張雪松，謝春芹，凡軍民，曹 正，許俊齊，劉煥穎

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，句容 212400

羊肚菌是一種珍稀食用菌品種，具有豐富的營養(yǎng)，藥用價值較高。近年來的研究表明食用菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖、提高人體免疫力、抑菌、抗癌等重要生物學(xué)功能[1,2]。目前，對羊肚菌多糖的研究主要集中在提取、分離純化以及抗腫瘤、抗氧化等生物活性研究[3,4]。

糖苷酶是一種可以水解糖苷鍵的酶，在糖和糖復(fù)合物的水解和合成中起著關(guān)鍵作用。目前為止，在2型糖尿病的治療藥物中，糖苷酶抑制劑因其具有毒副作用小甚至無毒，且作用溫和持久等優(yōu)點，得到越來越多的研究者青睞[5]。天然糖苷酶抑制劑的研究開發(fā)在近年來已成為比較活躍的領(lǐng)域。目前，以淀粉、麥芽糖、蔗糖為底物的糖苷酶抑制劑定向篩選模型因其作用機(jī)制明確、靶向作用具體、假陽性率低等優(yōu)點而備受關(guān)注[6]。

從食藥用真菌中篩選天然糖苷酶抑制劑是一條極為重要的途徑，同時，不斷嘗試以分子結(jié)構(gòu)母體為模型進(jìn)行修飾改性，開發(fā)新型、廉價、高效的降糖藥是糖苷酶抑制劑研究領(lǐng)域的研究趨勢和最終目的。近年來，已經(jīng)有學(xué)者對靈芝多糖、山茱萸多糖等深入研究并表明多糖在糖苷酶抑制劑開發(fā)方面具有誘人的價值[7,8]。食用菌多糖被視為較為理想的來源，但由于其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的限制，其生物活性很難與藥物相比。多糖的生物活性與其糖苷鍵的類型、相對分子量、空間結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)聯(lián)性[9]，通過多糖的改性研究能夠改變其空間結(jié)構(gòu)、分子量和取代基的種類數(shù)量，從而影響抗腫瘤、抑菌、抗氧化等生物活性[10]。多糖經(jīng)過改性后其生物活性可以得到明顯提升，甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)活性。Chen、Wang等[11,12]曾對羊肚菌多糖以及無花果多糖分別進(jìn)行乙?；统暩男?，乙?；俺暩男援a(chǎn)物的抗氧化等生物活性均有所增強(qiáng)。

目前對羊肚菌多糖體外降血糖研究尚少，更是鮮有文獻(xiàn)對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物進(jìn)行深一步的體外降血糖研究。因此，本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，選擇對α-淀粉酶抑制率相對較低的羊肚菌多糖進(jìn)行改性研究。在篩選羊肚菌多糖改性方法的基礎(chǔ)上，選擇過氧化氫氧化降解羊肚菌多糖，以α-淀粉酶抑制率對許多改性方法進(jìn)行研究，針對過氧化氫氧化法進(jìn)行了單因素試驗以及響應(yīng)面分析，考察料液比、時間、pH值、溫度等因素的影響，優(yōu)化其工藝條件，進(jìn)一步提升羊肚菌多糖對糖苷酶的抑制能力，為多糖類物質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌教學(xué)基地種植栽培。4-硝基苯基-α-D吡喃半乳糖苷、蔗糖、麥芽糖、淀粉、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、30%過氧化氫、乙酸酐、硫酸銨、正丁醇、酒石酸鉀鈉、氯仿均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。四種酶制劑見表1。

表1 酶制劑 Table 1 Enzyme preparations

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GZLYZ-1真空冷凍干燥機(jī) 諸城市博匯機(jī)械有限公司；HWS24型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌多糖的制備

取65 ℃下烘干羊肚菌實體進(jìn)行粉碎并過40目篩，按照1∶10的比例加入蒸餾水混合攪拌，超聲波功率為400 W，55 ℃提取45 min。提取液4 ℃靜置12 h后經(jīng)過濾，離心得上清液。上清液水浴濃縮后，Sevag法離心除蛋白。上清液按6倍量加入無水乙醇，-20 ℃靜置12 h。收集沉淀，真空冷凍干燥后得到羊肚菌多糖。

1.3.2 羊肚菌多糖改性物制備

1.3.2.1 鹽酸水解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖0.1 g，加入2 mol/L鹽酸溶液10 mL，90 ℃保溫3 h。氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.2 過氧化氫氧化降解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，加入5 mL過氧化氫后用蒸餾水定容至25 mL，40 ℃水浴保溫3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.3α-淀粉酶酶解法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，加入40 U/mL、pH6的α-淀粉酶25 mL，50 ℃水浴保溫15 min。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.4 乙?；ㄖ苽溲蚨蔷嗵歉男晕?/p>

稱取羊肚菌多糖1 g，加入30 mL蒸餾水，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH9，按照料液比1∶4加入乙酸酐，50 ℃水浴保溫1 h。用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.5 硫酸化法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，按照料液比1∶8(g/mL)加入濃硫酸，繼續(xù)加入0.1 g硫酸銨，正丁醇2.5 mL，放入冰水浴中反應(yīng)1 h。用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.2.6 超聲波法制備羊肚菌多糖改性物

稱取羊肚菌多糖1 g，按照料液比1∶50加入蒸餾水，超聲功率300 W，溫度90 ℃， 超聲時間20 min。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.3.3 糖苷酶抑制率的測定

1.3.3.1α-淀粉酶抑制率的測定

樣品溶液的配制：取0.2 g樣品加入蒸餾水配制成濃度為40 mg/L樣品溶液。

α-淀粉酶抑制率的測定參照文獻(xiàn)[13]略加改動。加入2%淀粉溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL、40 mg/L樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mLα-淀粉酶，對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL DNS，再放入沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于540 nm處測其吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為540 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.3.3.2 麥芽糖酶抑制率的測定方法

麥芽糖酶抑制率的測定參照文獻(xiàn)[14]略加改動。加入2%麥芽糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL、40 mg/L樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mL麥芽糖酶，對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL DNS，于沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于405 nm處測定吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為為405 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.3.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定方法

α-葡萄糖苷酶抑制率的測參照文獻(xiàn)[15]略加改動。加入4-硝基苯基-α-D吡喃半乳糖苷(PNPG)溶液2.0 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL、40 mg/L的樣品溶液，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對照，再加入2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液。置于37 ℃水浴中保溫10 min，在空白管以及抑制管加入1.0 mL、20 U/mLα-葡萄糖苷酶，在對照管加入1.0 mL蒸餾水。再次放入37 ℃水浴中保溫15 min，加入5.0 mL碳酸鈉溶液終止試驗。冷卻至室溫，于405 nm處測得吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為405 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.3.3.4 蔗糖酶抑制率的測定方法

蔗糖酶抑制率的測定參照文獻(xiàn)[16]略加改動。加入2%蔗糖溶液0.5 mL，在抑制管和抑制對照管中加入1.0 mL、40 mg/L抑制劑，在空白管和空白對照管中加入1.0 mL蒸餾水進(jìn)行對照，再在空白管和抑制劑管加入0.5 mL、20 U/mL蔗糖酶，對照管加入0.5 mL蒸餾水。置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)，于沸水浴中反應(yīng)5 min，加入10.0 mL蒸餾水，冷卻至室溫，于550 nm處測定吸光值，得A。

式中，Α1、Α2、Α3和Α4分別為550 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品磨成粉末，與溴化鉀混合后一起壓片，得到均勻的薄片進(jìn)行測試。掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.5 單因素試驗

1.5.1 時間對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品加入5 mL、30%過氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在40 ℃下分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.2 料液比對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，按料液比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11和1∶13加入30%過氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在40 ℃下反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.3 反應(yīng)溫度對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，加入料液比為1∶9的30%過氧化氫溶液，加入pH7的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在20、30、40、50、60 ℃條件下，反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.5.4 pH對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

稱取1 g樣品，加入料液比為1∶9的30%過氧化氫溶液溶解樣品，加入pH分別為5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，在50 ℃下反應(yīng)3 h。濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥得改性產(chǎn)物。

1.6 響應(yīng)面試驗

綜合單因素試驗結(jié)果，采用Design-expert進(jìn)行試驗設(shè)計和分析。以α-淀粉酶抑制率為衡量指標(biāo)，響應(yīng)面試驗因素水平如表2所示，表2中時間、料液比、溫度、pH四因素分別對應(yīng)試驗因素中的A、B、C、D。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表 Table 2 Factor level of response surface experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 羊肚菌多糖改性方法篩選

不同改性方法對α-淀粉酶抑制率的影響見圖1。由圖1可知，鹽酸水解法、過氧化氫氧化降解法、α-淀粉酶酶解法、乙?；ㄒ约俺暡ǚň芴岣哐蚨蔷嗵歉男援a(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率，而采用濃硫酸處理則沒有效果。研究表明多糖的生物活性與其糖苷鍵的類型、相對分子量、空間結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)聯(lián)性[9]。用鹽酸、過氧化氫以及α-淀粉酶處理羊肚菌多糖，可使其發(fā)生降解，降低了多糖分子量，這可能有助于提升對α-淀粉酶的抑制能力。乙?；瘎t是在多糖酚羥基中引入乙酰基，改變多糖的空間結(jié)構(gòu)。而超聲波能夠破壞空間結(jié)構(gòu)，降解大分子物質(zhì)，降低分子量[17]。硫酸化處理羊肚菌多糖，其改性產(chǎn)物對α-淀粉酶的抑制能力有所下降，這可能是濃硫酸使得多糖發(fā)生碳化和氧化[18]。在六種改性方法中，過氧化氫法制備羊肚菌多糖改性產(chǎn)物對α-淀粉酶抑制率提升效果最高，在試驗條件下可提高約14倍，故選擇過氧化氫法氧化降解羊肚菌多糖。

圖1 不同改性方法的影響Fig.1 Effect of different modification method of Morchella polysaccharide 注：圖中橫坐標(biāo)1表示羊肚菌多糖初始α-淀粉酶抑制率， 2-7分別表示羊肚菌多糖經(jīng)鹽酸水解、過氧化氫氧化降解、α-淀粉酶酶解、乙?；?、硫酸化以及超聲波處理后的改性產(chǎn)物對α-淀粉酶的抑制率。Note:Number 1 of abscissa indicates the initial α-amylase inhibition rate of Morchella polysaccharides,and number 2-7 indicates α-amylase inhibition rate of the Morchella polysaccharides modified product by hydrochloric acid,hydroperoxide degradation,α-amylase enzymatic hydrolysis,acetylation,sulfation and ultrasonic treatment.

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 反應(yīng)時間對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

反應(yīng)時間對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見圖2。由圖2可知，隨著反應(yīng)時間的延長，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物對α-淀粉酶的抑制率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)時間為3 h時抑制率達(dá)到最大。超過3 h后，繼續(xù)延長時間則抑制率趨于平緩。

2.2.2 料液比對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

料液比對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制

圖2 反應(yīng)時間對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2 Effect of reaction time on inhibition rate of α-amylase

率的影響見圖3。由圖3可知，隨著料液比的逐漸增加，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶9時抑制率達(dá)到最大。過氧化氫量越多，會提供更多的羥基自由基，多糖的降解程度就越大。同時過氧化氫的過度氧化作用會使C-O-C發(fā)生斷裂，使得分子量進(jìn)一步降低，從而導(dǎo)致α-淀粉酶抑制率降低[19]。

圖3 料液比對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on inhibition rate of α-amylase

圖4 反應(yīng)溫度對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on inhibition rate of α-amylase

2.2.3 反應(yīng)溫度對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

反應(yīng)溫度對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見圖4。由圖4可知，隨著溫度的逐漸升高，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率出現(xiàn)先增大后減小，在50 ℃條件下抑制率達(dá)到最大。這可能是由于過氧化氫不穩(wěn)定，高溫下易降解，從而降低了氧化能力。

2.2.4 pH對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響

pH對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響見圖5。由圖5可知，隨著pH的逐漸升高，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率先升高后降低，pH7時抑制率最大。過氧化氫雖然在酸性條件下顯示出更強(qiáng)的氧化性，但是過度的氧化可能會導(dǎo)致羊肚菌多糖改性物的分子量進(jìn)一步變化，同時其羥基氧化成羧基的可能性也大大增強(qiáng)。在堿性環(huán)境下會降低其穩(wěn)定性，并且抑制過氧化氫的氧化性，從而降低了改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制能力。

圖5 pH對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.5 Effect of pH on the inhibitory rate of α-amylase

2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及分析

羊肚菌多糖改性響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 Table 3 Response experimental results

續(xù)表3(Continued Tab.3)

序號Serial numberABCDα-淀粉酶抑制率α-Amylase inhibition rate(%)400-1-18.45-100-18.58601-1010.75701109.44810-1011.959000015.72100-10-18.7111-1-10013.55120-10111.2113100111.0714000016.2815-110011.9616110011.4617000015.94180-1-1013.0619001-17.0820-10109.872100117.0422-10-1012.7123-10019.57241-10013.04250-11010.022600-1110.8927010-18.642801018.6129000016.06

2.3.1 方差分析

運(yùn)用Design-Expert V8.0軟件對表3響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5。

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析 Table 4 Response surface quadratic model analysis of variance

續(xù)表4(Continued Tab.4)

方差來源Source平方和Sum of squares自由度df均方和Mean squareF值F valueP值 概率﹥FP value Prob>FAC0.4010.403.130.098 5AD0.3010.302.310.151 0BC0.7510.755.810.030 2BD1.6011.6012.430.003 4CD1.6011.6012.430.003 4A218.17118.17141.14﹤0.000 1B226.17126.17203.30﹤0.000 1C262.98162.98489.30﹤0.000 1D2144.271144.271 120.77﹤0.000 1殘差Residual1.80140.13失擬項Lack of fit1.59100.163.030.148 3 not significant純誤差 Pure error0.2140.053總誤差 Cor total216.6128

從表4所示的方差分析來看，所選擇的模型顯著(P<0.05)，失擬項為不顯著(P>0.05)，即所選擇的模型可靠。在時間、料液比、溫度以及pH四個因素中，料液比、溫度以及pH的影響皆顯著。此外，這四個因素對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率的影響亦非簡單的線性關(guān)系。各個因素之間的交互影響表現(xiàn)為顯著的有料液比-溫度、料液比-pH、溫度-pH。

表5 R2綜合分析表 Table 5 Analysis of R-squared

從表5可以看出，模型的R2=0.991 7，校正R2=0.983 4，預(yù)測R2和校正R2較為接近，信噪比為34.981(﹥4)，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗誤差較小，故可用此模型對多糖改性的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測。

利用Design Expert V8.0軟件對表5所得試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，獲得改性多糖的多元二次回歸方程模型為：α-淀粉酶抑制率=16.05+0.054×A-0.73×B-1.16×C+0.67×D+2.500×10-3×A×B+0.32×A×C+0.27×A×D+0.43×B×C-0.63×B×D-0.63×C×D-1.67×A2-2.01×B2-3.12×C2-4.72×D2。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

根據(jù)回歸方程，考察兩兩因素之間的交互作用對α-淀粉酶抑制率的影響，可得一組等高線圖及其響應(yīng)曲面圖(圖6～圖8)，從而確定因素的最佳水平范圍，結(jié)果選擇影響顯著的BC、BD和CD加以說明。

2.3.2.1 料液比-溫度對α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖6為料液比-溫度對改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)時間和pH為最佳值時，隨著料液比和溫度的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可以確定最佳水平范圍料液比在7.92～9.28之間，溫度在45.21～50.42 ℃之間。

圖6 料液比-溫度對α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.6 Response of material-liquid ratio-to-temperature to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.2.2 料液比-pH對α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖7為料液比-pH對改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度為最佳值時，隨著料液比和pH的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可知，最佳料液比在8.06～9.14之間，pH在6.86～7.25之間。

圖7 料液比-pH對α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.7 Response of material-liquid ratio-to-pH to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.2.3 溫度-pH對α-淀粉酶抑制率的交互影響

圖8為溫度-pH對改性多糖α-淀粉酶抑制率的等高線圖及其響應(yīng)曲面圖。當(dāng)反應(yīng)時間和料液比為最佳值時，隨著溫度和pH的增加，改性多糖的α-淀粉酶抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖可以確定最佳溫度在45.55～50.55 ℃之間，pH在6.83～7.29之間。

圖8 溫度-pH對α-淀粉酶抑制率的響應(yīng)曲面圖(左)和等高線圖(右)Fig.8 Response of temperature-to-pH to α-amylase inhibition rate surface plot (left) and contour plot (right)

2.3.3 最優(yōu)條件預(yù)測

通過軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析得出模型理論最佳條件為料液比為1∶8.55、pH7.09、溫度為47.8 ℃、時間為3.02 h，按最優(yōu)條件進(jìn)行試驗驗證，重復(fù)測定三次所得羊肚菌改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率為16.30%，與模型預(yù)測結(jié)果的相對誤差為0.11%，兩值相近，說明此模型預(yù)測數(shù)據(jù)可靠。

2.4 改性前后對糖苷酶抑制率的比較

改性前后對糖苷酶抑制率的比較見圖9。由圖9可知，利用過氧化氫氧化法對羊肚菌多糖進(jìn)行改性，改性羊肚菌多糖α-淀粉酶抑制率有顯著提高(P﹤0.05)。改性后與改性前相比，α-淀粉酶抑制率提高了17.16倍。蔗糖酶抑制率由72.08%提高到78.13%，麥芽糖酶抑制率由10.05%提高到16.48%，α-葡萄糖苷酶由17.54%提高到21.40%。改性產(chǎn)物與同濃度下的阿卡波糖相比，α-淀粉酶抑制率提高了1.44倍，蔗糖酶抑制率與阿卡波糖無明顯差異(P>0.05)，麥芽糖酶抑制率提高了1.63倍，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了1.88倍。

圖9 改性前后糖苷酶抑制率的比較Fig.9 Comparison of inhibition rate of glycosidase before and after modification 注：圖中橫坐標(biāo)1～4分別表示α-淀粉酶抑制率、蔗糖酶抑制率、麥芽糖酶抑制率以及α-葡萄糖苷酶抑制率。Note:Number 1-4 of abscissa indicates the α-amylase inhibition rate,sucrase inhibition rate,maltase inhibition rate and α-glucosidase inhibition rate.

2.5 改性前后樣品表征

羊肚菌多糖改性前后的傅里葉紅外光譜圖見圖10。分析圖譜可以看出，羊肚菌多糖經(jīng)過氧化氫改性前后的紅外圖譜基本吻合，官能團(tuán)種類基本沒有發(fā)生變化，呈現(xiàn)明顯的多糖吸收特征。說明羊肚菌多糖經(jīng)過氧化氫氧化降解后，化學(xué)結(jié)構(gòu)單元不發(fā)生變化，僅糖苷鍵發(fā)生斷鍵，分子量降低。在3 420cm-1處出現(xiàn)-OH伸縮振動吸收峰，2 928 cm-1為C-H伸縮振動吸收峰，1 635 cm-1處出現(xiàn)-OH彎曲振動吸收峰，1 410 cm-1處出現(xiàn)=CH2的變形吸收峰，1 152 cm-1處出現(xiàn)環(huán)上C-O吸收峰，1 078 cm-1處醇羥基的變角振動峰，1 026 cm-1處出現(xiàn)了糖環(huán)C-O-C吸收峰。926 cm-1處出現(xiàn)了呋喃環(huán)的對稱伸縮振動吸收峰，說明羊肚菌多糖及其氧化改性物中有呋喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖10 改性前后樣品傅里葉變換紅外光譜分析Fig.10 FT-IR chromatographic before and after modification

3 結(jié)論

本文采用過氧化氫氧化降解法對羊肚菌多糖進(jìn)行改性，考察了四個因素(反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、料液比、pH)對改性產(chǎn)物α-淀粉酶抑制率的影響。利用響應(yīng)面法設(shè)計正交試驗，建立了四個因素相互作用的數(shù)學(xué)預(yù)測模型，預(yù)測模型表明，料液比1∶8.55、pH7.09、溫度47.8 ℃、時間3.02 h為最佳反應(yīng)條件。試驗所得改性多糖α-淀粉酶抑制率為16.30%，與模型預(yù)測結(jié)果的相對誤差為0.11%，比改性前提高了17.16倍，蔗糖酶抑制率提高了1.07倍，麥芽糖酶抑制率提高了1.64倍，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了1.22倍。與常用的降糖藥阿卡波糖相比，羊肚菌多糖改性產(chǎn)物的α-淀粉酶抑制率、麥芽糖酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率分別提高了1.44、1.63和1.88倍。

多糖類化合物是由至少超過十個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，其糖苷酶抑制率與化合物的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。目前雖然有一些關(guān)于羊肚菌多糖的化學(xué)改性研究，如Chen[11]曾利用乙酸酐法、氯磺酸-吡啶法以及硫酸化法等化學(xué)改性法對羊肚菌多糖改性后的抗腫瘤、抗氧化等活性進(jìn)行了比較。但是鮮有文獻(xiàn)對羊肚菌多糖改性產(chǎn)物進(jìn)行深一步的體外降血糖研究。氧化是多糖的化學(xué)改性中最為簡單和廣泛的方法之一，其降解原理是打斷多糖分子內(nèi)的糖苷鍵，從而使大分子變成小分子多糖。以無副產(chǎn)物、無毒害作用的過氧化氫氧化降解法開發(fā)得最多[20]。同時，過氧化氫氧化改性較硫酸化法等化學(xué)改性操作更為簡便，更為高效，并且不產(chǎn)生任何有毒有害的副產(chǎn)物，綠色環(huán)保，因此在生產(chǎn)中可以得到有效利用。本文優(yōu)化過氧化氫氧化降解羊肚菌多糖工藝條件，進(jìn)一步提升羊肚菌多糖對糖苷酶的抑制能力，為降糖藥的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。