孫滿強，胡凱文，陳 琪，何樂毅凡，龐皓玥，李龍宇，周 天

冷凍消融術(shù)作為一種新興的微創(chuàng)治療技術(shù)具有低損傷、可重復的優(yōu)點，目前冷凍消融術(shù)復溫常采用兩種復溫范圍，分別是20 ℃～40 ℃和0 ℃～15 ℃，術(shù)者在復溫選擇時常常依據(jù)經(jīng)驗和習慣。當前關(guān)于冷凍消融機制的研究多體現(xiàn)在免疫方面，冷凍消融術(shù)不具有擴大型手術(shù)的特性，關(guān)于術(shù)后不同復溫溫度對殘存瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性影響的實驗研究較少。堿性-環(huán)-螺旋蛋白(Twist)是編碼位于常染色體的堿性-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在正常胚胎發(fā)育中調(diào)控細胞運動及組織重組，因其被發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用而備受關(guān)注，可調(diào)控上皮—間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)和血管新生[1]。該實驗采用免疫組化法檢測Twist、鈣黏附蛋白E(E-Cadherin)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達，探究冷凍消融術(shù)后冰球復溫溫度與殘存瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物和瘤株45只SPF級C57BL/6小鼠，4～5周齡，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。Lewis肺癌小鼠細胞(lewis lung cancer，LLC)購自美國CA公司。LLC細胞用含10%FBS(英國Biochrom公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Corning公司)進行培養(yǎng)，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細胞生長狀態(tài)最佳時進行收集，用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為1×107/ml，對小鼠進行皮下注射造模。

1.2 主要儀器和試劑冷凍消融術(shù)采用海杰亞CHS 800001手術(shù)系統(tǒng)，購自北京海杰亞醫(yī)療器械有限公司；Leica2135石蠟病理切片機、Leica病理組織包埋機購自德國Leica公司；顯微鏡購自日本Olympus公司；Anti-Twist單克隆抗體購自美國Abcam公司；Anti-E-Cadherin單克隆抗體、Anti-VEGF-A單克隆抗體、Anti-VEGF-C單克隆抗體、羊抗兔/鼠IgG H+L抗體(二抗)購自美國Proteintech公司。

1.3 造模取100 μl細胞懸液(106個細胞)皮下注射于45只小鼠右側(cè)背部。密切觀察小鼠生長狀況。

1.4 超低溫冷凍消融術(shù)造模24 d后，將45只荷瘤小鼠隨機分為3組，分別為對照組、復溫至0 ℃組(T0組)、復溫至40 ℃組(T40組)，每組15只。對照組未予任何干預，T0組予100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定后，備皮，消毒，采用海杰亞冷凍消融設(shè)備實行冷凍手術(shù)。將1.66 mm冷凍刀頭插入腫瘤中央，采用單循環(huán)冷凍方法，當冷凍范圍到達癌旁組織時開始升溫，直到腫瘤中心溫度到達0 ℃，停止復溫，拔出探針。T40組操作如上，當腫瘤中心溫度達到40 ℃時，拔出探針。冷凍消融術(shù)第1天記為第0天(Day0，D0)。

1.5 取材小鼠的體質(zhì)量每隔1 d記錄1次，在術(shù)后第14天(D14)進行脫頸處死，剝離腫瘤并進行稱重，計算腫瘤抑制率=([對照組平均腫瘤重量]-[實驗組平均腫瘤重量])/[對照組平均腫瘤重量]×100%。腫瘤稱重后放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.6 免疫組化染色法檢測取包埋后的組織修剪邊緣后裝入切片機作4 μm切片，烘箱過夜進行脫蠟，脫蠟后將標本進行阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后將標本架置于pH 9.0 抗原修復液中進行修復(置于微波爐中高火7 min，中低火15 min)，用自來水復溫后取適量Anti-Twist抗體用一抗稀釋液稀釋至合適濃度(稀釋濃度1 ∶100)孵育標本30 min，沖洗后滴加二抗孵育20 min，最后進行DAB顯色，封片后用顯微鏡觀察Twist蛋白表達及分布(按照抗體說明書及文獻，Twist陽性表現(xiàn)為胞核出現(xiàn)黃色或棕色的顆粒狀物質(zhì)沉積)。Twist蛋白表達水平以平均光密度值(Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像所得)表示。同理，按照上述實驗方法進行E-Cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白檢測。

2 結(jié)果

2.1 小鼠冷凍消融術(shù)后體質(zhì)量比較對小鼠術(shù)后各時間段體質(zhì)量進行統(tǒng)計分析，見表1。對照組小鼠體質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率計算對照組腫瘤質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組平均腫瘤抑制率為25.14%，T40組平均腫瘤抑制率為15.85%，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.3 各組腫瘤組織中Twist、E-cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白的表達免疫組化染色結(jié)果顯示，高倍鏡下觀察，用細胞內(nèi)棕黃色強弱來判斷腫瘤細胞內(nèi)蛋白表達的高低，結(jié)果以平均光度值來表示。T0組Twist表達低于對照組(P<0.05)，T40組Twist表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。T0組E-Cadherin表達高于對照組(P<0.05)，T40組E-Cadherin表達高于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。T0組VEGF-A表達低于對照組(P<0.05)，T40組VEGF-A表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。T0組VEGF-C表達低于對照組(P<0.01)，T40組VEGF-C表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。見圖1、2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和腫瘤質(zhì)量變化

與對照組比較：*P<0.05

3 討論

冷凍消融手術(shù)具有安全、有效、微創(chuàng)、副作用小等優(yōu)點，目前已廣泛應用于中晚期肺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌等惡性腫瘤的治療[2-3]。當前國內(nèi)外關(guān)于氬氦刀抗腫瘤效應的機制研究主要體現(xiàn)在溶解效應、凋亡效應、微血栓形成和免疫效應4個方面[4-8]。0 ℃以上的復溫溫度均可使冰球融化，但是不同復溫溫度是否會對殘存瘤侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響的相關(guān)研究較少。

當前研究[9-10]表明，EMT和血管新生是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。EMT過程可使具有極性特點的上皮細胞轉(zhuǎn)化為可移動的間質(zhì)細胞，利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。E-Cadherin減少是EMT過程中的重要表現(xiàn)[11-12]。腫瘤組織血流供應增強是腫瘤惡性程度的重要標志，VEGF具有促內(nèi)皮細胞生長、增加血管通透性，以及協(xié)助腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng)等作用[13]。VEGF-A主要促進血管內(nèi)皮新生，VEGF-C主要促進淋巴管內(nèi)皮新生。而Twist蛋白對于E-Cadherin 和VEGF均有調(diào)控作用，Twist在多種人類腫瘤中表達上調(diào)，并直接導致E-cadherin表達下調(diào)，致使上皮細胞間黏附力降低，細胞失去上皮特征、從原位脫落、運動能力加強，并在侵襲帶形成偽足、組裝張力絲并召集細胞基質(zhì)降解酶，為侵襲轉(zhuǎn)移提供了必要前提[10]。轉(zhuǎn)染Twist的腫瘤細胞可增加VEGF的表達，促進腫瘤微血管、微淋巴管生成，而通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調(diào)Twist則可見VEGF表達量下降，通過RT-PCR檢測得其mRNA呈同樣變化趨勢[14]。由此得知Twist、E-Cadherin、VEGF是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的重要蛋白，而E-Cadherin和VEGF的表達受Twist調(diào)控。

圖1 各組腫瘤組織免疫組化結(jié)果 ×400

圖2 各組腫瘤組織中Twist平均光密度值 與對照組比較：*P<0.05

本實驗結(jié)果顯示，實驗組小鼠在手術(shù)之后體質(zhì)量減少，這與剪開皮毛，暴露腫瘤的手術(shù)損傷有關(guān)。對照組腫瘤質(zhì)量大于T0組和T40組(P<0.05)，表明冷凍消融術(shù)對腫瘤起到抑制作用。進一步行免疫組化發(fā)現(xiàn)，相比對照組，T0組和T40組的Twist、VEGF-A、VEGF-C蛋白表達降低，E-Cadherin蛋白表達增高(P<0.05)。T0組和T40組在腫瘤抑制率和相關(guān)蛋白表達方面差異雖無統(tǒng)計學意義，但T0組在各項數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面均優(yōu)于T40組。由此得出：冷凍消融術(shù)后0 ℃復溫相較于40 ℃復溫對于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性具有更好的抑制作用，其機制與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管新生兩個過程有關(guān)。氬氣和氦氣是稀有氣體，具有很高的價值性和戰(zhàn)略性，0 ℃復溫符合環(huán)保節(jié)能的原則，此實驗結(jié)果對于氬氦刀術(shù)后復溫溫度選擇具有一定指導意義。本研究只從組織層面對實驗目的進行驗證，缺少基因轉(zhuǎn)錄層面的驗證，并且腫瘤的表觀層面缺乏更強的說服性，以上是本實驗的不足和待改進之處。除此之外，冷凍消融對腫瘤微環(huán)境的影響是多方面的，以上只是從轉(zhuǎn)移角度進行探索，在炎癥、免疫方面的探索將是后續(xù)的研究方向。