劉瓊艷，張美琴,2，卿 晨*，李 霽*

1昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2云南新興職業(yè)學(xué)院，昆明 650501

喜樹堿是從中國(guó)珙桐科植物中提取的一種生物堿，具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (topoisomerase，Top1)是其主要的作用靶點(diǎn)。但在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，喜樹堿類化合物對(duì)腫瘤患者的療效與在嚙齒類動(dòng)物模型的效果有很大差異，同時(shí)病人伴隨嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，如膀胱出血、骨髓抑制等，使其在臨床的應(yīng)用受到很大限制[1]。究其原因是因?yàn)槿梭w血液與嚙齒類動(dòng)物血液的pH值存在較大差異，后者使得喜樹堿化學(xué)結(jié)構(gòu)中E環(huán)的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)保持在閉環(huán)，而此結(jié)構(gòu)狀態(tài)是其抗腫瘤活性所必需。而人血液的pH值卻使喜樹堿結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)(E環(huán))打開，成為其在臨床應(yīng)用中活性下降、毒性增加的主要原因。

因此，對(duì)喜樹堿結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造優(yōu)化一直是喜樹堿類抗腫瘤藥的研究熱點(diǎn)。目前臨床應(yīng)用的喜樹堿類抗癌藥有拓?fù)涮婵礫2,3]、伊立替康[4]和10-羥基喜樹堿[5]，此外尚有若干喜樹堿類衍生物處在臨床前研究和臨床研究的不同階段，如9-硝基喜樹堿(9-NC)已完成了胰腺癌的Ⅲ期臨床研究[6,8]，但也由于其嚴(yán)重的毒副反應(yīng)而終止。

化合物 NCP4是在9-NC分子的20(S) 羥基位引入碳酸酯結(jié)構(gòu)[9]，旨在降低其開環(huán)速度，以達(dá)到提高抗腫瘤活性、改善溶解度并降低毒性的目的。我們前期的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，NCP4對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，毒性顯著低于9-NC。但對(duì)化合物NCP4的穩(wěn)定性和代謝方面的研究尚未進(jìn)行。

對(duì)候選化合物代謝的研究是藥物研發(fā)的重要內(nèi)容。肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，擁有細(xì)胞色素P450等多種代謝酶。這些代謝酶主要存在于肝微粒體中，決定藥物代謝途徑、代謝速率，與藥物清除率直接相關(guān)[10，11]。采用體外肝微粒體溫孵系統(tǒng)進(jìn)行代謝研究，不僅可排除體內(nèi)諸多因素的干擾，還具有反應(yīng)干擾小、操作簡(jiǎn)單、代謝條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，體外代謝還能迅速有效地解決藥物代謝中的關(guān)鍵問題，例如代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝途徑推斷等，為體內(nèi)代謝研究提供重要的線索和依據(jù)[12]。

為此，本研究選擇人、SD大鼠、beagle犬的體外肝微粒體溫孵體系，建立HPLC-UV-MS(Q-TOF)定性分析方法，尋找化合物NCP4的代謝產(chǎn)物，探討NCP4體外代謝動(dòng)力學(xué)特征，考察NCP4在不同種屬間代謝的差異,為NCP4相關(guān)藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥動(dòng)學(xué)的研究尋找合適的動(dòng)物模型，提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

3-18KS臺(tái)式低溫離心機(jī)；YCD-EL259冰箱(合肥美菱股份有限公司)；VCX150氮?dú)獯蹈蓛x(昆明鵬翼達(dá)氣體產(chǎn)品有限公司)；HPLC-UV-MS(Q-TOF)(安捷倫科技有限公司)

1.2 試劑

SD大鼠肝微粒體、beagle犬肝微粒體以及人肝微粒體蛋白濃度為20 mg/mL，購(gòu)自瑞德肝臟疾病研究有限公司，磷酸緩沖液(PBS)購(gòu)自Therno公司，NADPH系統(tǒng)購(gòu)自Sigma公司，叔丁基甲基醚、甲醇(批號(hào)151130)、色譜純乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司，色譜純乙酸銨購(gòu)自美國(guó)Tedia公司，色譜純甲酸購(gòu)自德國(guó)Fluka公司，大鼠和人血漿由本實(shí)驗(yàn)室自采。

2 方法

2.1 孵育混合液的組成

SD大鼠孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，SD大鼠肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

beagle犬孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，Beagle犬肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

人孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，人肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

2.2 試驗(yàn)方法

分別取180 μL的孵育液，在37 ℃恒溫水浴箱中預(yù)孵育5 min，然后加入20 μL NADPH(終濃度1 mM)啟動(dòng)反應(yīng)，孵育完畢后使用0.8 mL的冰乙腈終止反應(yīng)。

選取0、2、5、10、15、30、60、90、120 min的孵育樣品作為不同種屬肝微粒體孵育反應(yīng)的研究對(duì)象，按照各樣品的時(shí)間要求進(jìn)行溫孵。

0 min是在180 μL孵育液中先加入0.8 mL冰乙腈終止反應(yīng)后，再加入20 μL 的NADPH液?？瞻谆|(zhì)樣品是取不含藥的孵育液，加入20 μL 的NADPH液，再加入0.8 mL冰乙腈沉淀蛋白。終止反應(yīng)后的樣品及空白基質(zhì)加叔丁基甲基醚1 mL在7 155×g離心10 min，取上清液0.8 mL，氮?dú)獯蹈?，采?00 μL 90%甲醇復(fù)溶，渦旋3 min后離心取上清液進(jìn)行HPLC-UV(Q-TOF)分析。比較NCP4在SD大鼠、Beagle犬、人肝微粒體中的溫孵結(jié)果，分析其代謝產(chǎn)物。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Diamonsil C18(4.6×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水：甲醇(30∶70)等度洗脫；柱溫：25 ℃，流速：0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm；進(jìn)樣量20 μL，分析時(shí)間23 min。

質(zhì)譜條件：本實(shí)驗(yàn)選擇ESI正離子模式、全掃描方式(m/z100～1 000)，霧化氣壓35 psi，干燥氣流速9 mL/min，離子化電壓為3 500 V，碎片電壓175 V。

2.4 數(shù)據(jù)分析計(jì)算公式及相關(guān)參數(shù)

實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠、beagle犬、人等三個(gè)種屬的肝微粒生物基質(zhì)對(duì)NCP4進(jìn)行體外溫孵，采用高效液相色譜法對(duì)NCP4的剩余量進(jìn)行測(cè)定，并且計(jì)算相關(guān)的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

肝微粒體代謝穩(wěn)定性相應(yīng)的參數(shù)估算公式如下：

T1/2=0.693/k

(1)

CHint=0.693/T1/2×[Incubation(mL)/Microsomes(mg)]×[Microsomes(mg)/Liver(g)]×[Liver(g)/BW(kg)]

(2)

CLh=(Qh×CLint)/(Qh×CLint)

(3)

公式(2)和公式(3)中各參數(shù)均為經(jīng)驗(yàn)值，相關(guān)數(shù)值經(jīng)參考文獻(xiàn)總結(jié)見表1。

表1 肝微粒體生化參數(shù)經(jīng)驗(yàn)值Table 1 The empirical values of liver microsomes biochemical parameters

3 結(jié)果

3.1 NCP4分別在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3.1.1 NCP4在SD大鼠肝微粒體樣品中的體外代謝穩(wěn)定性

將NCP4在0 min時(shí)的峰面積作為100%，其他時(shí)間點(diǎn)與0 min時(shí)間點(diǎn)的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結(jié)果見表2，可以看出NCP4在60 min內(nèi)代謝完全。將各時(shí)間點(diǎn)NCP4的剩余百分比的自然對(duì)數(shù)與相應(yīng)的孵育時(shí)間進(jìn)行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關(guān)系良好的ln(area%)與孵育時(shí)間計(jì)算結(jié)果見圖1。回歸方程：y=-0.132 9x+4.718 6，R2=0.994 8，說明NCP4在鼠肝微粒體孵育體系中0～30 min時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性消除。由公式(1)-(3)計(jì)算NCP4在SD大鼠肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為5.21 min、11.91 mL/min/kg和9.80 mL/min/kg。

3.1.2 NCP4在beagle犬肝微粒體樣品中的體外代謝穩(wěn)定性

NCP4在0 min時(shí)的峰面積作為100%，其他時(shí)間點(diǎn)與0 min時(shí)間點(diǎn)的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結(jié)果見表3，可以看出NCP4在90 min內(nèi)代謝完全。將各時(shí)間點(diǎn)NCP4的剩余百分比的自然對(duì)數(shù)與相應(yīng)的孵育時(shí)間進(jìn)行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關(guān)系良好的ln(area%)與孵育時(shí)間計(jì)算結(jié)果見圖2?；貧w方程：y=-0.062 2x+4.474 9，R2=0.994 3，說明NCP4在狗肝微粒體孵育體系中0～60 min時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性消除。由公式(1)～(3)計(jì)算NCP4在狗肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為11.1 min、7.78 mL/min/kg和6.22 mL/min/kg。

表2 NCP4在鼠肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結(jié)果Table 2 The remaining percentage of NCP4 in rat liver microsome incubation system (area%)

圖1 NCP4在SD大鼠微粒體孵育體系中l(wèi)n(area%) 值與孵育時(shí)間的線性關(guān)系圖Fig.1 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in SD rat microsome incubation system

3.1.3 NCP4在人肝微粒體樣品中的體外代謝穩(wěn)定性

NCP4在0 min時(shí)的峰面積作為100%，其他時(shí)間點(diǎn)與0 min時(shí)間點(diǎn)的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結(jié)果見表4，可以看出NCP4在120 min內(nèi)代謝完全。將各時(shí)間點(diǎn)NCP4的剩余百分比的自然對(duì)數(shù)值與相應(yīng)的孵育時(shí)間進(jìn)行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關(guān)系良好的ln(area%)值與孵育時(shí)間計(jì)算結(jié)果見圖3?；貧w方程：y=-0.040 9x+4.470 5，R2=0.990 3，說明NCP4在人肝微粒體孵育體系中0～90 min時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性消除。由公式(1)～(3)計(jì)算NCP4在人肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為16.9 min、2.54 mL/min/kg和2.29 mL/min/kg。

表3 NCP4在beagle犬肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結(jié)果Table 3 The remaining percentage (area%) of NCP4 in beagle canine liver microsome incubation system

圖2 NCP4在beagle犬肝微粒體孵育體系中l(wèi)n(area%) 值與孵育時(shí)間的線性關(guān)系圖 Fig.2 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in beagle dog liver microsome incubation system

表4 NCP4在人肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結(jié)果Table 4 The remaining percentage (area%) of NCP4 in human liver microsome incubation system

圖3 NCP4在人肝微粒體孵育體系中l(wèi)n(area%) 值與孵育時(shí)間的線性關(guān)系圖Fig.3 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in human liver microsome incubation system

圖4 NCP4在不同種屬肝微粒體中孵育結(jié)果Fig.4 Incubation results of NCP4 in different species liver microsomes incubation system

3.2 NCP4在不同種屬肝微粒體孵育液中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1 NCP4在SD大鼠肝微粒體溫孵樣品中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

NCP4在SD大鼠肝微粒體溫孵體系下溫孵60 min(圖5c)和120 min(圖5d)后，發(fā)現(xiàn)均有4個(gè)新增的主要色譜峰，見圖5，NCP4及各產(chǎn)物的m/z[M+Na]+和保留時(shí)間數(shù)據(jù)如表5所示。其中M1和M2的m/z[M+Na]+均為502，比NCP4少了14，推測(cè)M1和M2均是NCP4脫去一分子甲基，M1和M2是同分異構(gòu)體。M3的m/z[M+Na]+比NCP4(m/z516)要少56，推測(cè)M3是NCP4末端-O-C-斷裂脫去C4H9。M4的分子離子比NCP4少172，推測(cè)M4的代謝過程較為復(fù)雜。推測(cè)各個(gè)化合物的代謝途徑如圖6(A、B)所示。

圖5 SD大鼠肝微粒體溫孵樣時(shí)間點(diǎn)LC-UV分析色譜圖Fig.5 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(zhì)(a)、0 min(b) 、60 min(c)、120 min(d)；M1,M2,M3,M4均為NCP4在SD大鼠肝微粒體中溫孵后的代謝產(chǎn)物 Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c)，120 min (d);M1, M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in rat liver microsomes incubation systems

3.2.2 NCP4在beagle犬肝微粒體溫孵樣品中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推斷

NCP4在beagle犬肝微粒體溫孵體系下溫孵不同時(shí)間的樣品在確定HPLC-UV-MS(Q-TOF)分離鑒別條件下進(jìn)行分析，其中與空白基質(zhì)和0 min點(diǎn)溫孵樣品比較，代謝產(chǎn)物較明顯的是60 min(圖7c)和120 min(圖7d)溫孵樣品。NCP4及各產(chǎn)物的m/z[ M+Na]+和保留時(shí)間數(shù)據(jù)如表6所示。推測(cè)可能的代謝途徑如圖8(A、B、C)所示。

表5 NCP4在SD大鼠肝微粒體孵育60 min后的降解產(chǎn)物色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 5 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in SD rat liver microsomes (incubation time:60 min)

圖6 NCP4在鼠肝微粒體中代謝途徑推測(cè)Fig.6 Metabolic pathways of NCP4 metabolic product in SD rat liver microsome 注：A.代謝產(chǎn)物M1,M2,M3代謝途徑；B.代謝產(chǎn)物M4代謝途徑。Note:A.metabolic pathway of M1,M2 and，M3;B.metabolic pathway of M4 metabolic pathway.

3.2.3 NCP4在人肝微粒體溫孵樣品中代謝產(chǎn)物鑒定

NCP4在人肝微粒體溫孵體系下溫孵不同時(shí)間的樣品在確定的HPLC-UV-MS(Q-TOF)分離鑒別條件下進(jìn)行分析，其中與空白基質(zhì)和0 min點(diǎn)溫孵樣品比較，代謝產(chǎn)物較明顯的是60 min(圖9c)和120 min(圖9d)溫孵樣品。NCP4及各產(chǎn)物的m/z[M+Na]+和保留時(shí)間數(shù)據(jù)如表7所示。我們發(fā)現(xiàn)NCP4在人和beagle犬肝微粒體中的代謝產(chǎn)物一致，推測(cè)代謝途徑也一致(見圖8)。

圖7 Beagle犬肝微粒體溫孵樣時(shí)間點(diǎn)的LC-UV圖Fig.7 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(zhì)(a)、0 min(b)、60 min(c)、120 min(d)；M5,M6,M7,M8均為NCP4在犬肝微粒體中溫孵后的代謝產(chǎn)物。Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c),120 min (d);M1,M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in dog liver microsome incubation systems.

表6 NCP4在Beagle犬肝微粒體溫孵60 min后的降解產(chǎn)物色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 6 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in Beagle dog liver microsome incubation systems (incubation time:60 min)

4 討論

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)NCP4在不同種屬(SD大鼠、Beagle犬、人)肝微粒體溫孵體系中的底物代謝穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，不同種屬肝微粒體孵育體系中NCP4的剩余量百分比與孵育時(shí)間的相關(guān)圖見圖4，可見體外代謝穩(wěn)定性動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致，其中Beagle犬與人肝微粒體溫孵體系中的底物代謝穩(wěn)定性更為接近。

根據(jù)NCP4的剩余量與孵育時(shí)間以及肝微粒體生化參數(shù)經(jīng)驗(yàn)值，計(jì)算SD大鼠、Beagle犬和人肝微粒體溫孵代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tl/2(min)、CLint(mL/min/kg)和CLh(mL/min/kg)，結(jié)果表明：NCP4在SD大鼠、Beagle犬和人三種不同種屬肝微粒體中代謝半衰期Tl/2(min) 、CLint(mL/min/kg )和CLh(mL/min/kg)范圍分別為5.21±277.2 min、2.54±11.91 mL/min/kg、2.29±9.80 mL/min/kg，其中Beagle犬和人肝微粒體溫孵代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tl/2(min)相當(dāng)，說明Beagle犬與人肝微粒體溫孵體系中NCP4底物的代謝穩(wěn)定性基本一致。

圖8 NCP4在beagle犬及人肝微粒體中代謝途徑推測(cè)Fig.8 Metabolic pathways of NCP4 metabolic product in beagle dogs and human liver microsome 注：A.代謝產(chǎn)物M6,M7代謝途徑；B.代謝產(chǎn)物M5代謝途徑；C.代謝產(chǎn)物M8代謝途徑。Note:A.metabolic pathway of M6,M7;B.metabolic pathway of M5 metabolic pathway;C.metabolic pathway of M8.

圖9 人肝微粒體溫孵樣時(shí)間點(diǎn)的LC-UV圖Fig.9 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(zhì)(a)、0 min(b)、60 min(c)、120 min(d)；M5,M6,M7,M8均為NCP4在人肝微粒體中溫孵后的代謝產(chǎn)物。Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c),120 min (d);M1,M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in human liver microsome incubation systems.

表7 NCP4在人肝微粒體溫孵60 min后的降解產(chǎn)物色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 7 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in human liver microsome incubation systems (incubation time:60 min)

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還分別對(duì)NCP4在不同種屬(SD大鼠、beagle犬、人)肝微粒體溫孵體系中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明NCP4在SD大鼠肝微粒體中生成m/z[M+Na]+為502、460、344的代謝產(chǎn)物，在Beagle犬、人肝微粒體中生成m/z[M+Na]+為388、390、448的代謝產(chǎn)物。表明NCP4在犬及人肝微粒體中代謝產(chǎn)物相同。

綜上所述，我們可以選擇beagle犬作為NCP4臨床前研究的動(dòng)物模型，用于NCP4的臨床前藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)等相關(guān)研究。