1×TE將DNA 稀釋至最終質(zhì)量濃度40 ng/μL備用。

利用與已知抗葉銹基因緊密連鎖的12對(duì)分子標(biāo)記Lr1、Lr9、Lr10、Lr19(2對(duì))、Lr20、Lr24、Lr26(2對(duì))、Lr34、Lr37和Lr46對(duì)50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，引物序列及擴(kuò)增條件如表2所示。PCR擴(kuò)增體系均為20 μL：2 μL DNA、10 μL 2×TaqPCR Mix、2 μL引物、6 μL ddH2O，產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。其中Lr46存在CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence，切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列)標(biāo)記的標(biāo)記酶識(shí)別位點(diǎn)，需將第1次擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，進(jìn)行第2次擴(kuò)增，產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

表2 研究所用分子標(biāo)記的引物序列及PCR擴(kuò)增程序

續(xù)表2 研究所用分子標(biāo)記的引物序列及PCR擴(kuò)增程序

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期基因推導(dǎo)和標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)比36個(gè)載體品種和50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)的抗性表現(xiàn)，推導(dǎo)50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中所含抗葉銹病基因(表3—4)。鑒定結(jié)果表明，測(cè)試品種(系)RL6010、RL6040、RL6064、RL6079、RL6080、C98.006和C78.5均表現(xiàn)高抗甚至免疫，不能斷定Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr47和Lr51等基因是否存在于上述供試材料中，RL6047、RL6002、Hussar、RL6051和RL6057均表現(xiàn)高度感病，亦不能斷定Lr2c、Lr3、Lr11、LrB和Lr33等基因是否存在于上述供試材料中。Insijnia、Palpich、MV laura、Mason/jagger、Re7145共5個(gè)品種(系)對(duì)20個(gè)葉銹菌的抗性與Lr1相比具有相似的抗性反應(yīng)或更廣的抗性譜，根據(jù)基因?qū)蚣僬f(shuō)，該5個(gè)品種(系)可能含有Lr1。Insijnia、Tx03a0148、F98047j14-zinc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共5個(gè)品種(系)對(duì)Lr26無(wú)毒力的菌種也表現(xiàn)為抗病，可能含有Lr26。T67/X84w063-45//K92、Re7145共2個(gè)品種(系)可能含有Lr18。Fr03724、Fr3713、T67/X84w063-9-45//K92共3個(gè)品種(系)可能含有Lr21，T67/X84w063-9-45//K92僅1個(gè)品種(系)可能含有Lr36。

與Lr1連鎖的STS標(biāo)記引物WR003在Insijnia、Palpich、MV laura、Mason/jagger、Re7145共5個(gè)品種(系)中均擴(kuò)增出1條760 bp的特異性條帶，表明該5個(gè)品種(系)含有Lr1，與基因推導(dǎo)結(jié)果一致。Insijnia、Tx03a0148、F98047j14-2inc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共5個(gè)品種(系)中擴(kuò)增出1條1 076 bp的ω-seclin片段，說(shuō)明該5個(gè)品種(系)含有Lr26，與基因推導(dǎo)結(jié)果一致。在50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中均未檢測(cè)到Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24。另外，由于Lr34，Lr46和Lr37為成株期抗病基因，在苗期表現(xiàn)感病，不能進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)，其分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、Tx03a0148、Palpich、Kanto107、MV laura、F92080g1-1/F93042g2-1、Mv05-08、Norin61、Bruta、Aca801、F98047j14-2inc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共13個(gè)品種(系)含有Lr34，Nidera baguette 10、Insijnia、Nsa09-3645、Soissons、Aztec、Carimulti、Mason/jagger、Re714、Kniish-46、Nuwest/4/D887-74/pew/、Fr03733共11個(gè)品種(系)含有Lr37，Sagittario、Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、Insijnia、Fr03717、Dorico 等45個(gè)品種(系)含有Lr46(表4)。

2.2 成株期抗病鑒定結(jié)果

經(jīng)方差分析(表5)可知，品種間、環(huán)境間、品種與環(huán)境間的差異均極顯著，品種與重復(fù)間差異不顯著，說(shuō)明小麥抗葉銹病的表達(dá)受基因型和環(huán)境共同影響。利用SAS軟件，根據(jù)LSD方法(表6)分析可知，慢銹對(duì)照SAAR表現(xiàn)明顯的慢銹性，共有Mv05-08、Fr03725、Re714、Fr03717、Fr03724等19個(gè)品種(系)與慢銹對(duì)照SAAR 的FDS無(wú)明顯差異，表現(xiàn)出慢銹性。

表3 供試20個(gè)菌系與36個(gè)載體品種抗葉銹基因相互作用產(chǎn)生的苗期侵染型

注：+表示夏孢子堆比正常的大；-表示夏孢子堆比正常的小。下同。

Note:+indicates uredia larger than normal;-indicates uredia smaller than normal.The same below.

表4 供試20個(gè)菌系與50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)相互作用產(chǎn)生的苗期侵染型

續(xù)表4 供試20個(gè)菌系與50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)相互作用產(chǎn)生的苗期侵染型

注：基因鑒定結(jié)果中，a表示該基因是基因推導(dǎo)鑒定出來(lái)的；b表示該基因是分子標(biāo)記檢測(cè)出來(lái)的；+表示未知基因。

Note:In the gene identification results,a indicates that the gene is genetically deduced;b indicates that the gene is detected by molecular marker detection;and + indicates unknown genes.

表5 2016—2017和2017—2018年50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)成株期FDS方差分析

表6 2016—2017和2017—2018 年50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)苗期對(duì)混合小種的抗性及成株期FDS

續(xù)表6 2016—2017和2017—2018 年50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)苗期對(duì)混合小種抗性及成株期FDS

3 結(jié)論與討論

發(fā)掘國(guó)外小麥品種中豐富的抗葉銹病基因并利用到抗病育種中，將極大地豐富我國(guó)小麥品種抗病基因。本研究?jī)H選取了36個(gè)已知基因進(jìn)行基因推導(dǎo)，因此，供試品種(系)中很可能還含有這36個(gè)抗葉銹病基因之外的抗病基因。本研究選用的是20個(gè)毒力不同的葉銹菌小種，盡管能推導(dǎo)出一些抗葉銹病基因，但由于測(cè)試品種(系)RL6010、RL6040、RL6064、RL6079、RL6080、C98.006和C78.5均表現(xiàn)高抗甚至免疫，因此不能斷定Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr47和Lr51在50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中是否存在。測(cè)試品種(系)中RL6047、RL6002、Hussar、RL6051和RL6057都表現(xiàn)高度感病，因此不能確定50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中是否含有Lr2c、Lr3、Lr11、LrB和Lr33等基因。

在50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中有5個(gè)品種(系)含有Lr1，由于已較長(zhǎng)時(shí)間大范圍應(yīng)用，導(dǎo)致病原物中相應(yīng)的毒性基因頻率上升，故Lr1對(duì)部分葉銹菌生理小種已失效[30]。若與合適的基因進(jìn)行組合，也可發(fā)揮一定的抗病性，起到提高抗病能力的作用。50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中有5個(gè)品種(系)含有Lr26，目前Lr26已喪失抗性。13個(gè)品種(系)含有Lr34，11個(gè)品種(系)含有Lr37，45個(gè)品種(系)含有Lr46。Lr34、Lr37和Lr46在田間抗性都表現(xiàn)很好，盡管Lr37的顯隱性也受到溫度的影響，但一般表現(xiàn)為顯性。一些研究表明，Lr34、Lr37基因組合在一起在田間表現(xiàn)出高于單基因表達(dá)出的抗性[31],并且研究表明當(dāng)Lr34與Lr46組合在一起的抗病能力強(qiáng)于其中單基因產(chǎn)生的抗性，Lr34、Lr37和Lr46，在我國(guó)一直受到育種家們的青睞。本研究中，Aca801、Palpich、F92080g1-1/F93042g2-1、F98047j14-zinc、Mason/jagger、Tx03a0148、Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、MV laura和MV05-08都同時(shí)攜帶Lr34和Lr46，且表現(xiàn)為高抗。供試材料中大多數(shù)品種(系)在成株期抗性良好，對(duì)于可能攜帶的未知抗葉銹病基因，還需進(jìn)一步進(jìn)行遺傳分析和基因定位。

本研究采用基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記相結(jié)合的方法檢測(cè)50個(gè)國(guó)外小麥品種(系)中所攜帶的抗葉銹病基因?；蛲茖?dǎo)在溫室中進(jìn)行，雖然避免了生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境等干擾因素的限制，但也會(huì)有弊端，例如受到小種鑒別力、遺傳背景等因素影響，推導(dǎo)的結(jié)果會(huì)有局限性。分子標(biāo)記能準(zhǔn)確、快速且不受環(huán)境因素限制，但有時(shí)會(huì)受非特異性帶型影響，顯現(xiàn)假陽(yáng)性，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究中選用的分子標(biāo)記特異性強(qiáng)，并且檢測(cè)結(jié)果與基因推導(dǎo)相一致，驗(yàn)證了本結(jié)果的可靠性。成株期微效抗病基因，通過(guò)成株期人工接種毒力強(qiáng)的混合葉銹菌小種鑒定。本研究中有19個(gè)小麥品種(系)在田間表現(xiàn)慢銹性，這對(duì)培育具有持久抗葉銹病基因的小麥意義重大。