周勤梅，譙明鳴，彭 成*，敖 慧，熊 亮*，劉 菲

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，成都611137

紫蘇葉來(lái)源于唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥葉(或帶嫩枝)。在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，具有解表散寒，行氣和胃的傳統(tǒng)功效，常用于風(fēng)寒感冒，咳嗽嘔惡，妊娠嘔吐，魚(yú)蟹中毒等[1]。由于氣味芳香，也常作為香精和調(diào)料使用[2,3]，紫蘇葉揮發(fā)油含量高，約0.2%～1.5%[3]，《中國(guó)藥典》2015年版中規(guī)定藥材含揮發(fā)油不得少于0.40%。

紫蘇全身是寶，其葉、梗、籽都可以藥食兩用，有助于預(yù)防心血管疾病[4]。紫蘇子壓榨的植物油富含α-亞麻酸，具有調(diào)脂、抗動(dòng)脈硬化作用，對(duì)降低心腦血管疾病具有積極意義[5]，從而備受人們親睞。同樣，紫蘇葉作為重要的食材，生活中應(yīng)用頗廣，現(xiàn)代藥理研究主要集中于其揮發(fā)油具有明顯的抗病原微生物、抗過(guò)敏、抗炎、抗氧化等作用[6-9]，而對(duì)于心血管疾病方面的研究鮮有報(bào)道。本研究開(kāi)展了紫蘇油舒張血管活性及其活性物質(zhì)研究，為紫蘇葉的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

肌張力傳感器：JH-2型，中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所；離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)：埃德儀器國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 7890A/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；電子分析天平：Sartorius系列，型號(hào)BP221S型；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，型號(hào)UPT-II-20T，成都超純科技有限公司；可調(diào)式移液器：Thermo Fisher Scinentific。

紫蘇葉藥材于2017年6月購(gòu)自于四川省新荷花飲片公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)高繼海副教授鑒定為紫蘇Perillafrutescens的干燥葉。紫蘇醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，由成都化夏化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：253466。Acetycholine chloride：Bomei；二甲亞砜(DMSO)：成都科龍?jiān)噭S，分析純，批號(hào)：2015110201；NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，NaHCO3，Glucose，EDTA，CaCl2均為分析純，購(gòu)自成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，清潔級(jí)，雌雄不限，體重200±20 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-24，檢疫后用。飼養(yǎng)溫度21～27 ℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。

1.3 揮發(fā)油的提取

取紫蘇葉藥材500 g，參照《中國(guó)藥典》2015年版紫蘇葉項(xiàng)下?lián)]發(fā)油提取方法[1](水蒸氣蒸餾法)得到紫蘇葉揮發(fā)油2.2 mL，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥除水后，貯存于4 ℃冰箱，備用。

1.4 舒張血管活性篩選

1.4.1 溶液的配制

K-H溶液配制：稱取NaCl 6.92 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，MgSO40.14 g，NaHCO32.1 g，Glucose 1.82 g，EDTA 0.009 g，CaCl20.28 g，加入純水，溶解并定容于1 000 mL量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品溶液的配制：精密稱取紫蘇油適量，加二甲基亞砜配制成40 mg/mL的母液，備用。實(shí)驗(yàn)中采取累積給藥方式，加入K-H溶液的浴槽中，使其在浴槽中的終濃度分別0.2、0.7、2、7、20 μg/mL。實(shí)驗(yàn)中其他若非特別說(shuō)明，則以去離子水為溶劑。

1.4.2 大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制備

大鼠脫頸椎處死，迅速打開(kāi)胸腔，快速取出胸主動(dòng)脈，并置于O2飽和4 ℃ K-H液(pH=7.4)中，剔除周圍的結(jié)締組織，沖洗血管內(nèi)血液，剪成3～5 mm的血管環(huán)。血管環(huán)用兩根不銹鋼蹬型掛鉤水平懸掛于浴管內(nèi)，一端固定于浴管內(nèi)，另一端連接張力換能器，調(diào)節(jié)1 g的基礎(chǔ)張力，采用離體組織灌流模型和PowerLab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)采集和記錄離體血管環(huán)張力的變化。浴槽內(nèi)含有K-H液，溫度恒定在37 ℃，持續(xù)通95%O2+5%CO2混合氣體，平衡60 min，每15 min換37 ℃ K-H液。

1.4.3 血管環(huán)活性檢測(cè)

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，采用KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮血管環(huán)，當(dāng)收縮張力達(dá)到坪值后，往浴槽內(nèi)加入Ach(10 μmol/L)舒張血管環(huán)，連續(xù)刺激3次。每次刺激后，K-H液連續(xù)沖洗三次，每次5 min，恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，穩(wěn)定30 min。當(dāng)連續(xù)的兩次收縮或舒張幅度小于10%，認(rèn)為血管環(huán)組織結(jié)構(gòu)完整，血管環(huán)活性良好，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 紫蘇葉油以及單體化合物對(duì)KCl收縮曲線影響檢測(cè)

待血管環(huán)平衡60 min后，用KCl(60 mmol/L)連續(xù)刺激血管環(huán)至少2～3次。每次刺激后，K-H液連續(xù)沖洗三次，每次5 min，恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，穩(wěn)定30 min。當(dāng)連續(xù)相同刺激所引起的血管收縮幅度小于10%，往浴槽內(nèi)加入KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)，血管收縮張力達(dá)到坪值時(shí)，累積加入5個(gè)濃度的紫蘇葉揮發(fā)油，觀察濃度與舒張效應(yīng)曲線，比較不同濃度下紫蘇葉揮發(fā)油對(duì)KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。同法，對(duì)單體化合物紫蘇醛(依次為0.5、1.5、5、15、50 μmol/L)進(jìn)行活性篩選，比較不同濃度下對(duì)KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮血管環(huán)的影響。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以KCl(60 mmol/L)所致的最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度揮發(fā)油所致的舒張百分比(%)。采用血管張力值變化反映藥物的舒張作用，單位為g。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SEM表示(n=6)，組間比較采用t檢驗(yàn)，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)完成(P<0.05，有顯著性差異；P<0.01，有極顯著性差異)?；衔锏臐舛纫蕾囀鎻埿?yīng)曲線圖采用Graphpad Prism 5軟件完成(以不同給藥濃度下最大舒張率為縱坐標(biāo)，累積給藥濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo))。

1.5 GC-MS分析

為進(jìn)一步分析紫蘇油發(fā)揮抗血管生成活性的物質(zhì)組成，本實(shí)驗(yàn)采用了氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)其進(jìn)行分析。方法參照氣相色譜法(中國(guó)藥典2015版二部附錄V E)測(cè)定。

1.5.1 色譜條件

色譜柱為HP-5 MS型石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱流量1.0 ml/min，載氣為高純度氦氣(99.999%)，柱前壓7.65 psi。程序升溫：初始溫度60 ℃，以每分鐘10 ℃的速率升溫至90 ℃，以每分鐘2 ℃的速率升溫至180 ℃，進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比20∶1。離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，質(zhì)量范圍20～800 amu。

1.5.2 GC-MS數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Agilent 5975C MSD化學(xué)工作站檢索Nist 14.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，同時(shí)結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜圖文獻(xiàn)解析，對(duì)紫蘇葉油中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。通過(guò)Agilent 5975C MSD化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法計(jì)算求出各化學(xué)成分的峰面積相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇葉油對(duì)KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響

實(shí)驗(yàn)中以DMSO為空白溶劑，可以看出其對(duì)血管舒張無(wú)明顯影響(見(jiàn)圖1)。本實(shí)驗(yàn)選擇Methoxyverapamil作為KCl誘導(dǎo)血管環(huán)收縮模型的陽(yáng)性對(duì)照藥，維拉帕米(verapamil)是常見(jiàn)的治療高血壓、心率失常、心絞痛的藥物，其作用機(jī)制為阻斷鈣離子通道[10-11]，觀察其對(duì)KCl誘導(dǎo)血管環(huán)收縮張力的影響。按照累積給藥方式，Methoxyverapamil對(duì)KCl誘導(dǎo)血管環(huán)收模型具有明顯的舒張作用，EC50為0.69 μmol/L。

紫蘇葉揮發(fā)油對(duì)KCl預(yù)收縮的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)具有良好的舒張作用，在0.2～20 μg/mL劑量范圍內(nèi)呈依賴性，其EC50為8.6 μg/mL。KCl通過(guò)高K+去極化，使細(xì)胞膜上的VDCCs開(kāi)放，外鈣內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，血管平滑肌出現(xiàn)收縮[12]。因此紫蘇葉揮發(fā)油舒張血管作用可能是通過(guò)影響KCl導(dǎo)致的VDCCs開(kāi)放，減少胞外Ca2+的內(nèi)流而實(shí)現(xiàn)。

圖1 空白溶劑、陽(yáng)性藥以及紫蘇葉揮發(fā)油對(duì)KCl預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張量效曲線Fig.1 Vasorelaxant activity of solvent,methoxyverapamil and the volatile oil against KCl-induced 注：與空白溶劑組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.2 紫蘇油活性部位的化學(xué)組成

采用GC-MS對(duì)紫蘇揮發(fā)油進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水蒸氣蒸餾法提取的紫蘇葉揮發(fā)油含量及主要成分相對(duì)百分含量見(jiàn)表1；按上述色譜條件進(jìn)樣得到揮發(fā)油的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對(duì)百分含量Table 1 Chemical constituents and relative percentages of volatile oil from Perilla leaves

續(xù)表1(Continued Tab.1)

峰號(hào)No.保留時(shí)間tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相對(duì)百分含量Relative percentage (%)49.706香薷酮 Elsholtzia ketoneC10H14O21662.70510.583未鑒定 Unknown--0.57611.6501-(呋喃-2-基)-4-甲基戊-1-酮 1-(Furan-2-yl)-4-methylpentan-1-oneC10H14O216622.18712.744紫蘇醛 PerillaldehydeC10H14O15037.15813.480未鑒定 Unknown--1.13913.865未鑒定 Unknown--10.661019.320石竹烯 CaryophylleneC15H242045.971121.032α-律草烯 α-HumuleneC15H242040.591223.4532,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯2,6-Dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)bicyclo[3.1.1]hept-2-eneC15H242042.561327.806氧化石竹烯 Caryophyllene oxideC15H24O2202.991429.030未鑒定 Unknown0.461530.516δ-芹子烯 δ-SelineneC15H242040.821631.464β-桉葉醇 β-Eudesmol1.361731.618α-桉葉醇 α-EudesmolC15H26O2221.37

紫蘇由于產(chǎn)地的不同其化學(xué)組成存在顯著性差異[13,14]，結(jié)合GC-MS法對(duì)紫蘇油進(jìn)行化學(xué)組成分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中的活性部位紫蘇葉油中主要含有單萜和倍半萜類成分，且紫蘇醛為其代表性成分(含量為37.15%)，提示紫蘇油發(fā)揮舒張血管活性可能與該成分密切相關(guān)。

圖2 紫蘇葉揮發(fā)油的總離子流Fig.2 Total ion current chromatography of the volatile oil from Perilla leaves

2.3 主要成分紫蘇醛的舒張血管活性的評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇紫蘇葉揮發(fā)油中的主要代表性單萜紫蘇醛進(jìn)行研究，觀察其對(duì)KCl預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的活性影響，以濃度與效應(yīng)繪制曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)累積給藥加入紫蘇醛，對(duì)KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮血管環(huán)的表現(xiàn)出一定的舒張作用，當(dāng)濃度為50 μmol/L時(shí)，最大舒張率為35.3%±8.6%，結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論

揮發(fā)油是從植物中提取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取紫蘇葉揮發(fā)油，該方法適用于具有芳香性成分(萜類或芳香族類)的提取，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13,14]。而來(lái)源于該植物的種子紫蘇子因脂肪油含量較高，常采用壓榨法進(jìn)行提取，其揮發(fā)性和芳香性較弱，以α-亞麻酸為代表的脂肪酸類成分常常需要甲酯化后才能進(jìn)行檢測(cè)[15,16]。因此，揮發(fā)油提取方法的選擇與藥用部位所含成分的性質(zhì)密切相關(guān)。

目前，大量研究表明植物揮發(fā)油對(duì)心血管具有明顯的作用[17]。紫蘇葉是藥食同源的，現(xiàn)代藥理研究主要集中在抑菌、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫功能等方面，本研究首次證實(shí)紫蘇葉揮發(fā)油具有顯著的舒張血管的作用。經(jīng)GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析該活性部位，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉油中主要含有單萜類和倍半萜類，提示萜類成分可能是其主要的活性物質(zhì)。為進(jìn)一步追蹤藥效物質(zhì)，本研究選擇含量較高的單萜類成分紫蘇醛(含量為37.15%)進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫蘇醛具有一定的舒張縮血管作用，當(dāng)濃度為50 μM時(shí)，最大舒張率為35.3%，表明紫蘇醛是紫蘇葉油舒張血管的重要活性成分之一。

圖3 紫蘇醛對(duì)KCl預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的 舒張量效曲線Fig.3 Vasorelaxant activity of perillaldehyde against 注：與空白溶劑組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Com- pared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

經(jīng)大量文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉揮發(fā)油中單萜類成分右旋檸檬烯(D-limonene，含量7.86%)和芳樟醇(linalool，含量1.47%)具有舒張血管的作用。二者均是常見(jiàn)的單萜類化合物，其中，右旋檸檬烯是柑橘類(橙，檸檬，金橘和柚子等)精油的主要成分[18]。學(xué)者Touvay等[19]研究了右旋檸檬烯對(duì)野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的大鼠的肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚的影響，每日口服400 mg/只給藥大鼠，右旋檸檬烯均能顯著降低MCT引起的大鼠肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚，此外還能降低肺動(dòng)脈中膜厚度。芳樟醇通常為外消旋混合物，存在于多種草本植物中，在化妝品和食品行業(yè)常被用作香水和香料[20]。H?ferl等[21]研究探討芳樟醇對(duì)血壓的影響，發(fā)現(xiàn)該單萜對(duì)人體心血管系統(tǒng)具有明顯的影響。綜上所述，紫蘇葉揮發(fā)油發(fā)揮舒張血管作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是單萜類成分，其顯著的藥效可能與多活性成分的協(xié)同作用有關(guān)，具體有待進(jìn)一步研究。