祝其麗, 王彥偉, 譚芙蓉, 吳 波, 代立春, 胡國(guó)全, 何明雄

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041； 2.國(guó)家成都農(nóng)業(yè)科技中心, 成都 610041)

能源危機(jī)和環(huán)境污染已成為當(dāng)今世界發(fā)展的兩大難題[1]，而以秸稈為主要原料的生物質(zhì)沼氣發(fā)酵技術(shù)是有效緩解該問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)之一[2]。但由于秸稈等木質(zhì)纖維素原料結(jié)構(gòu)復(fù)雜、致密，難以水解酸化，致使目前秸稈沼氣化利用效率較低[3]，嚴(yán)重制約了秸稈類(lèi)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用進(jìn)程。因此，深入開(kāi)展秸稈沼氣發(fā)酵效率提升技術(shù)研究對(duì)解決秸稈沼氣化利用技術(shù)瓶頸具有重要意義。

研究表明，預(yù)處理技術(shù)可以促進(jìn)木質(zhì)纖維素的水解，從而有利于提高沼氣發(fā)酵效率[4]。如蘆葦經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理后的甲烷產(chǎn)量提高了89%[5]，水稻秸稈經(jīng)真菌處理后的甲烷產(chǎn)量提高了78.3%[6]。目前，應(yīng)用最為廣泛的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法主要分為物理、化學(xué)、生物3類(lèi)[7]。其中，生物預(yù)處理因具有能耗小、成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注[3]。而復(fù)合菌系作為一種有效的生物預(yù)處理方法，能夠充分發(fā)揮不同功能微生物之間的協(xié)同作用，解除代謝產(chǎn)物的反饋抑制，促進(jìn)纖維素轉(zhuǎn)化[8-9]。由于在大多數(shù)情況下，木質(zhì)纖維素原料滅菌不是必需的，這可以幫助降低成本和節(jié)省時(shí)間，因此復(fù)合菌系用于預(yù)處理對(duì)于大規(guī)模生物質(zhì)生產(chǎn)是有利的[3-4,10]。目前研究報(bào)道用于降解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系主要分為兩類(lèi)[11]：一類(lèi)是從特殊環(huán)境中直接獲得的，如瘤胃液、厭氧消化液等。第二類(lèi)是從自然環(huán)境(土壤、污泥等)中篩選分離構(gòu)建的，也是目前研究較多的一類(lèi)復(fù)合菌系，如MC1[4,12-13],WSD-5[14],WSC-6[15],XDC-2[16],MCHCA[17]等，研究表明這些復(fù)合菌系均能不同程度地提升秸稈纖維素生物質(zhì)沼氣發(fā)酵效率。

生物強(qiáng)化，是指通過(guò)向生物系統(tǒng)添加選擇的菌株或混合培養(yǎng)物而用于改善難降解的有機(jī)物分解代謝，近年來(lái)作為旨在提高生物燃料產(chǎn)物產(chǎn)量的替代方法，例如乙醇，氫氣和甲烷[11]。與旨在改善木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)沼氣的生物預(yù)處理方法相比，生物強(qiáng)化技術(shù)具有一定的優(yōu)勢(shì)，包括需要更少的時(shí)間，更低的成本，更少的干物質(zhì)損失和毒性劃界[11, 18]。根據(jù)最近的研究，生物強(qiáng)化技術(shù)被證實(shí)可加速酸化，進(jìn)一步改善木質(zhì)纖維素材料的沼氣發(fā)酵[19-20]。

目前已有研究不同復(fù)合菌系預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)沼氣發(fā)酵效率的影響[7]，以及不同生物強(qiáng)化處理對(duì)沼氣發(fā)酵的影響[19,21]。然而，少有關(guān)于復(fù)合菌系預(yù)處理和生物強(qiáng)化處理對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)沼氣發(fā)酵效果的比較研究。基于此，本文利用人工構(gòu)建的復(fù)合菌系處理玉米秸稈，開(kāi)展復(fù)合菌系預(yù)處理和強(qiáng)化對(duì)其沼氣發(fā)酵效率提升作用的比較研究，旨在為后續(xù)篩選和優(yōu)化高效降解纖維素生物質(zhì)的微生物處理技術(shù)，解決我國(guó)當(dāng)前秸稈沼氣工程面臨的技術(shù)瓶頸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈：取自四川省成都市郊區(qū)農(nóng)田，取回的玉米秸稈在自然條件下風(fēng)干后粉碎至約5 mm備用，其成分組成如表1。

厭氧活性污泥：取自農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室，其理化特性如表1。

好氧復(fù)合菌系A(chǔ)MC：通過(guò)實(shí)驗(yàn)室剛果紅初篩，測(cè)定纖維素酶活及拮抗實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了包括Paenibacilluscucumis1株(分離于竹蟲(chóng)腸道)，Bacillusaltitudinis2株(分離于瘤胃液),Bacillussubtilis3株(分離于土壤),Lysinibacillushalotolerans1株(分離于瘤胃液)等7株菌株的復(fù)合系。

厭氧復(fù)合菌系A(chǔ)NMC：以竹蟲(chóng)腸道為樣本連續(xù)傳代富集培養(yǎng)至21代，梭菌屬(Clostridumsp.)為主要類(lèi)群且群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合系。

表1 玉米秸稈和厭氧活性污泥的特征 (%)

注：N.D.未檢測(cè)。

培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，H2O 1 L，另添加0.5 g·L-1的纖維素類(lèi)物質(zhì)。

1.2 秸稈預(yù)處理

將5 g玉米秸稈加入裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，另加入10 mL好氧復(fù)合菌液(接種量10%)，在30 ℃，160 rpm條件下處理3 d，即為秸稈預(yù)處理液，取樣測(cè)定處理后秸稈中纖維素、半纖維、木質(zhì)素含量，同時(shí)進(jìn)行電鏡掃描分析。

1.3 厭氧發(fā)酵

將秸稈按1∶1(VS)接種厭氧活性污泥進(jìn)行批式發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)采用500 mL發(fā)酵瓶，試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3組：好氧處理組(AMC)：秸稈預(yù)處理液(5 g玉米秸稈+100 mL培養(yǎng)基+10 mL好氧復(fù)合菌液)+235 g厭氧活性污泥；厭氧處理組(ANMC)：5 g玉米秸稈+100 mL培養(yǎng)基+10 mL厭氧復(fù)合菌液+235 g厭氧活性污泥；對(duì)照組(Ctrl)：5 g玉米秸稈+100 mL培養(yǎng)基+10 mL超純水+235 g厭氧活性污泥；同時(shí)設(shè)置空白組。厭氧發(fā)酵溫度為中溫35 ℃±2 ℃，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 分析方法

1.4.1 常規(guī)理化指標(biāo)分析

物料TS和VS的測(cè)定參照美國(guó)水和廢水監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法[22]；纖維素、半纖維、木質(zhì)素含量的測(cè)定采用美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)標(biāo)準(zhǔn)分析方法[23]；總C和總N含量的測(cè)定采用有機(jī)元素分析儀(EAI CE440)進(jìn)行分析。

厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量采用排水集氣法測(cè)定；甲烷含量采用氣相色譜儀(GC122)分析，色譜柱為碳分子篩TDX-01，長(zhǎng)度2 m，內(nèi)徑2 mm，采用200 μL 定量環(huán)進(jìn)樣，檢測(cè)器為T(mén)CD，色譜條件如下：柱箱溫度120 ℃，進(jìn)樣器溫度120 ℃，檢測(cè)器溫度150 ℃，載氣為H2。

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的測(cè)定：采用氣相色譜儀(GC102)分析，色譜柱為長(zhǎng)度1.5 m，內(nèi)徑2 mm的GDX-104填充柱，采用FID檢測(cè)器，色譜條件如下：柱箱溫度160 ℃，進(jìn)樣器溫度210 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃，載氣為N2，進(jìn)樣量為1 μL，H2流量30 mL·min-1，空氣流量為300 mL·min-1。

1.4.2 酶活分析

單株菌株和復(fù)合菌系分別在改良赫奇遜無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基HM(KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，CMC-Na 5 g，H2O 1 L)30 ℃培養(yǎng)3 d后，8000 rpm離心10 min，上清液作為粗酶液，纖維素酶活性的測(cè)定采用DNS法[24-25]。本文分別對(duì)羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶和濾紙酶的活性進(jìn)行比較測(cè)定。濾紙酶活性的測(cè)定用 Whatman1號(hào)濾紙(1 cmx6 cm)條為底物，羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定用1% 羧甲基纖維素鈉為底物，纖維二糖酶活力的測(cè)定用2%水楊素為底物。各底物分別采用pH 值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖(0.2 mol·L-1)。取稀釋酶液0.5 mL與1 mL上述底物及濾紙條充分混勻，在50 ℃水浴中溫育30 min，40 min，60 min后，加入DNS 顯色劑2 mL，沸水浴顯色10 min，流水冷卻，在540 nm下測(cè)定OD值，每測(cè)定重復(fù)3次，取平均值，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。以試驗(yàn)條件下酶液蛋白含量在單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖(葡萄糖)量計(jì)算酶活性[25]。

1.4.3 掃描電子顯微鏡觀察

取少量預(yù)處理前后的秸稈樣品，制樣，用日本HITACHI TM-1000型掃描電子顯微鏡進(jìn)行掃描，放大500倍觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米秸稈預(yù)處理前后木質(zhì)纖維素含量變化

纖維素降解率是表征秸稈生物質(zhì)經(jīng)預(yù)處理后生物降解特性的指標(biāo)之一。表2所示為預(yù)處理前后玉米秸稈的木質(zhì)纖維素含量及降解率。玉米秸稈經(jīng)好氧復(fù)合菌液預(yù)處理3 d后纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量為0.25，0.23，0.14 g·g-1，相比對(duì)照分別下降了16.7%，17.9%，12.5%，說(shuō)明本試驗(yàn)構(gòu)建的好氧復(fù)合菌系A(chǔ)MC具有一定的纖維素降解性能。其中，半纖維的降解率大于纖維素，這是因?yàn)榘肜w維素主要的組成物質(zhì)為易降解的糖類(lèi)物質(zhì)，包括木聚糖，葡糖醛酸氧基，阿拉伯木聚糖，葡甘露聚糖和木葡聚糖，與纖維素相比，其結(jié)構(gòu)和組成的可變性增加，預(yù)處理過(guò)程中具有相對(duì)較高的降解速率[26]。因此，與纖維素相比，半纖維素顯示出相對(duì)容易水解，產(chǎn)生的單糖和乙酸能夠進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)沼氣和其他有用的副產(chǎn)物[27]。而纖維素是由通過(guò)β-1-4糖苷鍵連接的葡萄糖單元組成的聚合物[28]，并且被木質(zhì)素包裹，使其更難水解。木質(zhì)素是一種復(fù)合的多苯基芳族化合物，通過(guò)酯鍵連接，它緊密結(jié)合纖維素和半纖維素，形成植物的一級(jí)和二級(jí)細(xì)胞壁[27]。此外，木質(zhì)素對(duì)降解具有抗性，并且是有效利用纖維素和半纖維素的障礙[29]。 因此，復(fù)合菌系預(yù)處理的目的是破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，這有助于改善水解過(guò)程，進(jìn)一步促進(jìn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的沼氣發(fā)酵效率。

表2 復(fù)合菌系A(chǔ)MC預(yù)處理秸稈前后木質(zhì)纖維素含量變化

2.2 酶活分析

纖維素分解是在多種纖維素酶的協(xié)同作用下完成的，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[30]。因此，本試驗(yàn)選取了3種常用的酶，對(duì)其活性進(jìn)行分析，包括濾紙酶、羧甲基纖維素酶和纖維二糖酶[31]。其中，最能反映纖維素分解能力的指標(biāo)是濾紙酶活[30]。分析結(jié)果如表3所示，本研究所構(gòu)建的好氧復(fù)合菌系的濾紙酶活、羧甲基纖維素酶活、纖維二糖酶活分別為0.33 U·mL-1，1.69 U·mL-1，0.013 U·mL-1，均高于單菌酶活的上限值。這一結(jié)果與復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)纖維素的分解能力遠(yuǎn)高于單一菌株的研究結(jié)論是一致的[32]。

表3 單菌與人工構(gòu)建復(fù)合菌系A(chǔ)MC的酶活 (U·mL-1)

項(xiàng)目單菌酶活復(fù)合菌系酶活濾紙酶 0.05～0.170.33羧甲基纖維素酶0.3～0.81.69纖維二糖酶 0～0.010.013

2.3 電鏡掃描分析

利用好氧復(fù)合菌系A(chǔ)MC預(yù)處理玉米秸稈前后的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)變化如圖1和圖2所示。未經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈表面結(jié)構(gòu)緊密規(guī)整(見(jiàn)圖1 )，而經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的玉米秸稈結(jié)構(gòu)明顯被破壞(見(jiàn)圖2)，表面出現(xiàn)很多碎片，結(jié)構(gòu)更為松散，孔隙增多，表面附著的菌落清晰可見(jiàn)。電鏡分析結(jié)果說(shuō)明本研究構(gòu)建的好氧復(fù)合菌系分泌的各種纖維素酶發(fā)揮了協(xié)同作用，破壞了木質(zhì)素對(duì)纖維素和半纖維的包裹作用，對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行了有效降解，有利于后續(xù)的水解和發(fā)酵[9]。

圖1 復(fù)合菌系A(chǔ)MC預(yù)處理前玉米秸稈掃描電鏡圖像(× 500倍)

圖2 復(fù)合菌系A(chǔ)MC預(yù)處理后玉米秸稈掃描電鏡圖像(× 500倍)

2.4 秸稈沼氣發(fā)酵效率分析

經(jīng)復(fù)合菌系處理和未經(jīng)處理的玉米秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中日產(chǎn)沼氣量對(duì)比分析結(jié)果如圖3所示。三組試驗(yàn)在發(fā)酵第1天均開(kāi)始產(chǎn)氣，其中復(fù)合菌系預(yù)處理組(AMC)與對(duì)照組(Ctrl)變化趨勢(shì)相似，發(fā)酵初期日產(chǎn)氣量幾乎呈線性上升，在發(fā)酵第4天就達(dá)到產(chǎn)氣高峰，之后又逐漸下降，波動(dòng)幅度較大；復(fù)合菌系強(qiáng)化處理組(ANMC)日產(chǎn)氣量變化則異于其他兩組，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中波動(dòng)幅度較小，且維持在一個(gè)相對(duì)較高水平，但產(chǎn)氣的最高峰值卻低于其他兩組。相應(yīng)的甲烷含量變化如圖4所示。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，AMC和Ctrl的甲烷含量變化趨勢(shì)仍相似，從發(fā)酵初期逐漸上升至第4天達(dá)到50%以上，之后趨于穩(wěn)定；而ANMC的甲烷含量在發(fā)酵初期明顯低于AMC和Ctrl，之后逐漸上升，最高可達(dá)61.4%，超過(guò)AMC和Ctrl的最高值，之后略有下降，最終穩(wěn)定于54%左右。日產(chǎn)沼氣量和甲烷含量的結(jié)果表明，本研究人工馴化的厭氧復(fù)合菌系A(chǔ)NMC強(qiáng)化處理有利于緩解產(chǎn)氣波動(dòng)，提高甲烷含量；而好氧復(fù)合菌液處理效果則不明顯。

生物甲烷產(chǎn)量是評(píng)價(jià)生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化率與沼氣發(fā)酵效率的關(guān)鍵指標(biāo)[24]。三組試驗(yàn)的累積甲烷產(chǎn)量結(jié)果如圖5所示。總體上，兩組復(fù)合菌系處理均能提高玉米秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中累積甲烷產(chǎn)量。在經(jīng)歷40 d的厭氧發(fā)酵后，復(fù)合菌系強(qiáng)化處理組ANMC和復(fù)合菌系預(yù)處理組AMC的累積甲烷產(chǎn)量分別為242.56 mL·g-1Vs和233.09 mL·g-1Vs，相比對(duì)照依次提高了11.23%和6.89%，前者優(yōu)于后者。究其原因，可能是由于AMC在對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理的過(guò)程中雖然能有效促進(jìn)木質(zhì)纖維素的降解，將其轉(zhuǎn)化為可降解糖類(lèi)物質(zhì)，但自身也會(huì)消耗一部分糖維持其生長(zhǎng)需要，導(dǎo)致用于后續(xù)厭氧發(fā)酵的糖類(lèi)物質(zhì)減少，進(jìn)而抵消了其對(duì)產(chǎn)氣效率的提升作用。而ANMC是以梭菌屬(Clostridumsp.)為主要類(lèi)群，這些梭菌可以促進(jìn)水解，有利于纖維素的降解，提高產(chǎn)氣效率[33]。

圖3 玉米秸稈厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量變化

圖4 玉米秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中甲烷含量變化

圖5 厭氧發(fā)酵過(guò)程中累積甲烷產(chǎn)量變化

圖6 厭氧發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)酸含量變化

VFA 濃度是評(píng)價(jià)水解酸化和產(chǎn)甲烷平衡的重要指標(biāo)[34]。3組試驗(yàn)的總揮發(fā)酸(乙酸、丙酸、丁酸的總和)含量的變化如圖6所示，在發(fā)酵前16 d，ANMC的揮發(fā)酸含量顯著高于AMC和Ctrl，第6 天達(dá)到峰值2169.4 mg·L-1，這是因?yàn)閰捬鯊?fù)合菌系中的梭菌在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生短鏈揮發(fā)性物質(zhì)(如乙酸、丁酸等)。研究表明，TVFA 濃度小于4125 mg·L-1時(shí)對(duì)厭氧發(fā)酵的影響較小[35]。而乙酸、丁酸等短鏈揮發(fā)酸的產(chǎn)生對(duì)后續(xù)產(chǎn)甲烷過(guò)程是有益的，這也正是ANMC雖然揮發(fā)酸含量比其他兩組高，但產(chǎn)氣效率卻沒(méi)有受到抑制的原因。

綜合上述產(chǎn)氣效率指標(biāo)分析結(jié)果，雖然本研究所構(gòu)建的好氧和厭氧復(fù)合菌系均對(duì)玉米秸稈沼氣發(fā)酵效率具有提升作用，但效果相比已有的相關(guān)研究報(bào)道[13,37]尚不理想。例如，袁旭峰等采用復(fù)合菌系MC1處理玉米秸稈4 d后，可以獲得最大的秸稈總沼氣產(chǎn)量和總甲烷產(chǎn)量，相比對(duì)照分別提高了33.0%和58.1%[13]。Zhong等利用構(gòu)建的復(fù)合菌系處理玉米秸稈15 d，其總沼氣產(chǎn)量、甲烷產(chǎn)量分別提升了33.1%、75.6%[37]。根據(jù)Zhang等人的研究，發(fā)現(xiàn)使用醋酸桿菌的生物強(qiáng)化可以提高纖維素和半纖維素的去除率，并在整個(gè)玉米秸稈的厭氧消化過(guò)程中將甲烷產(chǎn)量提高19%～23%[38]。然而，無(wú)論是否使用預(yù)處理或生物強(qiáng)化，本研究中的總沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量?jī)H增加了13.02%和11.23%。一方面可能是由于本研究中復(fù)合菌系預(yù)處理秸稈的時(shí)間較短，僅3 d，低于大多數(shù)的研究報(bào)道[4,13,37]，纖維素未能得到高效降解；另一方面發(fā)酵初期未對(duì)發(fā)酵原料的各項(xiàng)參數(shù)(如pH值、碳氮比等)進(jìn)行優(yōu)化，不利于厭氧發(fā)酵的高效運(yùn)行；同時(shí)也反映出此次構(gòu)建的復(fù)合菌系對(duì)秸稈沼氣發(fā)酵效率提升效果有限，尚需進(jìn)一步優(yōu)化。但本文所得有關(guān)厭氧復(fù)合菌系提升秸稈沼氣發(fā)酵效率的結(jié)果及其與生物強(qiáng)化處理提升效果的比較分析將為下一步深入開(kāi)展提升秸稈沼氣發(fā)酵的微生物學(xué)機(jī)理研究提供理論參考。

3 結(jié)論

(1)人工構(gòu)建的好氧復(fù)合菌系A(chǔ)MC的纖維素酶活高于單菌；經(jīng)AMC預(yù)處理后的玉米秸稈表面結(jié)構(gòu)更為粗糙疏松，其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率分別為17.86%，18.75%，16.67%。

(2)采用復(fù)合菌系A(chǔ)MC預(yù)處理和復(fù)合菌系A(chǔ)NMC強(qiáng)化均對(duì)玉米秸稈沼氣發(fā)酵效率具有提升作用，其累積甲烷產(chǎn)量相比對(duì)照分別提高了6.89%和11.23%；其中，ANMC對(duì)秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中甲烷含量具有明顯的提升作用。