李泓文，聶大林

（蘇州賽譜儀器有限公司，江蘇 蘇州 215200）

0 引言

本次分析的對象是由北京衛(wèi)星制造廠在科技部重大專項《高精度超高壓液相泵的開發(fā)與應用》（項目編號：2016YFF0101000）項目中研制的高精度超高壓液相泵（UHPLC-BSC-01型），使用該在研液相泵替代SCG蛋白純化系統(tǒng)中的輸液系統(tǒng)與原系統(tǒng)進行梯度性能對比測試并分析結果。

1 系統(tǒng)介紹

SCG蛋白純化儀是由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、收集系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成的分析、制備儀器。輸液系統(tǒng)由泵、混合器、壓力傳感器組件等組成，是SCG蛋白純化儀的重要組成部分。輸液系統(tǒng)根據(jù)實際需求對儀器提供精準的等度和梯度液相輸入。圖1是SCG蛋白純化儀及輸液系統(tǒng)組成方框圖。

賽譜儀器的SCG蛋白純化系統(tǒng)是液相色譜儀器（LC）中的一種，基本原理和HPLC類似，但需要配置pH及電導率檢測器，而且用途完全不同，所以系統(tǒng)與流動相接觸的部分完全采用生物惰性材料。系統(tǒng)在低壓運行時，有較低的脈動，從而避免損壞層析柱。該系統(tǒng)支持獨立的樣品泵，最多支持10個通道的樣品選擇，11個通道的流動相的選擇，5根層析柱的自動選擇，以及10個通道的大體積收集和組份收集器收集。SCG軟件既能完全手動操作儀器進行蛋白純化工作，又能支持方法編輯及運行，運行客戶根據(jù)樣品信息編輯的一個或多個方法，對儀器的整個工作流程進行全自動運行，系統(tǒng)能自動完成方法的運行并生成結果報告，實現(xiàn)蛋白的全自動純化工作。

2 梯度洗脫

圖1 SCG蛋白純化儀及輸液系統(tǒng)組成方框圖Fig.1 The SCG protein purification instrument and the composition block diagram of the infusion system

進行高效液相色譜分析時，常采用兩種洗脫方式，一種為等度洗脫（isocratic elution），另一種為梯度洗脫（gradient elution）[1]。

用等度洗脫進行色譜分離，由不同溶劑構成的流動相所組成，如流動相的極性，離子強度，pH等，在分離的全過程中皆保持不變。用梯度洗脫進行色譜分離時，在洗脫過程中含兩種或兩種以上不同極性溶劑的流動相組成，會連續(xù)或間歇地改變，期間可調節(jié)流動相的極性，改善樣品中各組份間的分離度。梯度洗脫一般是指流動相組成，隨分析時間的延長呈線性變化，即線性梯度洗脫[1]。

梯度系統(tǒng)可分為低壓梯度系統(tǒng)和高壓梯度系統(tǒng)。

低壓梯度系統(tǒng)通過控制比例閥的開閉時間，而高壓梯度系統(tǒng)通過控制泵的流量實現(xiàn)梯度洗脫[3]。

本文測試均為高壓梯度系統(tǒng)。

1）測試依據(jù)：JJG 705-2014液相色譜儀檢定規(guī)程。

2）環(huán)境條件：環(huán)境溫度18℃～30℃，環(huán)境濕度≤75%。

3）流動相：A泵流動相為純水，B泵流動相為0.4%丙酮。

3 梯度準確度和精密度測試

3.1 操作步驟

◆ 按圖1流程連接高精度超高壓液相泵、UV檢測器、SCG工作站及管路后通電。

◆ 打開SCG工作站。

◆ A泵流動相為純水，B泵流動相為0.4%丙酮溶液。

◆ 將出液口連接至UV檢測器檢測池。

◆ 分別運行A、B泵，待出液口有液體流出且管路內無氣泡時停止運行。

圖2 梯度方法曲線示意圖Fig.2 Schematic diagram of gradient method curve

◆ 用A泵流動相沖洗管路并預熱檢測器，待基線平穩(wěn)后進行梯度曲線測試。

◆ 將UV檢測器波長設置為254nm，流速為1mL/min，運行方法得到梯度曲線，重復5次。方法曲線示意圖如圖2所示。

◆ 測量V1-V7的UV吸光度值并記錄，根據(jù)式（1）、式（2）和式（3）可計算出梯度準確度Gs。

◆ 測量V1-V7的UV吸光度值并記錄，根據(jù)式（2）和式（4）可計算出梯度精度RSD。

◆ 記錄梯度方法的紫外吸收曲線圖譜。

◆ 使用賽譜儀器進口泵SCG030進行對比測試。

每次梯度測試完成，先計算對應的實際值，公式如下:

表1 梯度精度測試結果的對比表Table 1 Comparison table of gradient accuracy test results

式（1）中：

Li——某一梯度每次測量的實際值（%）。

Vi——某一梯度每次測量的UV吸光度值（mAu）。

VA——A流動相100%時，UV吸光度值（mAu）。

VB——B流動相100%時，UV吸光度值（mAu）。

接著，計算對應的梯度誤差，公式如下：

式（2）中：

Ls——某一梯度設定值（%）。

Ti——某一梯度每次測量的偏差值（%）。

然后，計算n次梯度測試的梯度準確度，計算公式如下：

式（3）中：

Gs——某一梯度5次測量偏差值的算術平均值（%）。

最后，計算n次梯度測試的梯度精度RSD，計算公式如下：

3.2 測試結果

按照上述步驟對高精度超高壓液相泵和賽譜儀器進口泵進行對比測試，結果數(shù)據(jù)如表1所示。

4 梯度滯后體積測試

梯度滯后體積是指從溶劑配比完成點到色譜柱頭的系統(tǒng)體積，也可稱為延緩體積，相當于在梯度運行之前運行一段等度條件[2]。

實際觀測到的梯度洗脫則是向后平移了一段時間，稱為梯度系統(tǒng)的滯后時間，如圖4(a)所示。在梯度洗脫開始與結束處的輪廓線理論上應為直線，但實際上由于梯度系統(tǒng)中的滯后體積導致系統(tǒng)內擴散，直線則變成了圓滑的線，這就使梯度洗脫的線性變差如圖4(b)所示[1]。

圖3 高壓梯度系統(tǒng)中的滯后體積Fig.3 Hysteresis volume in a high pressure gradient system

圖4 線性梯度輪廓Fig.4 Linear gradient profile

傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)滯后體積一般在0.5mL～5mL范圍內，通常采用4.6mm內徑，150mm或更長的色譜柱，分析時間10min～20min之間或更長時間，滯后體積影響并不顯著。但是隨柱長變短，內徑變細，較大的滯后體積可能會引起保留時間明顯增加，色譜分離情況發(fā)生變化。因此，應選滯后體積小的液相色譜儀，以適應梯度試驗。高壓梯度系統(tǒng)中滯后體積如圖3所示[2]。

4.1 操作步驟

◆ 按圖1的流程連接進高精度超高壓液相泵、UV檢測器、SCG工作站及管路后通電。

◆ 打開SCG工作站。

◆ A泵流動相為純水，B泵流動相為0.4%丙酮溶液。

◆ 將出液口連接至UV檢測器檢測池。

◆ 分別運行A、B泵，待出液口有液體流出且管路內無氣泡時，停止運行。

◆ 用A泵流動相沖洗管路并預熱檢測器，待基線平穩(wěn)后進行梯度曲線測試。

◆ 將UV檢測器波長設置為254nm，流速為1mL/min，運行方法得到梯度曲線，重復5次。方法曲線示意圖如圖2所示。

圖5 梯度滯后時間參考值測量方法圖Fig.5 Gradient lag time reference value measurement method diagram

◆ 確保每個梯度比例運行至紫外吸收曲線平穩(wěn)后，通過SCG軟件測量V3-V4的UV吸光度開始變化至V4基線平穩(wěn)所需的時間，如圖5所示。V4-V5，V5-V6，V6-V7用相同方法測得，并計算其平均值作為梯度滯后時間對比的參考值，并記錄測試結果。

◆ 使用賽譜儀器進口泵SCG030進行對比測試。

4.2 測試結果

見表2。

表2 梯度精度測試結果的對比表Table2 Comparison table of gradient accuracy test results

5 結論

通過將國產高精度超高壓液相泵與賽譜儀器紫外檢測器組成的液相色譜系統(tǒng)進行梯度性能測試，并且與賽譜儀器原有的由進口液相泵組成的蛋白純化系統(tǒng)進行對比，從試驗結果可以得出：該國產高精度超高壓液相泵在梯度準確度和梯度精密度兩項指標上的表現(xiàn)均略優(yōu)于賽譜儀器有限公司使用的進口液相泵SCG030；而從梯度的滯后時間（梯度滯后體積）參考值的測試結果表可得出：該國產高精度超高壓液相泵的梯度滯后表現(xiàn)明顯優(yōu)于賽譜儀器使用的進口液相泵SCG030，其具有更好的梯度洗脫線性，且更適合用于細內徑色譜柱的應用。