高苗苗， 李士偉， 祝洪艷*，徐多多*

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參研究院，長(zhǎng)春130117

多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[1-4]，且作為藥物毒副作用低，不良反應(yīng)少,已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。白囊耙齒菌 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)耙齒菌) 是一種重要的藥用真菌，屬于擔(dān)子綱非褶菌目多孔菌科耙齒菌屬，又被叫做白囊孔、耙齒菌。在我國(guó)白囊耙齒菌主要分布于吉林省的長(zhǎng)白山、黑龍江、河北等省區(qū)。耙齒菌發(fā)酵物的活性成分為多糖類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái)研究表明，耙齒菌多糖具有抗腫瘤、抗炎等活性[5]。但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)耙齒菌的研究很少，且多糖類(lèi)物質(zhì)的分子量較大，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，因此對(duì)耙齒菌多糖的研究相對(duì)滯后。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離制備耙齒菌發(fā)酵物中不同的多糖片段，得到兩種均一多糖，表征其結(jié)構(gòu)。為耙齒菌多糖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究和明確其結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系提供了科學(xué)依據(jù)。耙齒菌多糖粗提取物是吉林省多個(gè)藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的品種--益腎康膠囊的原料，主要用于治療腎小球腎炎引起腰痛、浮腫、尿少、血壓升高等癥。在民間，耙齒菌多糖治療腎炎的應(yīng)用非常的廣泛。雖然在臨床上治療慢性腎小球腎炎具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)，但治療腎炎的活性成分及機(jī)制卻尚不清楚，相關(guān)的國(guó)內(nèi)外對(duì)此方面的研究報(bào)道也很少，因此，耙齒菌治療腎炎缺乏相應(yīng)的理論支撐，這一現(xiàn)狀，將會(huì)嚴(yán)重的限制耙齒菌的在臨床的合理使用，益腎康膠囊也難以確定合理的工藝，無(wú)法建立有效的質(zhì)量控制方法，難以保證其安全性及有效性。為了明確耙齒菌治療慢性腎小球腎炎的有效成分，我們以在腎炎疾病中的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用的腎小球系膜細(xì)胞(GMC)作為篩選模型，觀(guān)察耙齒菌多糖對(duì)GMC的異常增殖及FN,LN等相關(guān)因子釋放的影響，篩選出活性多糖，為多糖治療慢性腎炎的構(gòu)效關(guān)系這一科學(xué)問(wèn)題，提供有益的借鑒和依據(jù)。

1 材料及儀器

耙齒菌固體發(fā)酵物，由通化吉通藥業(yè)股份有限公司提供。腎小球系膜細(xì)胞(ATCC)；PRMI1640培養(yǎng)基(美國(guó) hyclone 公司)；717型陰離子交換樹(shù)脂、732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(上海綠寶樹(shù)脂廠(chǎng))；脂多糖(美國(guó)sigma公司)；葡萄糖等單糖標(biāo)品(美國(guó)Sigma公司)；噻唑藍(lán)(MTT)(上海碧云天生物試劑有限公司)；胎牛血清FBS(Gibco)；苯酚、濃硫酸、二甲基亞砜、氫氧化鈉，等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酶標(biāo)儀 MK3(Thermo(上海)儀器有限公司)；N1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化儀器有限公司)；6890N-5973MSD氣-質(zhì)聯(lián)用儀、1100-6320 MS液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))。

2 方法

2.1 耙齒菌粗多糖的提取

采用多糖傳統(tǒng)的提取方法--水提醇沉法。耙齒菌發(fā)酵物，加水加熱使溶解，濾除不溶物，濃縮至一定體積，加入無(wú)水乙醇，不斷攪拌，至乙醇濃度為80%，離心，沉淀?yè)]干乙醇后加水溶解。采用Sevage法除去蛋白，離心除去沉淀，上清回收，凍干，即得耙齒菌粗多糖(PC)。

2.2 PC的分離純化

稱(chēng)取粗多糖30 g，用150 mL水溶解，通過(guò)717+732混合床離子交換樹(shù)脂純化，收集8個(gè)柱體積水洗脫液，濃縮至小體積，干燥，得到PCP。通過(guò) SePhadex G-50凝膠柱分離PCP，分別稱(chēng)取葡萄糖和藍(lán)色葡聚糖對(duì)照品10 mg，混合加5 mL蒸餾水溶解，經(jīng)過(guò)上述中壓柱，流速為1 mL/min，每管收集10 mL，隔管以苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)中性糖，以收集的洗脫液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制洗脫圖，測(cè)定內(nèi)水(Ve)和外水體積(VO)。稱(chēng)取PCP20 mg，用5 mL水溶解，經(jīng)過(guò)上述中壓柱，流動(dòng)相為水，每管收集10 mL。隔管以苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)中性糖，以收集的洗脫液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制洗脫圖。按照洗脫圖合并組分，分別得到PCP-1和PCP-2。

2.3 PCP-1、PCP-2理化性質(zhì)的測(cè)定

采用苯酚—硫酸法[6]測(cè)定總糖含量，間羥基聯(lián)苯法[7]測(cè)定酸性糖含量，BCA法[8]測(cè)定蛋白含量。

PMP柱前衍生化HPLC法[9]分析組成糖。色譜條件： C18色譜柱(5 μm，250 × 4.6 mm)；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；流速0.8 mL/min；流動(dòng)相A為0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(KH2PO4-NaOH，PH6.8)-乙腈(85∶15)，流動(dòng)相B為0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶(KH2PO4-NaOH，PH6.8)-乙腈(60∶40)。

2.4 PCP-1、PCP-2分子量測(cè)定

采用高效凝膠分子排阻色譜法[10]測(cè)定PCP-1、PCP-2分子量。

色譜條件：色譜柱為Shodex OhPak SB-802.5 HQ(8 mm×300 mm)凝膠柱，流動(dòng)相為0.7%硫酸鈉溶液，柱溫35 ℃，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，示差折光檢測(cè)器。

2.5 耙齒菌多糖PCP-1和PCP-2的化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究

2.5.1 PCP-1、PCP-2的IR分析

IR是多糖結(jié)構(gòu)分析的一種輔助手段，主要用于確定苷鍵的構(gòu)型，觀(guān)察特征的官能團(tuán)。PCP-1、PCP-2經(jīng)KBr壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，得IR 光譜圖。

2.5.2 甲基化

甲基化是多糖結(jié)構(gòu)研究中非常重要的一種手段。它可以提供多種信息，如糖殘基的種類(lèi)及各糖殘基的數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)采用改良的Hakomori法，該方法以DMSO 為溶劑，用DMSO 與NaOH的反應(yīng)產(chǎn)物甲基亞磺酰負(fù)離子 CH3SOCH2-為強(qiáng)堿，因CH3SOCH2-易與氧、水或二氧化碳反應(yīng)而降解，所以整個(gè)過(guò)程應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)和無(wú)水條件下進(jìn)行。將樣品PCP-1和PCP-2進(jìn)行甲基化[11]。經(jīng)甲基化，水解還原乙?；玫讲糠旨谆奶谴家宜狨パ苌?，進(jìn)行GC-MS分析。

分析條件：DB-1 MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm)，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，離子源溫度為250 ℃。升溫程序：140 ℃保持7.5 min，以2 ℃/min程序升溫至250 ℃，保持20 min。流速為1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比為50∶1。

2.6 耙齒菌多糖抗GMC增殖活性

2.6.1 建立LPS誘導(dǎo)GMC細(xì)胞增殖的模型

取GMC細(xì)胞種于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種24 h后，細(xì)胞貼壁，此時(shí)將培養(yǎng)液吸出，用無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于G0期。采用不同濃度的LPS培養(yǎng)不同的時(shí)間考察細(xì)胞的增殖。按照以下方式分組:空白組； LPS(10、20、30 μg/mL)分別培養(yǎng)12和24 h；采用噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,在酶標(biāo)儀上測(cè)定 490 nm 處的吸收度值 A。

2.6.2 PCP-1、PCP-2對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.0×104個(gè)/mL的濃度，分別接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)基，各孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基棄去，將細(xì)胞分為空白組、模型組、PCP-1組、PCP-2組。10 μg/mL LPS、10 μg/mL LPS+PCP-1(10、50、100 μg/mL)組、10 μg/mL LPS+PCP-2(10、50、100 μg/mL)組 (均以無(wú)血清的RAMI-1640配制)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT法測(cè)定。

2.6.3 活性多糖對(duì)GMC增殖相關(guān)因子的影響

ELISA 法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中 LN、 FN蛋白,將GMC細(xì)胞傳代于5瓶25T透氣培養(yǎng)瓶后用含10%血清培養(yǎng)液5 mL培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)瓶分為5組，分別為空白組，模型組，PCP-1給藥組。將5瓶中分別加入培養(yǎng)基，10 μg/mL LPS，LPS+PCP-1(10、50、100 μg/mL)，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞備用。細(xì)胞培養(yǎng)液按試劑盒要求的步驟進(jìn)行操作,測(cè)定各組細(xì)胞上清液中 LN、 FN的含量。

3 結(jié)果

3.1 PCP經(jīng)SePhadex G-50凝膠柱洗脫結(jié)果

耙齒菌經(jīng)水提醇沉，除蛋白后得到粗多糖(PC)，收率為30.24%。PC經(jīng)離子交換樹(shù)脂純化后得PCP，顏色由原來(lái)的淺褐色變成灰白色，除去了大量的雜質(zhì)，總糖含量明顯提高，蛋白質(zhì)含量明顯降低，收率可到達(dá)70.36%。PCP經(jīng)SePhadex G-50凝膠柱洗脫，繪制洗脫圖，見(jiàn)圖1。如圖1可知，PCP經(jīng)過(guò)凝膠色譜的分離，得到兩個(gè)部分，分別收集，命名為PCP-1和PCP-2。

圖1 PCP經(jīng)SePhadex G-50洗脫圖Fig.1 PCP eluted by SePhadex G-50 注：Ve為內(nèi)水體積，VO為外水體積。Note:Ve is the volume of internal water,VOis the volume of external water.

3.2 PCP-1、PCP-2理化性質(zhì)的測(cè)定

理化性質(zhì)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，PCP經(jīng)過(guò)凝膠柱分離后，得到的PCP-1、PCP-2總糖含量分別為98.05%、96.92%，酸性糖、蛋白質(zhì)幾乎沒(méi)有。PCP-1含有Man、Glc和Gal，且Gal的含量最高，摩爾比例為2.3∶1.2∶3.3；而PCP-2只含有Glc。

表1 PCP-1、PCP-2中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)含量和組成糖的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of PCP-1,PCP-2 neutral sugar,acid sugar,protein content and composition sugar

3.3 PCP-1、PCP-2分子量測(cè)定

樣品按2.3中色譜條件進(jìn)樣，得到色譜圖如圖2所示。根據(jù)供試品的保留時(shí)間計(jì)算樣品各組分的重均分子量，PCP-1、PCP-2分子量分別為30 000和8 000 Da。

圖2 PCP-1 、PCP-2 GPC色譜圖Fig.2 PCP-1,PCP-2 GPC chromatogram 注：左：PCP-2;右:PCP-1；Note:left:PCP-2;Right:PCP-1

3.4 PCP-1、PCP-2化學(xué)結(jié)構(gòu)

3.4.1 IR分析結(jié)果

由圖3，PCP-1光譜圖可知，寬峰3 330 cm-1是O-H的伸縮振動(dòng)，是多糖類(lèi)化合物的特征吸收；2 930 cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)峰；1 610 cm-1為C-O的伸縮振動(dòng)峰；1 408 cm-1處的吸收峰是C-H的變角振動(dòng)；1 025 cm-1處的吸收峰表明PCP-1包含吡喃糖類(lèi)型的結(jié)構(gòu)；另外，是多糖中的C-O、C-O-C的伸縮振動(dòng)和C-OH的彎曲振動(dòng)特征峰；852和744 cm-1處于950～700 cm-1之間，說(shuō)明具備α-和β-兩種構(gòu)型。

由圖3，PCP-2光譜圖可知，在3 350和2 930 cm-1的吸收峰分別為O-H、C-H2的伸縮振動(dòng)峰；1 610 cm-1為糖的水化物的吸收峰；1 408 cm-1處的吸收峰是C-h的變角振動(dòng)；1 020、1 080、1 150、851 cm-1處的吸收峰是多糖中α-吡喃環(huán)伸縮振動(dòng)特征峰。由此可知，PCP-2為α-構(gòu)型吡喃聚糖。

圖3 PCP-1、PCP-2 FT-IR光譜圖Fig.3 PCP-1,PCP-2 FT-IR sPectrum 注：左：PCP-2;右:PCP-1；Note:left:PCP-2;Right:PCP-1

3.4.2 甲基化 GC-MS分析

通過(guò)與參考文獻(xiàn)對(duì)照[12]，得甲基化分析結(jié)果，列于表 2。結(jié)果顯示，PCP-1主要包含7種糖殘基，其中有1個(gè)末端，2個(gè)分支點(diǎn)，末端和分支點(diǎn)之和的數(shù)量相等且糖殘基中Man、Gal、Glc的比例也和上述組成糖的結(jié)果一致，以上分析說(shuō)明甲基化的結(jié)果是合理的。PCP-2沒(méi)有分支，為直鏈結(jié)構(gòu)，且為1、6連接。

表2 PCP-1和PCP-2甲基化結(jié)果Table 2 PCP-1 and PCP-2 methylation results

續(xù)表2

保留時(shí)間tR(min)糖殘基Sugar residues摩爾比例Molar ratio連接方式Attended mode22.281 2,3,4- Me3- Man1.0→6)- ManP-(1→23.9202,3,4- Me3- Gal10.0→6)- GalP-(1→26.536 2,4- Me3- Man2.5→3,6)- ManP-(1→27.8553,4-Me2- Gal5.0→2,6)- GalP-(1→PCP-216.7202,3,4,6-Me4-Glc1.0→1)- GlcP18.5382,3,4- Me3-Glc19.00→1,6)- GlcP

3.5 耙齒菌多糖抗GMC增殖活性

3.5.1 LPS誘導(dǎo)的GMC增殖模型

GMS細(xì)胞在接種后12小時(shí)到72小時(shí)內(nèi)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期?？捎糜诩?xì)胞模型建立。由表3可知，LPS作用于GMC細(xì)胞，可劑量依賴(lài)性地刺激系膜細(xì)胞增殖。當(dāng)采用10 μg/mL的LPS誘導(dǎo)24 h時(shí)細(xì)胞抑制率為50%(P<0.01)，以此作用時(shí)間建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。

表3 LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖情況Table 3 LPS induced cell proliferation

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;**P<0.01。

Note:Compared with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.5.2 PCP-1、PCP-2對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC增殖的影響

由圖4可知，模型組與空白組相比有顯著性差異，說(shuō)明LPS造模成功。PCP-1對(duì)LPS細(xì)胞增殖具有明顯的保護(hù)作用，當(dāng)劑量增大，呈現(xiàn)顯著性差異，呈現(xiàn)明顯且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，而PCP-2無(wú)此作用。

圖4 PCP-1和PCP-2對(duì)GMC細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of PCP-1 and PCP-2 on the activity of GMC 注：空白組相比，#P<0.05；##P<0.01，與模型組相比，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with blank,#P<0.05;##P< 0.01,Compared with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

3.6 PCP-1對(duì)FN、LN含量的影響

FN，LN等蛋白圍繞在GMC周?chē)?，?gòu)成GMC生存的微環(huán)境。它不僅是細(xì)胞的支架組織,還直接影響細(xì)胞的黏附、營(yíng)養(yǎng)、代謝、增殖、分化和遷移,許多細(xì)胞因子通過(guò) ECM 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化起調(diào)控作用。采用ELISA法測(cè)定FN、LN的含量。如圖5所示，PCP-1能夠減少LPS誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞中FN和LN蛋白的釋放，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖5 PCP-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞中FN和LN含量的影響Fig.5 Effect of PCP-1 on the content of FNand LNin GMC cells induced by LPS 注：空白組相比，#P<0.05；##P<0.01，與模型組相比，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with blank,#P<0.05;##P<0.01,Compared with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

4 討論

腎小球腎炎是我國(guó)臨床上的常見(jiàn)的腎臟疾病，其病程長(zhǎng)，危害大。腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增多是主要的病理改變。ECM增多是指ECM合成增多或降解減少導(dǎo)致的ECM蛋白組分過(guò)度積聚。ECM主要蛋白組分包括Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白 (LN)和蛋白聚糖等。GMC是腎小球三種固有細(xì)胞成分(GMC、內(nèi)皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞)中功能最活躍的細(xì)胞，GMC受到外界因素刺激后，會(huì)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子相互作用，最終導(dǎo)致腎炎的發(fā)生及發(fā)展。GMC產(chǎn)生ECM的作用最強(qiáng)，是ECM的主要產(chǎn)生細(xì)胞或稱(chēng)效應(yīng)細(xì)胞。所以，若能有效保護(hù)GMC，抑制GMC增殖，則可延緩腎小球硬化，防止腎衰的發(fā)生。耙齒菌多糖在臨床上治療腎小球腎炎有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)，但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)白囊耙齒菌的研究很少，耙齒菌多糖的活性成分尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的耙齒菌均一多糖PCP-1能有效抑制GMC的異常增殖，減少LN，F(xiàn)N等相關(guān)因子的釋放，為耙齒菌多糖的活性成分。本研究為進(jìn)一步研究耙齒菌均一多糖的結(jié)構(gòu)和活性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。為益腎康膠囊確定合理的工藝，建立有效的質(zhì)量控制方法，為多糖治療慢性腎炎的構(gòu)效關(guān)系這一科學(xué)問(wèn)題，提供有益的借鑒和數(shù)據(jù)。