張陽陽，王紅美，戚孟春，董 偉，簡永義，孫 紅

透鈣磷石(CaHPO4·2H2O，brushite)是羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的前體物質(zhì)，具有良好的生物相容性以及促成骨作用。作為一種微量元素，鍶(Sr)與鈣(Ca)相似，并對成骨及破骨可以雙向調(diào)控[1]，并可促進骨保護素(osteoprotegerin，OPG)mRNA高度表達，是骨改建系統(tǒng)中重要抑制骨吸收的細胞因子[2-3]。氟元素為人機體內(nèi)必需微量元素之一，經(jīng)體外實驗驗證低劑量的氟對成骨細胞的增殖和分化能力都具有促進作用[4]。閆玉婷 等[5]嘗試制備10%鍶透鈣磷石，無明顯毒性，對骨缺損修復(fù)效果顯著優(yōu)于透鈣磷石組。經(jīng)課題組前期實驗探索，將單一氟化鈉按0.5wt%、1.0wt%、1.5wt%摻至透鈣磷石骨水泥后經(jīng)檢測均可促進小鼠前成骨細胞增殖與骨向分化。本實驗嘗試將氟加至摻鍶透鈣磷石骨水泥中并確定最適鍶氟聯(lián)合用量，提高材料對成骨性能的影響，為進一步研究骨缺損修復(fù)材料提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器二水合磷酸氫鈣、碳酸鈣、焦磷酸鈉、磷酸二氫鈣、檸檬酸、氯化鍶、氟化鈉均購自天津麥克林公司;堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(南京建成公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Beyotime公司);OPG(兔抗鼠，美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(羊抗兔，北京博奧森公司)；ECL顯色試劑測定盒(美國PIERCE公司)；馬弗爐(上海星諾儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1骨水泥的制備 將二水合磷酸氫鈣與碳酸鈣以Ca/P摩爾比為1.5充分混合后，經(jīng)200#篩研磨后在1 000 ℃的馬弗爐中煅燒12 h以得到β-磷酸三鈣(β-TCP)，稱取β-TCP粉末3.102 g、磷酸二氫鈣2.521 g、焦磷酸鈉0.35 g，氯化鍶1.173 g，此用量制備所得材料Sr/(Sr+Ca)摩爾比為10%；按實驗分組將氟化鈉按不同質(zhì)量比(0.5wt%、1.0wt%、1.5wt%)加入其中，以單一摻鍶透鈣磷石骨水泥組為對照組，按2.5 g/ml固液比加入檸檬酸水溶液固化液后放入37 ℃、濕度恒為100%溫箱中固化24 h。以上此4組透鈣磷石骨水泥分組分別命名為F0組、F0.5組、F1.0組、F1.5組。

1.2.2掃面電鏡觀察及能譜分析 掃描電子顯微鏡(Scios03040702)掃描4組骨水泥的微觀形貌，并通過能譜分析進行分析。

1.2.3物相觀察 通過X射線衍射儀(D/MAX2500PC03030502)對4組骨水泥進行成分結(jié)構(gòu)分析。采用激光照射銅靶所產(chǎn)生的Kα(λ= 0.154 nm)作為射線源，掃描速度為1°/min。

1.2.4抗壓強度測試 通過萬能實驗驗機(AGS-X-10KNG)檢測4組骨水泥抗壓強度，接觸柱直徑為5 mm，壓縮速度為1 mm/min，使用5個樣品進行測試，結(jié)果取統(tǒng)計值。

1.2.5MTT法檢測各組骨水泥浸提液對細胞增殖的影響 培養(yǎng)基含2%胎牛血清的骨水泥浸提液，將細胞按103/孔接種到96孔板中，每組4個復(fù)孔。第1、3、5、7天后每孔加入20 μl MTT液，孵育4 h后，棄全部液體加200 μl DMSO。SM600酶標儀于492 nm波長測定吸光度(OD)值。

1.2.6不同分組骨水泥浸提液對細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響 培養(yǎng)基含2%胎牛血清的骨水泥浸提液，將細胞按105/孔接種于24孔板上，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)3 d后收獲細胞，BCA試劑盒計算蛋白總量，使用ALP試劑盒測定ALP活性。

1.2.7不同分組骨水泥浸提液對細胞人骨保護素(OPG)蛋白表達的影響 以5×103/孔密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，其培養(yǎng)基成分為含2%的胎牛血清浸提液和成骨細胞誘導劑，7 d后加入現(xiàn)配的100 μl裂解液(1.5 ml冷RIPA 裂解液中加入6 μl蛋白酶抑制劑)提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后以濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后兔抗鼠OPG孵育4 ℃過夜，TBST盒中洗后滴加羊抗兔辣根過氧化物酶(1 ∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，顯影后采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 SEM及EDS分析四組骨水泥材料表面微觀形貌的掃描電鏡(SEM)觀察見圖1。圖1A為F0組，表面為片狀、散在顆粒狀晶體和縫隙；圖1B為F0.5組，主要為長條狀、團塊狀晶體，裂隙明顯；圖1C為F1.0組，晶體部分排列成簇狀，微隙更為明顯；圖1D為F1.5組，晶體間間隙進一步增大。觀察顯示，隨著氟化鈉質(zhì)量比的增加，微觀形貌表面透鈣磷石晶體成片狀增加，晶體與晶體之間的縫隙增多，導致致密程度稍有下降。能譜儀對不同分組骨水泥的元素含量進行檢測，結(jié)果見表1，摻入氟化鈉后實驗組均測到氟和鍶元素的存在，隨著氟元素含量的增加，鍶元素從(5.62±0.06)%降低至(4.63±0.03)%。這可能是因為氟與鍶元素同時摻入透鈣磷石中產(chǎn)生一些互斥反應(yīng)。

2.2 抗壓結(jié)果分析F0、F0.5、F1.0和F1.5四組骨水泥抗壓強度見圖2。結(jié)果顯示，隨著氟化鈉質(zhì)量比的增加，抗壓強度稍有下降，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.048,P>0.05)，說明氟化鈉量的浮動對于透鈣磷石骨水泥的抗壓強度沒有顯著影響。

分組氟鍶F0組-5.62±0.06F0.5組0.31±0.055.20±0.03F1.0組0.51±0.074.82±0.04F1.5組0.79±0.054.63±0.03

圖2 四組材料抗壓強度測試

2.3 細胞增殖實驗結(jié)果培養(yǎng)第1、3、7天時，各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；培養(yǎng)第5天時， F1.5組顯著高于F0組(F=1.988,P<0.05)。上述結(jié)果說明，摻氟鍶透鈣磷石骨水泥對小鼠前成骨細胞增殖影響優(yōu)于單純摻鍶透鈣磷石骨水泥，氟化鈉的最佳摻入量為1.5wt%。見圖3。

圖3 四組透鈣磷石骨水泥浸提液作用下的細胞增殖活性分析與F0組比較：*P<0.05

2.4 ALP活性結(jié)果細胞在各組骨水泥浸提液作用3 d后，F(xiàn)1.5組ALP活性最高，顯著高于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.132，P<0.05)，而后三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，當氟化鈉質(zhì)量比為1.5wt%時可有效提高小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的ALP活性并促進其骨分化。

2.5 OPG蛋白表達結(jié)果使用蛋白印跡法檢測OPG蛋白表達水平，蛋白條帶見圖4。經(jīng)軟件分析F1.0組光密度值為 (190.093±11.724)，顯著高于F0組(168.017±7.778)、 F0.5組(155.723±4.044)和F1.5 組(164.550±8.651)(F=8.863,P<0.05),但F0 、F0.5和F1.5組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結(jié)果說明，當氟化鈉摻入量為1.0wt%時，可以有效地促進小鼠前成骨細胞的OPG蛋白表達。

圖4 Western blot法檢測四組材料浸提液對MC3T3-E1細胞中OPG蛋白表達的水平

3 討論

透鈣磷石屬于磷酸鈣骨水泥的一種，近年來備受關(guān)注，其具有良好的生物相容性和理化性能，且在生物體內(nèi)具有良好的降解性[6]。抗壓強度也與透鈣磷石孔隙率有顯著關(guān)聯(lián)[7]，孔隙率越大，抗壓強度越弱。掃描電鏡結(jié)果可以觀察到隨著摻入氟化鈉質(zhì)量比的增加，晶體之間孔隙隨之增加，且排列無序，這可能是由于氟元素與鍶元素對透鈣磷石共同作用引起的。Pors Nielsen et al[8]在研究中發(fā)現(xiàn)粒徑越小，有利于增強粉末與液體的結(jié)合力，抗壓強度越大。本實驗中β-TCP經(jīng)200目篩網(wǎng)篩取充分混合后制作透鈣磷石，預(yù)防骨水泥由于材料的顆粒尺寸因素影響抗壓強度。理想的骨修復(fù)材料應(yīng)滿足力學性能要求，非承重骨部位以小梁骨為準,抗壓強度應(yīng)大于5 MP，從實驗結(jié)果來看，摻氟鍶透鈣磷石骨水泥抗壓強度在15～19 MP之間，因而可以應(yīng)用顱頜面部部分骨缺損或非承重區(qū)域骨缺損的修復(fù)。

鍶元素與氟元素類似，都被稱為是一種親骨元素，兩者在一定范圍內(nèi)對成骨方面都表現(xiàn)為促進作用[9-10]。在此基礎(chǔ)上，周建宏 等[11]制備摻鍶氟羥基磷灰石微弧氧化復(fù)合涂層，再次證實鍶氟較有效促進了新骨的形成。在本實驗細胞培養(yǎng)的第5天，F(xiàn)1.5組浸提液對小鼠前成骨細胞有增殖效應(yīng)，證實氟鍶聯(lián)合應(yīng)用對小鼠前成骨細胞MC3T3-E1具有增殖效應(yīng)。但是在第7天結(jié)果沒有顯著差異，可能與培養(yǎng)一定的時間內(nèi)細胞脫落有關(guān)。綜上，極大可能推斷出氟鍶元素可以聯(lián)合作用于細胞，對細胞的增殖具有協(xié)同作用且無明顯毒性。

OPG是由成骨細胞分泌的一種糖蛋白，在成熟成骨細胞中高度表達，骨代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。作為一種破骨細胞成熟分化過程中的關(guān)鍵因子，也稱為破骨細胞形成抑制因子，其抑制破骨細胞的形成和分化并影響成熟破骨細胞的骨吸收活性，導致其凋亡[12-13]。周秋娟 等[14]經(jīng)體外實驗證實摻透鈣磷石骨水泥由于鍶的摻入促進了OPG的表達。同時，氟處于低濃度時，對骨向分化具有促進作用[15]。本研究通過Western blot法檢測四組骨水泥浸提液對MC3T3-E1中OPG蛋白表達的影響，結(jié)果顯示當氟元素與鍶元素同時摻入透鈣磷石組時與單一摻鍶透鈣磷石組相比較，前者OPG的蛋白表達水平明顯升高，且氟摻入量為1.0wt%時對OPG的蛋白表達促進效果最佳。因此可以推斷，這其中的差異來源于氟鍶的共同促進作用。