張恩芬，查 飛，周建寶，費芙蓉，王 洲，薛正蓮

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的一種含γ -谷氨?；蛶€基的三肽類化合物，具有清除自由基、延緩衰老、解毒等多種生理功能[1-3]，在臨床上可以用來肝臟保護[4]、治療腫瘤和治療內(nèi)分泌紊亂等疾病[5-6]，同時還廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。因此，全世界科學(xué)家研究的熱點已轉(zhuǎn)向GSH[7]。目前對谷胱甘肽測定方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、酶循環(huán)法等[8]，但成本高、耗時長，不適用于大批量樣品的定量檢測已成為上述方法的缺點。

可見分光光度計是常用于化合物的檢測，酶標(biāo)儀是常用于酶聯(lián)免疫的測定[9]，測定物質(zhì)含量二者均服從朗伯-比爾定律：物質(zhì)在一定波長處的吸光度和濃度之間存在線性關(guān)系，目的是實現(xiàn)對化合物定量的檢測?？梢姺止夤舛扔嫹ㄓ绊懸蛩厣?，操作繁瑣，試劑用量大，耗時長；酶標(biāo)儀影響因素多，但速度快，效率高，試劑用量少，適用于大批量樣品的快速檢測[10]。

考慮到菌種選育過程中，產(chǎn)GSH畢赤酵母突變株的數(shù)量較多，通過孔板發(fā)酵的樣品多，尋找一種快速、高效、精確的測定方法非常重要。本實驗采用酶標(biāo)儀法測定GSH含量，并與分光光度計法進行了比較，用Origin軟件對2種方法進行擬合分析，顯示2 種測定方法具有很好的一致性。到目前為止，尚未見有關(guān)酶標(biāo)儀測定GSH含量方面的相關(guān)研究，酶標(biāo)儀法能夠簡單、高效、精確地測定發(fā)酵液中GSH含量，為高通量選育GSH酵母菌提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

還原型谷胱甘肽(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醛(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司; 鹽酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；Tris(生化試劑) ，生工生物工程股份有限公司;2-硝基苯甲酸(DTNB)標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑) ，生工生物工程股份有限公司; FC型酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific; 常溫室壓等離子體(ARTP) ，北京思清源生物科技有限公司; 單道手動可調(diào)移液器，Sartorius; 723N 可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司; Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。

1.2 菌種

畢赤酵母：本實驗室保藏。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

1.3.1 培養(yǎng)基

種子/斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10，pH6.0。115°C，滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母粉12.5，(NH4)2SO45，KH2PO49，MgSO4·7H2O 1.0， 用NaOH調(diào)pH至5.0-5.5。115°C，滅菌25min。

1.3.2 試劑

Tris-HCl緩沖液(ph8.0)；3%甲醛；0.1 mmoL/L DTNB： 稱取 0.3964g DTNB 溶于 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，定容至 100m L，儲存于棕色瓶，低溫保存；DTNB分析液：0.01mol/L DTNB 和 0.25mol/L Tris.-HCl 體積比為 1:100 混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實驗方法

1.4.1 GSH測定的原理及方法

比色法測定GSH的原理：DTNB法，還原型谷胱甘肽和5,5-二硫代雙(硝基苯甲酸)反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，在pH8.0，412nm波長處有最大吸收峰。同時利用甲醛掩蔽半胱氨酸等含有巰基的化合物來提高測定方法的準(zhǔn)確性[11-12]。

測定方法：吸取樣液0.5mL，分別添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液1.5 mL、3%甲醛0.5 mL、0.1 mmoL/L DTNB分析液2.5 mL，搖勻，25℃水浴5 min[13]，酶標(biāo)儀在412nm處測定OD值。

1.4.2 谷胱甘肽含量測定中主要影響因素的優(yōu)化

取0.2 g/L、0.3 g/L和0.4 g/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，按1.4.1的測定方法對主要影響因素中的Tris-HCl緩沖液、甲醛、DTNB分析液的添加量進行優(yōu)化。對Tris-HCl緩沖液添加量進行優(yōu)化時0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液取值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；對甲醛的取值分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL；對DTNB分析液的取值分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用蒸餾水和GSH標(biāo)準(zhǔn)液混合配制標(biāo)樣，見表1。精確配制0.2 g/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液。按照優(yōu)化后的方法在412nm下酶標(biāo)儀和可見分光光度計分別測定并對其測定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 精密度試驗

按建立的方法對75 mg/L和135 mg/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算GSH的含量，并進行統(tǒng)計分析。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液GSH和蒸餾水組成表

1.4.5 加標(biāo)回收試驗

分別配制2.4475、4.8950、24.475、75、135 mg/L的GSH按優(yōu)化后的方法測定，并且按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算GSH的含量，然后進行統(tǒng)計分析。

1.4.6 兩種方法的擬合曲線

將實驗中通過ARTP誘變所獲得的45 株畢赤酵母突變株經(jīng)48孔板發(fā)酵制得的發(fā)酵液離心，取上清液1mL，按照優(yōu)化后的方法，采用origin 8. 0軟件擬合酶標(biāo)儀與可見光分光光度計412nm下的測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tris-HCl 緩沖液添加量的影響

按照方法1.4.2見圖1。

圖1 Tris-HCl緩沖液添加量對OD412的影響

如圖1所示，隨著Tris-HCl緩沖液的添加量的增多，OD值先是上升，出現(xiàn)峰值后下降，且0.2 g/L的GSH、0.3 g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.6 mL的0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液時OD值最大，這是由于添加0.6 mL0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液所達(dá)到的pH值是DTNB反應(yīng)的最適pH值，添加量過多過少都不利于反應(yīng)進行，因此，本實驗確定添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液0.6mL。

2.2 3%甲醛添加量的影響

按方法1.4.2所測得的結(jié)果見圖2。

圖2 3%甲醛添加量對OD412的影響

如圖2所示，隨著3%甲醛的添加量的增加，OD值逐漸下降，且不增加，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.1 mL3%甲醛時達(dá)到最高OD值，究其原因為甲醛起到掩蔽劑的作用，掩蔽含巰基的化合物，添加量過多會影響DTNB反應(yīng)，因此，本實驗確定3%甲醛的添加量為0.1 mL。

2.3 DTNB分析液添加量的影響

按方法1.4.2所測得的結(jié)果見圖3。

圖3 DTNB分析液的添加量對OD412的影響

如圖3所示，隨著DTNB分析液的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加1.5mLDTNB分析液達(dá)到最大OD值，其原因為在DTNB反應(yīng)中1.5mL DTNB分析液在一定pH條件下與GSH反應(yīng)，反應(yīng)效率最高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按方法1.4.3分別繪制可見分光光度計與酶標(biāo)儀測定的GSH濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 可見分光光度計的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 酶標(biāo)儀的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5可知，GSH的濃度在0-200mg/L范圍內(nèi)R2=0.9978線性關(guān)系良好，可以用于GSH濃度的測定，酶標(biāo)儀檢測GSH最低檢出限為2.4475mg/L，即空白對照組的OD值帶入標(biāo)曲所得。

2.5 精密度試驗

按方法1.4.精密度試驗結(jié)果見表2，該方法的檢測精密度在低濃度和高濃度都較好，且各組的變異系數(shù)和相對誤差都在5%以下；表明酶標(biāo)儀法測GSH結(jié)果重現(xiàn)性好，精密度高，該方法可行性高。

2.6 加標(biāo)回收試驗

按方法1. 4. 5所測得的結(jié)果見表3。由表可知，以檢測限的10倍加標(biāo)時回收率在88.36%-91.76%之間，以檢測限的2倍加標(biāo)時回收率在101.29%-118.32%之間，而以最低檢測限加標(biāo)時回收率為117.47%?？紤]到加入過多或者過少的標(biāo)準(zhǔn)品，均不能保證加標(biāo)樣品有較好的回收率，當(dāng)濃度范圍為中、高濃度水平時，適用于一般的分析方法，所以，對75mg/L GSH、135mg/L GSH的加標(biāo)回收率進行測定，加標(biāo)回收率在98.12%-107.72%之間，表明酶標(biāo)儀法可以用于GSH濃度的測定。

表3 加標(biāo)回收率

2.7 兩種方法的擬合曲線

按方法1. 4. 6，結(jié)果見圖6。對45株畢赤酵母菌突變株的發(fā)酵液中GSH的含量分別用可見光分光光度計和酶標(biāo)儀進行測定，并對二者進行擬合，驗證兩方法之間的相關(guān)性，擬合曲線見圖6。

圖6 分光光度計法和酶標(biāo)儀法的擬合曲線

兩種方法相關(guān)的方向取決于相關(guān)系數(shù)的正負(fù)，而相關(guān)系數(shù)的絕對值的大小決定了相關(guān)的強弱。統(tǒng)計學(xué)家根據(jù)經(jīng)驗給出了R=0.70作為一個中等到較高的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[14]。本實驗的樣本量為45，相關(guān)系數(shù)R=0.9503，說明酶標(biāo)儀法和可見分光光度計之間具有較高的正相關(guān)性，酶標(biāo)儀法可以作為快速、精確的測定發(fā)酵液中GSH含量的有效方法。

3 結(jié)論

本實驗用DTNB反應(yīng)測定GSH含量，并用酶標(biāo)儀檢測，對影響該反應(yīng)的主要因素進行優(yōu)化。并對該方法進行精密度檢驗，表明酶標(biāo)儀測定GSH含量的可行性高。本實驗還對ARTP誘變獲得的45株突變菌株分別使用可見分光光度計與酶標(biāo)儀進行測定并對測定值擬合，實驗結(jié)果表明2種測定方法具有很好的一致性。酶標(biāo)儀能簡單、高效、精確的測定發(fā)酵液中的GSH含量，為高通量選育GSH酵母菌提供了很好的理論基礎(chǔ)。