吳承，朱少明綜述 程帆審校

腎纖維化(renal fibrosis)是由各種致病因素導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行性損壞和功能逐漸喪失的病理生理過程，是所有進(jìn)展性慢性腎病(CKD)發(fā)展為終末期腎病的共同途徑。其特征為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎小管間質(zhì)中過度沉積。腎纖維化的發(fā)病機(jī)制是初始損傷后發(fā)生的一種失敗或適應(yīng)不良的腎臟修復(fù)過程，它涉及腎臟中幾乎所有細(xì)胞類型的相互作用和協(xié)調(diào)[1]。腎纖維化是一個(gè)很難逆轉(zhuǎn)的病理過程，目前尚無有效的治療方法。自噬(autophagy)是細(xì)胞通過形成自噬體和自噬溶酶體對(duì)細(xì)胞質(zhì)組分進(jìn)行降解的過程。自噬除了具有分解代謝功能外，還是細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，在各種疾病包括纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。近年來，多項(xiàng)研究證明自噬在腎纖維化疾病中起作用[2-3]，根據(jù)細(xì)胞或組織類型和病理狀態(tài)，自噬可以促纖維化或抗纖維化[4-5]。這些研究表明誘導(dǎo)自噬可能參與腎纖維化的腎保護(hù)機(jī)制，但其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。因此，研究自噬及其在腎纖維化中的作用對(duì)于尋找腎纖維化的有效治療靶點(diǎn)尤為必要。

1 自噬的概念及分類

自噬指細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下，通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡(即自噬體)，包裹細(xì)胞內(nèi)損傷或變性的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)以及入侵的病原體等物質(zhì)，并運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解的生物學(xué)過程。其過程大致分為誘導(dǎo)、核化、自噬前體的延伸、自噬體的成熟等4個(gè)階段，它的典型特征是在細(xì)胞質(zhì)中形成自噬體。自噬分為生理?xiàng)l件下的基礎(chǔ)自噬以及應(yīng)激條件下的誘導(dǎo)型自噬[6]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞通過自噬降解損傷、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器及各種生物大分子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分解代謝和循環(huán)利用。病理狀態(tài)下，自噬作為細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制可以清除入侵的病原體，并可保護(hù)細(xì)胞免受毒性物質(zhì)的損傷。根據(jù)功能和細(xì)胞內(nèi)底物進(jìn)入溶酶體的途徑不同，又可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)等3種主要類型[7]。巨自噬是研究最為廣泛和深入的類型，通常所說的自噬即指巨自噬。微自噬是指直接通過溶酶體膜隨機(jī)突出和內(nèi)陷吞噬細(xì)胞內(nèi)容物的一種非選擇性降解過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是由分子伴侶蛋白如熱休克蛋白70(HSP70)識(shí)別含有特定序列五肽基的可溶性蛋白底物并與之結(jié)合，然后經(jīng)過單獨(dú)跨膜轉(zhuǎn)移將這些底物運(yùn)送到溶酶體內(nèi)降解，但不能降解細(xì)胞器，此類型自噬只存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，而且具有高度選擇性。這3種類型的自噬雖然具有形態(tài)上的差異，但都達(dá)到了將內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解和循環(huán)利用的目的。

2 自噬過程中的分子機(jī)制

2.1 自噬的誘導(dǎo) 自噬的全過程受自噬基因(autophagy-related genes,ATGs)和自噬蛋白(autophagy-related proteins，Atgs)的高度調(diào)控。自噬蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表示為ATGs，在酵母菌中表示為Atgs。細(xì)胞在內(nèi)外某些不利因素如缺氧、饑餓、受損蛋白質(zhì)蓄積、高溫、細(xì)菌入侵等的誘導(dǎo)下，其平時(shí)處于抑制狀態(tài)的自噬過程被啟動(dòng)[8]。目前發(fā)現(xiàn)有30多種自噬基因，其中與誘導(dǎo)自噬密切相關(guān)的是ULK1復(fù)合物(ULK1是ATG1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源蛋白)。ULK1復(fù)合物在正常狀態(tài)下與雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受雷帕霉素作用或缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)，ULK1復(fù)合物與mTORC1解離而活化[9]，或當(dāng)細(xì)胞處于其他應(yīng)激狀態(tài)時(shí)通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被激活[10]?；罨腢LK1使ATG13和FIP200磷酸化，形成ULK1/2-ATG13-FIP200復(fù)合物，將其他自噬蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到吞噬泡組裝位點(diǎn)(phagophore assembly site, PAS)，并在此生成新月形的自噬前體膜[11]。

2.2 自噬前體的核化 繼自噬蛋白之后，下一個(gè)被募集到PAS的是含有ATG14的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)。PI3K由PIK3C3/Vps34、PIK3R4/P150和Beclin-1組成，其主要通過與Beclin-1相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)控作用，參與核化過程[12]?？缒さ鞍譇TG9和液泡膜蛋白1(VMP1)在核化階段發(fā)揮重要作用。研究表明，形成自噬前體膜所需的原料主要為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的膜和質(zhì)膜。ATG9在介導(dǎo)這些供體細(xì)胞器為自噬體前膜的形成供給原料過程中起關(guān)鍵作用[13]。VMP1則通過其ATG結(jié)構(gòu)域與Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，將PI3K募集至自噬前體膜[14]。同時(shí)，活化的ULK1使Beclin-1和ATG14L磷酸化來增強(qiáng)PI3K的活性[14]。PI3K將磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)磷酸化轉(zhuǎn)變成磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)[15]，從而使自噬前體膜經(jīng)過核化成為杯狀結(jié)構(gòu)的吞噬泡(phagophore)即自噬前體。

2.3 自噬前體的延伸 自噬前體的延伸需要2個(gè)泛素樣(ubiquitin-like,UBL)蛋白系統(tǒng)的參與。第1個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng)是ATG12。ATG12在E1激活酶ATG7和E2結(jié)合酶ATG10的作用下依次與ATG5和ATG16結(jié)合形成ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物[16]，該復(fù)合物與吞噬泡膜特異性結(jié)合，促進(jìn)吞噬泡的延伸。第2個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng)是LC3。ATG4將LC3前體切割成LC3-I，最初存在于細(xì)胞質(zhì)中。隨后LC3-I依次與ATG7和ATG3結(jié)合，并由這2種自噬蛋白加工處理，然后與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)耦聯(lián)，形成脂質(zhì)形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ結(jié)合于自噬體膜上，直至自噬體與溶酶體結(jié)合，是自噬體膜的特征性標(biāo)志[17]。另外跨膜蛋白ATG9的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和多聚化對(duì)自噬體的形成是必需的，在自噬前體膜的延伸過程中發(fā)揮重要作用[18]。

2.4 自噬體的成熟 自噬前體在延伸的過程中不斷包裹胞漿中的受損蛋白質(zhì)及異常細(xì)胞器，最終在邊緣融合成為密閉的自噬體(autophagosome)，自噬體再與內(nèi)涵體或溶酶體相互融合，成為自噬溶酶體(autolysosome)。該過程中，自噬體向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于微管，而自噬體與內(nèi)涵體的融合需要VTI1B蛋白的參與[19]。紫外線抵抗相關(guān)基因(ultraviolet radiation resistance-associated gene,UVRAG)蛋白可以與PI3K復(fù)合物結(jié)合，并可以激活GTPase RAB7，GTPase RAB7可以促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合[20]。自噬溶酶體形成后，其中包裹的內(nèi)容物被溶酶體水解酶降解，生成新的氨基酸、脂肪酸、核苷酸等小分子，供機(jī)體重新利用[11]。

3 自噬的調(diào)控

自噬是一個(gè)高度保守的過程，由許多不同的調(diào)節(jié)因子控制。在介導(dǎo)自噬的多條信號(hào)通路中，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Beclin-1、P53作為它們的交叉點(diǎn)，對(duì)自噬的調(diào)控起關(guān)鍵作用。mTOR是一種絲氨酸和蘇氨酸激酶，由對(duì)雷帕霉素敏感的mTORC1和對(duì)雷帕霉素不敏感的mTORC2兩種功能性多蛋白復(fù)合物組成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白合成、代謝和細(xì)胞死亡方面具有重要作用[21]。mTOR的上游是PI3K-Akt-mTORC1途徑，其最顯著的特征是調(diào)控細(xì)胞增殖[22]。Ⅰ型PI3K是一個(gè)信號(hào)傳感器，它接收上游生長(zhǎng)因子信號(hào)，并通過3-磷酸肌醇依賴性激酶1 (PDK1)促進(jìn)Akt(蛋白激酶B)的磷酸化。Akt磷酸化后可激活mTORC1，并最終抑制自噬。mTOR的下游是ULK復(fù)合物，由Atg13 、ULK1/2和FIP200組成，這些組分都是啟動(dòng)自噬體形成所必需的[9]。在正常代謝條件下，mTORC1使Atg13磷酸化，阻止ULK1、ULK2和FIP200的結(jié)合，從而抑制自噬。在機(jī)體能量缺乏時(shí)，AMPK被激活，從而抑制mTORC1和激活ULK復(fù)合物，啟動(dòng)自噬體的形成[9-10]。ULK1復(fù)合物的調(diào)節(jié)信號(hào)對(duì)自噬的進(jìn)展是至關(guān)重要的，這些信號(hào)啟動(dòng)Vps34與自噬啟動(dòng)子Beclin-1結(jié)合，形成Beclin-1復(fù)合物。Beclin-1復(fù)合物募集其他ATG蛋白定位于自噬前體膜，促進(jìn)結(jié)合位點(diǎn)的形成和自噬蛋白的結(jié)合，并驅(qū)動(dòng)自噬體形成的早期步驟。Beclin-1的功能可被不同的結(jié)合配體抑制或激活，例如被Bcl-2抑制和被UVRAG激活[23]。此外，腫瘤抑制蛋白P53在細(xì)胞發(fā)育中具有多種調(diào)節(jié)功能，包括誘導(dǎo)或抑制自噬。P53在自噬中的作用是位置依賴性的[24]，位于細(xì)胞核內(nèi)的P53通過激活靶基因(如DRAM)誘導(dǎo)自噬，而位于細(xì)胞質(zhì)中的P53則以細(xì)胞周期依賴性方式抑制自噬，但其抑制自噬的機(jī)制目前尚不完全清楚。

4 自噬與腎纖維化

腎纖維化是腎臟遭受內(nèi)外多種致病因素的刺激，發(fā)生固有細(xì)胞損傷和大量膠原聚積，造成腎實(shí)質(zhì)硬化和瘢痕形成，最終導(dǎo)致腎功能完全喪失的一種病理生理改變。其發(fā)生機(jī)制的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積[1]。在進(jìn)行性腎臟疾病中，無論初始病因如何，腎纖維化是終末期腎病(ESRD)的共同途徑。在體外和體內(nèi)研究中已經(jīng)表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的上調(diào)在腎纖維化的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其中TGF-β1是其最豐富的同種型，已被確立為腎纖維化的中樞介質(zhì)[2]。TGF-β1可通過Smad3依賴性或非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(如Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白)的產(chǎn)生，也可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和誘導(dǎo)MMP的天然抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)來抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[3]。最近研究表明，TGF-β1可調(diào)節(jié)自噬，而自噬可調(diào)節(jié)與腎纖維化相關(guān)的信號(hào)通路，如腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和糖尿病腎病[25-26]。在腎纖維化中，TGF-β1是一種具有雙重功能的多效細(xì)胞因子，既能誘導(dǎo)膠原蛋白合成，又能誘導(dǎo)自噬和促進(jìn)膠原蛋白的降解[2]。膠原蛋白合成和降解之間的平衡對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。并且，TGF-β可以通過PI3K/Akt激活mTOR通路，因此它可能對(duì)自噬起激活和抑制的雙重作用，這可能取決于特定的細(xì)胞類型和環(huán)境[3]。有研究表明，自噬的上調(diào)和下調(diào)都可能影響腎纖維化的轉(zhuǎn)歸和發(fā)展[4,27]。由此可見，自噬對(duì)腎纖維化的作用可能是多方面的和細(xì)胞特異性的。

5 自噬在腎纖維化中的作用

5.1 自噬抗腎纖維化的作用與機(jī)制 自噬可抑制腎纖維化，并且是維持腎臟和系膜細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)所必需的。目前已有的研究表明，自噬抑制腎纖維化的機(jī)制主要是通過促進(jìn)活性TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)的降解[2]。TGF-β1是腎纖維化的有效誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，包括膠原蛋白和纖維連接蛋白，其過度生產(chǎn)和逐漸積累是腎纖維化的標(biāo)志。同時(shí)，TGF-β1也是自噬的重要誘導(dǎo)物，在體外培養(yǎng)的人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)中，TGF-β1誘導(dǎo)自噬體的積累和自噬蛋白LC3的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)成熟TGF-β1的降解來抑制腎纖維化的進(jìn)展[28]。并且，LC3介導(dǎo)的自噬可降解腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)中的成熟TGF-β，從而減少TGF-β分泌并抑制由單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)和腎損傷誘導(dǎo)的腎纖維化。此外，自噬蛋白Beclin-1亦有助于防止腎臟中膠原蛋白的過度沉積[28]。在腎纖維化的發(fā)展過程中，另一個(gè)重要因素是系膜細(xì)胞(MC)。在腎損傷和進(jìn)展性腎病過程中，系膜細(xì)胞進(jìn)行增殖并產(chǎn)生過多的細(xì)胞外基質(zhì)，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Col-Ⅰ是與纖維化相關(guān)的主要類型。TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞自噬，可通過降解細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和防止不溶性前膠原蛋白的過度積累[5]，從而抑制腎纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，自噬還可保護(hù)腎小管細(xì)胞免受環(huán)孢霉素A(CsA)誘導(dǎo)的凋亡[29]，明顯減輕腎功能障礙。除腎小管細(xì)胞外，腎損傷過程中誘導(dǎo)的自噬可保護(hù)系膜細(xì)胞免于凋亡，說明自噬不僅可保護(hù)上皮細(xì)胞，也可保護(hù)間充質(zhì)細(xì)胞。此外，在自噬的調(diào)節(jié)因子中，mTOR抑制劑抗纖維化作用的相關(guān)研究表明，雷帕霉素抑制mTORC1信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病具有較強(qiáng)的腎臟保護(hù)作用[30-31]。但mTOR抑制劑抗纖維化作用的機(jī)制主要是由于其對(duì)自噬的間接誘導(dǎo)作用，還是由于其抗增殖活性，目前尚存在爭(zhēng)議。

5.2 自噬促進(jìn)腎纖維化的作用與機(jī)制 自噬不僅可以抑制腎纖維化，也能促進(jìn)腎纖維化。例如，在UUO導(dǎo)致的腎纖維化小鼠模型研究中，持續(xù)激活腎小管細(xì)胞自噬促進(jìn)腎纖維化[4]。自噬促進(jìn)腎纖維化的機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)腎小管萎縮和分解[32]。在腎纖維化中，自噬和腎小管萎縮的聯(lián)系最初也是在單側(cè)輸尿管梗阻的動(dòng)物研究中提出的。研究表明，自噬在阻塞的腎小管中被激活，表現(xiàn)為自噬體積聚、Beclin-1表達(dá)增加和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化[4]。這些變化伴隨著自噬溶酶體的增加和活性增強(qiáng)，進(jìn)一步表明在阻塞的腎小管中誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)。伴隨著自噬，在阻塞的腎小管中也誘導(dǎo)了腎小管細(xì)胞凋亡。重要的是，腎小管萎縮的發(fā)展與自噬和凋亡呈時(shí)間依賴性，提示自噬可能與細(xì)胞凋亡協(xié)同作用，誘導(dǎo)腎小管萎縮和腎單位喪失[4]。在類似研究中，Koesters等[33]通過在腎小管中過表達(dá)TGF-β1的四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的持續(xù)表達(dá)在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，具有自噬特征的腎小管塌陷，細(xì)胞碎片填充殘留腔。這些變化與廣泛的腎小管周圍纖維化有關(guān)。這種退化變性的細(xì)胞其細(xì)胞核顯示正常染色，未見表示凋亡的TUNEL染色陽性?？傊@些結(jié)果表明自噬是TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化中腎小管萎縮和分解的主要原因。除該機(jī)制外，另有研究表明，雷帕霉素激活自噬可誘導(dǎo)促纖維化信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)效應(yīng)[34]；而不受雷帕霉素直接影響的mTORC2/Rictor信號(hào)通路是TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞活化的重要下游分支，該通路的激活高度促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展[35]。此外，通過TGF-β的正向前饋機(jī)制起作用的活性氧(ROS)是細(xì)胞應(yīng)激中自噬的有效激活劑，其主要通過抑制mTOR介導(dǎo)的途徑起作用[36]。這表明自噬可通過激活非Smad信號(hào)通路(包括ROS的產(chǎn)生)促進(jìn)纖維化。但是，自噬在腎纖維化中的病理生理學(xué)影響仍需要進(jìn)一步研究來闡明。

6 展望

自噬作為細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的一種適應(yīng)性反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，在機(jī)體許多生物學(xué)過程中起重要作用。自噬的失調(diào)是導(dǎo)致多種疾病包括腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制。已有研究表明，自噬失調(diào)與腎纖維化疾病密切相關(guān)，并支持自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的觀點(diǎn)。自噬是腎損傷中應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)不可缺少的機(jī)制，通過清除蛋白聚合物和受損細(xì)胞器，以及負(fù)向調(diào)節(jié)和防止腎臟中基質(zhì)蛋白的過量積累，促進(jìn)細(xì)胞存活和抗纖維化。但是，也有研究表明自噬促進(jìn)腎纖維化。自噬在腎纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用可能是多方面和復(fù)雜的?；谀壳瓣P(guān)于自噬在腎纖維化中的研究仍處于起步階段，在未來的研究中，有必要進(jìn)一步加深對(duì)自噬的機(jī)制和生理功能的認(rèn)識(shí)，確定自噬是否可能成為預(yù)防或減輕腎纖維化發(fā)病機(jī)制的有效治療靶點(diǎn)。