李 瑩，康寧芳，鞏仔鵬，陳思穎，蘭燕宇

貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心藥學(xué)院，貴陽 550004

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的全身性免疫病，其主要癥狀是多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外損傷，它通常會(huì)導(dǎo)致腫脹、發(fā)紅、疼痛、關(guān)節(jié)損傷畸形等，嚴(yán)重危害病人的健康[1]。由于目前該病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床治療往往以西藥為主，作用機(jī)制呈現(xiàn)單一的特點(diǎn)，因此亟需新型安全、療效獨(dú)特的治療藥物。在治療RA方面，我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)通過“整體觀念、辨證論治”，將中藥應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，展現(xiàn)了其“多成分、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)和治療優(yōu)勢(shì)。

紅禾麻又名“紅活麻”，系蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻L(zhǎng)aporteabulbifera(Sieb.et Zucc.)Wedd.的新鮮或干燥全草[2]，是貴州地區(qū)用于治療風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用苗藥，其主要化學(xué)成分包括內(nèi)酯類、鞣質(zhì)類、黃酮類及苯丙素類等[3-6]。紅禾麻藥用價(jià)值較高，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、祛風(fēng)濕、免疫抑制等作用[7,8]。目前，關(guān)于紅禾麻的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在藥理作用及化學(xué)成分等方面，未見紅禾麻體內(nèi)吸收及其影響因素的報(bào)道，尤其是RA病理狀態(tài)下的腸吸收研究尚屬空白。Gong等[9]認(rèn)為，疾病狀態(tài)會(huì)影響中藥的藥代動(dòng)力學(xué)特征，生理及病理狀況的變化在一定程度上會(huì)影響體內(nèi)藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞膜通透性、微生物菌群等的改變，導(dǎo)致中藥在機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程發(fā)生顯著改變。故本研究采用在體循環(huán)腸灌流法，考察紅禾麻提取物中8種代表成分在生理病理狀態(tài)下的腸吸收差異，探討不同因素對(duì)其腸吸收特性的影響，為紅禾麻臨床治療RA的合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

Acquity UPLC超高壓液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司，包括Masslynx 4.1質(zhì)譜儀工作站)；PV-200型足趾容積測(cè)量?jī)x(成都泰盟生物有限公司)；HL-2S型恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)；紅禾麻藥材采收于貴州省貴安新區(qū)，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物紅禾麻L(zhǎng)aporteabulbifera(Sieb.et Zucc.)Wedd.的新鮮全草；新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品(江西佰草源生物科技有限公司，批號(hào)分別為BCY-0921，BCY-0414，BCY-0920，純度均≥98%)；蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、木犀草苷、葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100080-201610、112007-201602、111538-201606、111809-201403、111720-201408、110752-201514，純度均≥98%)；完全弗式佐劑(CFA，sigma公司，批號(hào)：SLBW5971)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國(guó)Merck公司)；水為超純水。

健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重 220～250 g，購于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：1503017。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱 Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速 0.35 mL/min；柱溫 45 ℃；流動(dòng)相 0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件(0～0.5 min，5%～9% A；0.5～2.0 min，9%～15% A；2.0～4.0 min，15%～20% A；4.0～4.5 min，20%～95% A；4.5～5.0 min，95%～5% A)，進(jìn)樣體積3 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)；毛細(xì)管電壓3 KV；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣 N2，流速800 L/h；反吹氣 N2，流速50 L/h；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V 4.1工作站；掃描方式為單離子監(jiān)測(cè)(SIR)。監(jiān)測(cè)離子：m/z(-)353.3(新綠原酸)；m/z(-)353.1(綠原酸)；m/z(-)353.2(隱綠原酸)；m/z(-)609.1(蘆丁)；m/z(-)463.0(異槲皮苷)；m/z(+)449.1(槲皮苷)；m/z(-)593.0(山奈酚-3-O-蕓香糖苷)；m/z(-)447.3(木犀草苷)；m/z(+)417.0(葛根素)；錐孔電壓分別為：25、35、35、50、45、30、50、35、25。

2.2 溶液的配制

K-R營(yíng)養(yǎng)液[11]：精密稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，CaCl20.37 g，葡萄糖1.40 g，溶解在少量水中，氯化鈣單獨(dú)溶解并逐滴加入，蒸餾水溶解后定容至1 L。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，得濃度為葛根素(1.280 mg/mL)的儲(chǔ)備液。置于冰箱-20 ℃保存，備用。

混合對(duì)照品溶液：精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，得濃度分別為新綠原酸(1.024 mg/mL)、綠原酸(1.114 mg/mL)、隱綠原酸(1.086 mg/mL)、蘆丁(0.508 mg/mL)、異槲皮苷(0.538 mg/mL)、槲皮苷(0.710 mg/mL)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(0.531 mg/mL)、木犀草苷 (1.022 mg/mL)的儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液適量，37 ℃氮?dú)庀麓蹈?，空白K-R營(yíng)養(yǎng)液溶解并逐級(jí)稀釋至所需質(zhì)量濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于冰箱-20 ℃保存，備用。

空白腸循環(huán)液：取37 ℃ K-R液50 mL，置于量筒中，進(jìn)行在體腸灌流試驗(yàn)，循環(huán)3 h，即得。

紅禾麻提取物供試液[10,11]：取紅禾麻藥材5 kg干燥打粗粉并均勻混合，按文獻(xiàn)方法[6]回流提取，即得紅禾麻固體提取物，提取率為2.87%。取上述提取物適量，加入適量的K-R營(yíng)養(yǎng)液，超聲30 min溶解，5 000 rpm 離心10 min，取上清液，即得2.5、5.0、10.0 mg/mL的供試液。經(jīng)UPLC-MS/MS法測(cè)定，紅禾麻提取物中各成分的含量分別為新綠原酸(2.32%)，綠原酸(6.54%)，隱綠原酸(4.68%)，蘆丁(11.45%)，槲皮苷(0.63%)，異槲皮苷(2.15%)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷(2.30%)，木犀草苷(1.04%)。

2.3 大鼠在體腸吸收試驗(yàn)

2.3.1 大鼠分組與造模

將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。根據(jù)文獻(xiàn)方法[12]，模型組采用0.1 mL完全弗氏佐劑(CFA)注射于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)，使其致炎，正常組注射相應(yīng)體積的生理鹽水，并在7天后再次免疫，持續(xù)21天后，佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型成功復(fù)制。由于AA大鼠模型的臨床表現(xiàn)、病理機(jī)制、免疫學(xué)變化等方面與RA有諸多相似性，故選用此模型。

參照文獻(xiàn)方法[13]，分別于大鼠造模前及造模后第9、13、17、21天按照關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)AA大鼠進(jìn)行評(píng)估，累計(jì)評(píng)分>6分的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(0～4級(jí))Table 1 Rat arthritis index scoring criteria (grade 0-4)

2.3.2 在體循環(huán)腸灌流試驗(yàn)

正常和AA模型大鼠禁食不禁水12 h，麻醉(腹腔注射10%水合氯醛，3.7 mL/kg)后固定于手術(shù)臺(tái)上，其余按照文獻(xiàn)方法操作[14,15]，使試驗(yàn)?zāi)c段與恒流泵形成回路。取37 ℃紅禾麻提取物溶液50 mL，以5 mL/min流速循環(huán)15 min后，將流速調(diào)節(jié)為2.5 mL/min，立刻讀出腸循環(huán)液的體積并從循環(huán)液量筒中取樣1 mL，作為零時(shí)間的樣品。另需向量筒中補(bǔ)加37 ℃ K-R營(yíng)養(yǎng)液1 mL，其后于30、60、90、120、150、180 min時(shí)同法讀數(shù)，取樣并補(bǔ)加 K-R液，循環(huán)3h后終止。待循環(huán)完畢后，用空氣排凈管路和腸道內(nèi)液體，并量取其體積，即為管路、腸道的死體積。死體積加上各時(shí)間點(diǎn)的量筒讀數(shù)體積即為該時(shí)間點(diǎn)循環(huán)液體積。以此方法進(jìn)行腸循環(huán)液的體積校正，進(jìn)而計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)藥物的量，即剩余藥量Ptn(μg)。

A%=(Pt0-Pt3)/Pt0×100%

其中，Ptn為 tn 時(shí)刻循環(huán)液中的剩余藥量；Ct1為循環(huán)液藥物初始濃度；Vt1為循環(huán)液初始體積；Ctn(i=n)為tn時(shí)刻腸循環(huán)液藥物濃度；Vtn為 tn 時(shí)刻腸循環(huán)液體積；Pt0為0 h時(shí)的剩余藥量；Pt3為3 h時(shí)的剩余藥量；A為3 h累積吸收轉(zhuǎn)化率。以剩余藥量的自然對(duì)數(shù)對(duì)取樣時(shí)間t作圖，所得的直線斜率即為吸收速率常數(shù)(Ka)。

2.4 樣品處理方法

取樣品200 μL，加入葛根素(1.0 μg/mL)內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，0.1%甲酸水溶液40 μL，加入甲醇400 μL，渦混3 min，超聲(80 Hz)10 min，12 000 rpm離心10 min。取上清液于37 ℃氮?dú)庀麓蹈?，殘?jiān)尤?00 μL 50%甲醇水溶解，渦混3 min，超聲(80 Hz)10 min，12 000 rpm離心10 min，取上清液UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性

取空白腸循環(huán)液、空白腸循環(huán)液加內(nèi)標(biāo)及混合對(duì)照品溶液、含紅禾麻提取物的實(shí)測(cè)樣品，按“2.4”、“2.1”項(xiàng)下操作，得到色譜圖A、B、C。結(jié)果表明8種成分分離完全，空白腸循環(huán)液無干擾，各成分及葛根素的保留時(shí)間(RT)分別為1.12、1.49、1.58、1.86、2.89、3.04、3.17、3.47、3.70 min，該法的專屬性良好。

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram 注：A:空白腸循環(huán)液；B:空白腸循環(huán)液加對(duì)照；C:實(shí)測(cè)腸循環(huán)液樣品；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.葛根素；5.蘆?。?.異槲皮苷；7.槲皮苷；8.山奈酚-3-O-蕓香糖苷；9.木犀草苷;Note：A:blank solution;B:blank solution spiked with standands;C:real sample;1.neochlorogenic acid;2.chlorogenic acid;3.cryptochlorogenic acid;4.puerarin；5.rutin;6.isoquercetin;7.quercetin;8.kaempferol-3-O-rutinoside;9.galuteolin.

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限、最低檢測(cè)限

取“2.2”項(xiàng)下系列濃度混合對(duì)照品溶液200 μL(新綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.37、0.74、1.49、2.98、5.95、11.91 μg/mL，綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.81、1.62、3.24、6.48、12.95、25.91 μg/mL，隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.79、1.58、3.16、6.31、12.63、25.26 μg/mL，蘆丁質(zhì)量濃度分別為2.95、5.91、11.81、23.63、47.25、94.50 μg/mL，異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.13、6.26、12.51 μg/mL，槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.19、0.37、0.74、1.49、2.97、5.94 μg/mL，山奈酚-3-O-蕓香糖苷質(zhì)量濃度分別為0.77、1.54、3.09、6.17、12.35、24.70 μg/mL，木犀草苷質(zhì)量濃度分別為0.77、1.55、3.10、6.19、12.38、24.77 μg/mL)，按“2.4”、“2.1”項(xiàng)下操作。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(A/Ai()為縱坐標(biāo)(Y(，各物質(zhì)濃度((C()為橫坐標(biāo)(X(進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1/(X(，獲得回歸方程。最低定量限(LLOQ)定義為S/N=10，最低檢測(cè)限(LLOD)定義為S/N=3。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程依次為y= 0.966 7x+ 0.374 7(r=0.999 1)、y=0.753 6x+0.440 1(r=0.999 5)、y= 1.238 9x+0.515 8(r=0.999 6)、y= 3.607 8x+2.185 3(r=0.999 2)、y=4.424 4x+0.567 0(r=0.999 6)、y=8.327 9x+1.050 8(r=0.999 4)、y= 4.389 9x+3.349 9(r=0.999 2)、y=1.829 5x+1.111 7(r=0.999 2)。各成分在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.999)，LLOQ分別為0.37、0.81、0.79、2.95、0.39、0.19、0.77、0.77 μg/mL，LLOD分別為0.022、0.045、0.038、0.168、0.021、0.018、0.053、0.059 μg/mL。

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度

按“3.1.2”項(xiàng)下方法，分別配制同一分析批的8種成分定量下限以及低、中、高濃度(新綠原酸0.74、2.23、8.93 μg/mL；綠原酸1.62、4.86、19.43 μg/mL；隱綠原酸1.58、4.74、18.94 μg/mL；蘆丁5.91、17.72、70.88 μg/mL；異槲皮苷0.78、2.35、9.38 μg/mL；槲皮苷0.37、1.11、4.46 μg/mL；山奈酚-3-O-蕓香糖苷1.54、4.63、18.52 μg/mL；木犀草苷1.55、4.64、18.57 μg/mL)混合質(zhì)控(QC)樣品，各濃度平行制備5份，按“2.4”、“2.1”項(xiàng)下操作，考察批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；同法配制3個(gè)分析批的定量下限以及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，各樣品連續(xù)進(jìn)樣3天，各濃度平行測(cè)定5次，考察批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表示:批內(nèi)精密度的RSD為2.84%～9.45%，準(zhǔn)確度(RE)為-3.82%～7.56%；批間精密度的RSD為9.35%～10.22%，準(zhǔn)確度(RE)為-4.26%～5.45%，符合生物樣品的測(cè)定要求。

3.1.4 提取回收率

取“2.2”項(xiàng)下空白腸循環(huán)液200 μL，置于1.5 mL離心管中，分別加入“3.1.2”項(xiàng)下方法配制的系列濃度混合對(duì)照品溶液適量，按“2.4”、“2.1”項(xiàng)下操作，得各成分峰面積(A提取)；另取空白腸循環(huán)液200 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理至氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤胂鄳?yīng)質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，使最終質(zhì)量濃度與前者一樣，再按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣，得各成分峰面積(A未提取)；提取回收率=(A提取/A未提取)×100%。每個(gè)質(zhì)量濃度平行5個(gè)樣本。結(jié)果表明，8種成分的提取回收率為71.45%～83.26%(RSD<7%，n=5)；內(nèi)標(biāo)的提取回收率為80.22%～ 85.12%(RSD<8%，n=5)。

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng)

取“2.2”項(xiàng)下低、中、高濃度混合對(duì)照品溶液適量，37 ℃氮?dú)庀麓蹈?，加入空白腸循環(huán)液200 μL使溶解，按“2.4”、“2.1”項(xiàng)下操作，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣5次，記錄峰面積(A1)；另取對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液適量，37 ℃氮?dú)庀麓蹈桑尤?0%甲醇200 μL使溶解，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣5次，記錄峰面積(A2)；基質(zhì)效應(yīng)=A1/ A2×100%。結(jié)果表明，各待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)為81.35%～ 112.65%(RSD<8%，n=5)，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為86.22%～105.43%(RSD<8%，n=5)，基質(zhì)效應(yīng)不影響待測(cè)物的測(cè)定。

3.1.6 穩(wěn)定性

在組織胚胎學(xué)中，外分泌腺根據(jù)腺細(xì)胞的數(shù)目，可以被分為單細(xì)胞腺和多細(xì)胞腺。其中單細(xì)胞腺是單個(gè)有分泌機(jī)能的腺上皮細(xì)胞。這種腺上皮細(xì)胞呈杯狀，分泌粘液。由許多上皮細(xì)胞構(gòu)成的腺被稱為多細(xì)胞腺，多細(xì)胞腺分為兩部分：導(dǎo)管與腺體。多細(xì)胞的外分泌腺根據(jù)腺體部的形態(tài)及導(dǎo)管的分枝與不分枝，可分類如下：

按“3.1.2”項(xiàng)下方法配制各待測(cè)物低、中、高質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下處理后，分別于0、2、4、6、8、12 h(室溫)取樣，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣，以各指標(biāo)成分峰面積計(jì)算該樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各成分的RSD值均小于8.5%(n=6)，提示腸灌流液樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 紅禾麻提取物的腸吸收試驗(yàn)

3.2.1 紅禾麻提取物的PH對(duì)腸吸收的影響

取AA模型大鼠與正常SD大鼠各16只，每組4只，選擇5.0 mg/mL紅禾麻提取物溶液作為腸灌流液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，考察AA模型與正常大鼠在不同pH(5.0、6.0、6.8、7.4)紅禾麻提取物中各成分的A和Ka，見表2～3。結(jié)果表明，正常組與AA模型組中各成分的吸收均受pH的影響，pH為6.0時(shí)各成分的A和Ka較大，故選擇pH6.0的紅禾麻提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 pH值對(duì)正常大鼠8種成分腸吸收的影響Table 2 Effect of pHvalue on intestinal absorption of 8 components in normal

續(xù)表2(Continued Tab.2)

化合物CompoundpH5.0pH6.0pH6.8pH7.4A(%)Ka(min-1)A(%)Ka(min-1)A(%)Ka(min-1)A(%)Ka(min-1)A(%)Ka(min-1)蘆丁Rutin29.6±1.10.198±0.625?34.9±2.10.915±0.02222.9±1.20.522±0.003?23.0±1.20.552±0.009?異槲皮苷Isoquercetin39.4±4.20.307±0.25743.9±8.70.373±0.04336.1±3.50.270±0.01628.5±5.2?0.222±0.016槲皮苷Quercetin17.4±1.1?0.251±0.094?21.9±3.10.113±0.08916.9±2.8?0.095±0.01513.5±3.00.080±0.023?山奈-3-O-蕓香糖苷Kaempferol-3-O-rutinoside26.1±2.60.313±0.22236.3±2.20.316±0.01322.7±2.00.126±0.026?34.1±2.10.065±0.009木犀草苷Galuteolin32.1±3.20.254±0.072?44.0±3.30.327±0.02536.6±2.00.043±0.005?26.1±2.10.026±0.010

注：與pH6.0組相比，*P<0.05；與正常組相同pH相比，aP<0.05。

Note:Compared with pH6.0,*P<0.05;Compared with the normal group at the same pH,aP<0.05.

表3 pH值對(duì)AA模型大鼠8種成分腸吸收的影響Table 3 Effect of pHvalue on intestinal absorption of 8 components in AA model

注：與pH6.0組相比，*P<0.05；與正常組相同pH相比，aP<0.05。

Note:Compared with pH6.0,*P<0.05;Compared with the normal group at the same pH,aP<0.05.

3.2.2 紅禾麻提取物的質(zhì)量濃度對(duì)腸吸收的影響

考察質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0 mg/mL(pH6.0)的紅禾麻提取物供試液，各取50 mL置于37 ℃恒溫水浴中，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行大鼠在體循環(huán)腸灌流實(shí)驗(yàn)，考察供試液中8種成分的A和Ka，見表4和5。結(jié)果表明，在考察濃度范圍內(nèi)，病理及生理狀態(tài)下的槲皮苷存在高濃度飽和現(xiàn)象，表明其體內(nèi)吸收方式為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，其余7個(gè)成分的A和Ka呈隨著濃度的增加而增大的趨勢(shì)，提示其余7個(gè)成分的吸收機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。

與正常組同一濃度相比，模型組中各成分的吸收趨勢(shì)總體上優(yōu)于正常組。AA模型組中蘆丁與槲皮苷在低、中濃度下的A、Ka值顯著高于正常大鼠，山奈酚-3-O-蕓香糖苷在高濃度時(shí)的A、Ka顯著高于正常大鼠，推測(cè)病理狀態(tài)下，AA模型大鼠的腸黏膜通透性增加，吸收增強(qiáng)。

3.2.3 紅禾麻提取物在不同腸段的吸收特征

表4 濃度對(duì)正常大鼠8種成分腸吸收的影響Table 4 Effect of concentration on intestinal absorption of 8 components in normal

注：與高濃度組相比，*P<0.05；與正常組相同濃度相比，aP<0.05。

Note:Compared with high concentration,*P<0.05;Compared with the normal group at the same concentration,aP<0.05.

表5 濃度對(duì)AA模型大鼠8種成分腸吸收的影響Table 5 Effect of concentration on intestinal absorption of 8 components in AA model

注：與高濃度組相比，*P<0.05；與正常組相同濃度相比，aP<0.05。

Note:Compared with high concentration,*P<0.05;Compared with the normal group at the same concentration,aP<0.05.

3.2.4 膽汁和P-gp對(duì)紅禾麻提取物腸吸收的影響

取AA模型大鼠與正常SD大鼠各12只，每組4只，模型與正常大鼠均分為對(duì)照組(結(jié)扎總膽管，不加P-gp抑制劑)、不結(jié)扎組(不結(jié)扎總膽管，不加P-gp抑制劑)；P-gp抑制劑組(結(jié)扎總膽管，加P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米108 μg/L)。選擇5.0 mg/mL (pH6.0)紅禾麻提取物溶液作為腸灌流液，以全腸段為目標(biāo)腸段，通過方差分析比較A，考察膽汁及P-gp對(duì)紅禾麻提取物吸收的影響，見表8和9。

表6 腸段對(duì)正常大鼠8種成分腸吸收的影響Table 6 Effect of intestinal segment on intestinal absorption of 8 components in normal

注：與十二指腸組相比，*P<0.05；與正常組相同腸段相比，aP<0.05。

Note:Compared with the duodenum,*P<0.05;Compared with the normal group at the same intestine,aP<0.05.

表7 腸段對(duì)AA模型大鼠8種成分腸吸收的影響Table 7 Effect of intestinal segment on intestinal absorption of 8 components in AA model

注：與十二指腸組相比，*P<0.05；與正常組相同腸段相比，aP<0.05。

Note:Compared with the duodenum,*P<0.05;Compared with the normal group at the same intestine,aP<0.05.

結(jié)果表明，與結(jié)扎膽總管后的對(duì)照組相比，膽汁對(duì)正常組中的綠原酸、蘆丁、木犀草苷有顯著抑制作用，對(duì)槲皮苷有顯著促進(jìn)作用；此外，膽汁對(duì)模型組中新綠原酸、蘆丁有顯著抑制作用，對(duì)異槲皮苷、槲皮苷有顯著促進(jìn)作用。故實(shí)驗(yàn)之前需進(jìn)行膽管結(jié)扎，以排除膽汁對(duì)各成分的影響，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

與未加P-gp抑制劑的對(duì)照組相比，正常與AA模型組的腸吸收均受鹽酸維拉帕米的影響。正常大鼠與AA模型大鼠中綠原酸的A和Ka值均有所減小，但對(duì)槲皮苷的吸收明顯增加，推測(cè)槲皮苷可能是P-gp的底物。與正常組相比，AA模型組中各成分在腸道的吸收總體上增加。

表8 膽汁和P-gp抑制劑對(duì)正常大鼠8種成分腸吸收的影響Table 8 Effect of bile and p-gp inhibitor on intestinal absorption of 8 components in normal

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與正常組相同項(xiàng)下相比，aP<0.05.

Note:Compared with the control,*P<0.05;Compared with the normal group at the same item,aP<0.05.

表9 膽汁和P-gp抑制劑對(duì)AA模型大鼠8種成分腸吸收的影響Table 9 Effect of bile and p-gp inhibitor on intestinal absorption of 8 components in AA model

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與正常組相同項(xiàng)下相比，aP<0.05.

Note:Compared with the control,*P<0.05;Compared with the normal group at the same item,aP<0.05.

4 討論

紅禾麻提取物中8個(gè)成分在腸道的吸收試驗(yàn)表明，正常與病理狀態(tài)下，槲皮苷不完全依賴濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)，其在小腸的吸收方式可能為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，其余7個(gè)成分的吸收速率與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系，提示其吸收機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散，各成分的吸收均受pH、膽汁和P-gp的影響。除綠原酸和隱綠原酸外，正常大鼠對(duì)其余各成分的總體吸收趨勢(shì)為回腸>十二指腸>空腸>結(jié)腸，AA模型對(duì)其余各成分的總體吸收趨勢(shì)為十二指腸>回腸>空腸>結(jié)腸。與正常大鼠相比，AA模型大鼠的主要吸收部位為十二指腸，各成分的吸收趨勢(shì)優(yōu)于正常大鼠，表明RA可能會(huì)使紅禾麻提取物中某些成分從小腸中的最大吸收部位后移，推測(cè)病理狀態(tài)可能會(huì)改變藥物的主要吸收部位，猜測(cè)其原因可能為[16]炎癥能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上有關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)、細(xì)胞膜的通透性，從而可能使藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為發(fā)生變化，但具體機(jī)制尚待探究。

因AA模型與人RA在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、病理、免疫等方面有諸多相似性，且AA模型易于操作，越來越被研究者所認(rèn)可。在該實(shí)驗(yàn)中，造模大鼠的關(guān)節(jié)表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)，如短時(shí)間內(nèi)不同程度的發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹等，表明該模型建立成功，與文獻(xiàn)中報(bào)道[17]一致。

在體循環(huán)灌流模型既保證了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液和淋巴液的供應(yīng)，又提高了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各腸段的生物活性，且該模型能較好的模擬人體體內(nèi)環(huán)境，更接近生物體本身，因而能夠真實(shí)地反映藥物的吸收情況。但該法也有一定的局限性[18]：(1)在探討腸段對(duì)紅禾麻提取物腸吸收的過程中，通過結(jié)扎各腸段來形成灌流通路，以等濃度的藥物灌流液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但在實(shí)際情況中，藥物口服后，依次經(jīng)過十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸，到達(dá)各腸段的藥物濃度往往不相等，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏倚；(2)在體循環(huán)實(shí)驗(yàn)中，灌流時(shí)間較長(zhǎng)，可能對(duì)腸黏膜造成損傷，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差。

P-gp能夠與藥物結(jié)合使藥物外排出細(xì)胞外，從而影響藥物的吸收，導(dǎo)致進(jìn)入體內(nèi)的濃度降低而影響藥物發(fā)揮效應(yīng)。鹽酸維拉帕米既是P-gp底物，又是其外排的典型抑制劑，在小腸的吸收較完全，被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中，加入P-gp抑制劑維拉帕米后，不同狀態(tài)下槲皮苷的A和Ka顯著性增加，表明槲皮苷的吸收受腸道上皮細(xì)胞中P-gp外排的影響，可能是P-gp的底物，為其臨床藥物相互作用的分析提供了重要理論依據(jù)。

研究表明[19]，槲皮苷和異槲皮苷可以完整的分子形式透過單層Caco-2細(xì)胞而被腸道收，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)和基底側(cè)存在廣泛的代謝轉(zhuǎn)化，推測(cè)槲皮素糖苷之間可能具有相同的腸道吸收機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮苷的吸收機(jī)制為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，異槲皮苷的吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，與文獻(xiàn)結(jié)果矛盾，基于此，課題組后續(xù)將采用其他方法和模型(如Caco-2細(xì)胞、離體外翻腸囊法等)對(duì)本研究結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探討紅禾麻提取物在腸道中的吸收特征。