錢成煒，戴永錚，蔣 勇

Kv3.4是位于細胞膜上的電壓門控鉀通道，屬于Shaker型鉀通道蛋白。以前的研究[1-2]表明，Kv3.4在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteins，MMPs)的主要功能是降解細胞外基質，維持細胞外基質的動態(tài)平衡?；|金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)可以水解腫瘤細胞外基質并調節(jié)細胞黏附，這與腫瘤侵襲密切相關[3]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的蛋白之一，是凋亡的主要執(zhí)行者。它的激活表明細胞凋亡已進入不可逆轉的階段[4]。盡管研究[5]表明Kv3.4在口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)中高表達，但其與OSCC發(fā)展和特定分子機制的關聯仍有待進一步研究?；诖耍狙芯考僭OKv3.4與腫瘤的侵襲、增殖和凋亡密切相關，并推測Kv3.4通過調節(jié)細胞周期，干擾MMP-9表達和激活Caspase-3來實現上述功能。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑血清購自以色列Biological Industries公司；青霉素-抗生素、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA試劑盒、cyclin D1一抗、cyclin E1一抗、caspase-3一抗、細胞周期試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；DMEM購自美國Hyclone公司；共聚焦培養(yǎng)皿、Transwell小室購自美國Corning公司；siRNA-KCNC4、siRNA-NC購自上海吉瑪公司；lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜、超敏顯影液購自德國Millipore公司；Kv3.4一抗購自英國Abcam公司；MMP-9一抗購自武漢賽維爾生物科技有限公司；β-actin一抗、二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNA試劑盒購自日本Takara公司；PCR引物購自上海生物工程股份有限公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；細胞凋亡試劑盒購自上海貝博公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) OSCC細胞株SCC3來自安徽省口腔重點實驗室。取對數生長期的細胞置于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液，待細胞達到80%匯合度時傳代培養(yǎng)。

1.2.2SCC3細胞的免疫細胞化學和熒光成像 在共聚焦培養(yǎng)皿中接種2×105個細胞，培養(yǎng)24 h，使用PBS洗滌3次后，使用4%冷多聚甲醛固定30 min，加入1 ml 0.5% TritonX-100，置于搖床上輕搖10 min，用1% BSA封閉30 min。一抗孵育過夜，二抗避光孵育2 h，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染料(DAPI)，5 min后使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3si-RNA轉染 NCBI上查找KCNC4序列，設計合成3條具有KCNC4的干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，陰性對照siRNA(siRNA-NC)(引物序列見表1)，轉染前18 h，將2×105個細胞接種在不含抗生素培養(yǎng)液的6孔板中，在轉染時，將培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基。取5 μl/孔siRNA，使用245 μl的DMEM稀釋，室溫靜置5 min，取10 μl的lipofectamine 2000，使用240 μl的DMEM稀釋，室溫靜置5 min，將兩者混勻，靜置20 min，然后加入細胞培養(yǎng)皿中。6 h后，將培養(yǎng)基更換為含10%血清的DMEM，細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將正常培養(yǎng)的SCC3細胞命名為control組，將添加等量的lipofectamine 2000，消除轉染試劑的干擾的SCC3細胞命名為mock組，將轉染陰性對照試劑的SCC3細胞命名為Si-NC組，將轉染3組siRNA-KCNC4分別命名為s1、s2、s3組。

1.2.4逆轉錄定量實時PCR 轉染后48 h，使用TRIzol試劑從SCC3細胞中分離總RNA。根據制造商指南，使用RNA試劑盒合成cDNA。正向引物序列：5′-AGTTCCTGCTGCTTATCATCTTCC-3′，反向引物序列：5′-TCTTGAAGTCGGTGTGGTCATTAC-3′。將2 μl cDNA、10 μl SYBR和1.6 μl特異性引物混合以構建RT-qPCR反應系統(tǒng)，并添加ROX以校正孔間誤差。反應條件為：95 ℃、2 min，95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，75 ℃、30 s，重復35個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法比較分析基因表達。

1.2.5蛋白質印跡 轉染后72 h，使用含有PMSF、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解物裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心后提取蛋白質，使用BCA試劑盒測量蛋白質濃度，通過8% SDS-PAGE(MMP-9，Kv3.4)、10% SDS-PAGE(capase-3，cyclin D1，cyclin E1)分離已定量的蛋白質，并轉移至PVDF膜上。使用含有5% BSA的TBS-Tween 20封閉2 h，一抗孵育過夜，將經過一抗孵育的PVDF膜與二抗孵育1 h，隨后使用ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測蛋白。

1.2.6CCK-8增殖實驗 轉染24 h后，用胰蛋白酶消化細胞，將1×104個細胞接種到96孔板中，待細胞貼壁后，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8并孵育1 h，酶標儀測量450 nm波長下的OD值，每個樣本做5個復孔實驗，根據OD值繪制0、24、48、72 h增殖曲線。

1.2.7細胞凋亡實驗 轉染48 h后，使用胰蛋白酶消化，收集5×106個細胞，并用PBS洗滌3次。細胞使用Annexin V-FITC染色20 min后，再使用PI染色5 min，使用流式細胞儀進行檢測和分析。Annexin V-FITC染色的細胞為早期凋亡細胞，PI染色的細胞為晚期凋亡細胞。

1.2.8基質膠侵襲測定 轉染24 h后，用胰酶消化細胞，收集計數后用無血清培養(yǎng)基重懸，密度為4×104，接種于transwell上室，上室內預先鋪設50 μl、1.25 mg/ml基質膠。用含有10% FBS的DMEM 600 μl填充transwell下室。將24孔板在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。擦拭未侵入的細胞，將小室置于多聚甲醛中固定20 min。使用雙蒸水洗滌后，細胞用1%結晶紫染色15 min。放大200倍拍攝照片，使用Image J軟件計數細胞。

1.2.9細胞周期實驗 轉染48 h后，將細胞用胰蛋白酶消化并用PBS均勻吹散，加入1 ml預冷的70%乙醇放入細胞中，4 ℃靜置24 h，1 500 r/min離心5 min后收集細胞，細胞用PI在37 ℃下染色30 min，通過流式細胞術檢測細胞周期，使用CytExpert軟件進行最終結果分析。

表1 引物列表

2 結果

2.1 免疫細胞化學激光共聚焦鏡下可見，SCC3細胞核為藍色，Kv3.4被熒光標記為紅色，可見Kv3.4廣泛存在于細胞質和細胞膜上，見圖1。

2.2 siRNA轉染效果評估qRT-PCR和Western blot實驗證實siRNA降低了Kv3.4的表達水平。qRT-PCR結果表明，轉染3條siRNA后，與control組相比，s1、s2、s3組KCNC4 mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=39.1，P<0.001)。而mock組、si-NC組與control組相比，差異無統(tǒng)計學意義。其中，s3具有最高的沉默效率，見圖2。隨后的實驗選用該siRNA進行。

圖1 Kv3.4在SCC3細胞中的定位 ×200 A：DAPI將細胞核染為藍色；B：Kv3.4蛋白染為紅色；C：二者合成圖像

圖2 siRNA降低SCC3細胞中KCNC4組 的mRNA和蛋白質表達水平

A：qRT-PCR檢測KCNC4 mRNA表達水平；與control組比較：***P<0.001；B：Western blot檢測證明Kv3.4表達水平

2.3 KCNC4沉默對SCC3細胞增殖的影響CCK-8檢測結果顯示，隨時間變化，各組吸光度存在差異。在48 h，與control組(1.05±0.07)和mock組(0.96±0.1)相比，si-KCNC4組(0.67±0.06)吸光度下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=32.27，P<0.001)。在72 h，與control組(1.49±0.1)和mock組(1.34±0.1)相比，si-KCNC4組(0.81±0.09)吸光度下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=59.46，P<0.001)，見圖3。

2.4 KCNC4沉默對SCC3細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與control組和mock組相比，si-KCNC4組凋亡細胞百分比增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=467.4，P<0.001)，見圖4。

2.5 KCNC4沉默對SCC3細胞侵襲的影響使用Matrigel基質膠侵襲測定來確定細胞的侵襲能力。與control組相比，si-KCNC4組侵襲細胞數明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(F=33，P<0.001)。且si-KCNC4組與mock組相比，侵襲細胞數也下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。control組與mock組之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖3 沉默KCNC4基因后SCC3細胞的增殖能力下降情況

與control組比較：***P<0.001；與mock組比較：###P<0.001

2.6 KCNC4沉默對SCC3細胞周期的影響G0/G1期：與control組和mock組相比，si-KCNC4組的細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=58.36，P<0.001)。S期：與control組和mock組相比，si-KCNC4組細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(F=41.09，P<0.001)。G2/M期：與control組和mock組相比，si-KCNC4組細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(F=26.91，P<0.001)。由各細胞百分比變化可知，si-KCNC4組細胞周期在G0/G1期增高，在S期和G2/M期降低，見圖6。

2.7 KCNC4沉默對侵襲和凋亡相關蛋白的影響與control組和mock組相比，si-KCNC4組中Caspase-3的表達水平增加。這從分子層面證明了細胞凋亡的發(fā)生。同時，實驗結果表明cyclin D1、cyclin E1和MMP-9的表達水平降低，見圖7，這可能揭示Kv3.4調節(jié)OSCC增殖和侵襲的機制。

圖4 沉默KCNC4基因后SCC3細胞的凋亡能力增加

A：control組；B：mock組；C: si-KCNC4組；D：各組細胞凋亡率比較；與control組比較：***P<0.001；與mock組比較：###P<0.001

圖5 沉默KCNC4基因后SCC3細胞侵襲性比較×200

A：control組；B：mock組；C：si-KCNC4組；與control比較：***P<0.001；與mock組比較：##P<0.01

3 討論

電壓門控鉀通道是跨膜蛋白，是細胞膜中最豐富和分布最廣的蛋白質。學者們認為鉀通道與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。目前，推測電壓門控鉀通道可能通過調節(jié)細胞周期、調節(jié)基質金屬酶和改變細胞體積[7]來影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究[8]表明，鉀離子通道對細胞膜的活性在細胞有絲分裂周期的G1期起著關鍵作用。有學者發(fā)現在少突神經膠質瘤細胞中，鉀通道的開放導致延遲外向鉀電流過度表達，并參與細胞增殖的調節(jié)，影響細胞周期中的G1/S期轉變[8]。體內和體外研究[1-2]發(fā)現，靶向鉀通道的藥物可以減弱某些腫瘤的生長，促進腫瘤細胞的凋亡，為癌癥藥物研究開辟了一條新途徑。

Kv3.4屬于Kv1-9亞家族，由KCNC4基因編碼。OSCC中Kv3.4 mRNA表達增加[5]，Kv3.4特異性抑制劑BDS特異性阻斷Kv3.4通道可抑制OSCC的增殖。這些研究表明，Kv3.4與OSCC密切相關。

圖6 沉默KCNC4基因后SCC3細胞周期被阻滯在G1期

A：control組；B：mock組；C：si-KCNC4組；與control比較：***P<0.001；與mock組比較：###P<0.001

圖7 沉默KCNC4后侵襲和凋亡相關蛋白表達水平的變化

A：cyclin D1和cyclin E1蛋白表達水平下降；B：MMP-9蛋白表達水平降低；C：caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表達水平增加

轉移是癌癥患者死亡的原因之一，細胞侵襲能力是癌癥轉移的關鍵。MMPs誘導細胞外基質降解，促進新生血管形成是細胞侵襲的重要過程。其中，MMP-9與腫瘤晚期侵襲和轉移增加密切相關。本研究表明，沉默KCNC4可降低SCC3細胞系的侵襲能力。同時，Western blot結果顯示沉默KCNC4和MMP-9表達降低?；诖?，推測Kv3.4可能通過MMP-9調節(jié)SCC3細胞系的侵襲能力。值得注意的是，MMP-9與缺氧的關聯已得到證實[9]。而Kv3.4是一種氧敏感通道亞基，這可能揭示Kv3.4調節(jié)MMP-9的具體機制。

細胞增殖調控機制失控是腫瘤發(fā)展的重要原因[10]。細胞周期紊亂導致細胞增殖異常。大量研究[11]表明，胞膜上鉀離子通道的活性在細胞周期的G1期起著關鍵作用。本研究顯示，敲低KCNC4可以降低cyclin D1和cyclin E1表達，阻斷G1期。Cyclin D1和cyclin E1表達的峰值出現在G1的中后期，驅使細胞從G1期進入S期。細胞內和細胞外信號整合在G1-S期，此期決定了細胞增殖、分化、死亡或退出細胞周期進入G0期。一些學者認為cyclin D1和cyclin E1的過度表達將縮短細胞G1期，加快細胞分裂速度，最終導致DNA復制異常，促進細胞惡性轉化[12-13]。cyclin D1和cyclin E1的表達將導致視網膜母細胞瘤蛋白磷酸化，從而導致細胞不受控制的增殖[14]。結合以往的研究和本研究實驗結果，推測沉默KCNC4可導致cyclin D1、cyclin E1的降解，細胞周期G0/G1被阻滯，從而抑制腫瘤細胞系增殖。近年來，已有研究[7]顯示，鉀離子通道的異常表達，導致細胞周期蛋白表達水平改變，引起細胞周期異常。鉀通道阻滯劑可以抑制CyclinE/cdk2的活性，外向鉀電流維持cdk2的活性，并調節(jié)G1/S期的轉變[15]。研究[8]表明，鉀通道阻滯劑僅阻斷G1/S期轉變，而G0期鉀通道蛋白合成不依賴于RNA合成。

細胞凋亡是一個復雜的生理過程，其特征是細胞體積減小和細胞內鉀離子濃度降低。Caspase-3是細胞凋亡的最關鍵蛋白之一，并且位于Caspase級聯的最下游。隨著Kv3.4表達水平的降低，Caspase-3和cleaved-Caspase-3表達增加，細胞凋亡增加。這進一步證實了敲低KCNC4對細胞凋亡的作用。

本研究首先確認了Kv3.4在OSCC細胞系SCC3中的位置，然后使用RNA干擾技術沉默SCC3中的KCNC4基因，干擾Kv3.4的表達，觀察其對SCC3細胞增殖、凋亡、侵襲能力的影響并初步探討了相關的分子機制。本研究驗證了Kv3.4與OSCC的關聯，并初步證明Kv3.4對OSCC的影響可能通過調控細胞周期，調控MMP-9和Caspase-3的表達水平來實現。這表明Kv3.4可能是OSCC的潛在靶點，為OSCC的治療提供了新的策略。