王 佳，吳航利，管融資，安 鵬，雷 忻*

(1.延安大學生命科學學院；2.延安市生態(tài)恢復重點實驗室，陜西延安716000)

斑馬魚(Daniorerio)是一種小型亞熱帶淡水硬骨魚，也被稱為藍條魚和花條魚，屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔尼魚屬(Danio)。因其主要神經遞質系統(tǒng)的功能與哺乳動物具有相似性、具有簡單而區(qū)分清晰的腦組織、透明度很高的胚胎和絨毛膜、胚胎體外發(fā)育迅速等特征，已被大面積用于生態(tài)毒理學實驗，成為神經生物學中的常見動物模型[1-6]。此外，斑馬魚符合替代、減少、優(yōu)化原則；胚胎在發(fā)育早期透明度高，其神經細胞的變化可以被很清晰的觀察到，這也使得斑馬魚在毒理、藥物篩選和遺傳的研究中的應用越來越廣泛[7，8]。本文就幾類主要的環(huán)境污染物脅迫對斑馬魚的神經毒性研究進行綜述并在此基礎上對以后的研究加以展望，為斑馬魚在神經毒性研究中的應用提供了參考和思路。

1 農藥脅迫對斑馬魚的神經毒性效應

農藥因其穩(wěn)定的化學性質，幾乎很難被降解，同時對生物又具有多種毒性，包括：生殖毒性、內分泌干擾毒性、神經系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)抑制毒性等，也可以使人類健康以及環(huán)境受到嚴重威脅[9]。根據其效應和結構特點又可分為神經抑制類農藥、手性農藥。

1.1 神經抑制類農藥

有機磷農藥、氨基甲酸酯類農藥和擬除蟲菊酯類農藥可影響動物神經系統(tǒng)的傳導，從而產生對神經的毒性作用，所以把這幾類農藥歸納為神經抑制類農藥。膽堿能受體由毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChR)和煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)組成。膽堿能受體在整個中樞神經系統(tǒng)中差異表達，在神經元分化、基因表達調控、突觸的形成與成熟、神經遞質釋放這些調控中均起著重要的作用。因此，因這兩者活性的變化為指標更能體現出農藥對斑馬魚的神經毒性效應。

劉亮通過檢測斑馬魚體內mAChR、nAChR的水平來表述有機磷農藥馬拉硫磷、氨基甲酸酯類農藥滅多威和擬除蟲菊酯類農藥溴氰菊酯對斑馬魚兩者活性的影響[10-13]。結果顯示：暴露前期，低濃度的農藥組基本上都出現了mAChR活性升高的現象，這與生物逐級行為模型中前期的刺激過程有關。隨著暴露時間的延長，mAChR的活性表現為顯著的降低趨勢。在大部分濃度的暴露前期nAChR的活性就會有明顯的降低，而活性隨暴露時間的增加而降低的現象并不明顯，且在暴露過程中，nAChR的活性經常會一直保持在一定的范圍內，這也說明農藥對nAChR活性的抑制不是很明顯。有時mAChR和nAChR活性在暴露期間升高，這被認為與斑馬魚對農藥環(huán)境的適應性和新陳代謝的調節(jié)以及與生物逐級行為模型的調整階段有關。

相關研究表明：有機磷類農藥的神經毒作用機理主要是使神經末梢的乙酰膽堿酯酶磷酸化而失活，導致毒覃堿效應、煙堿效應；氨基甲酸酯類農藥進入機體主要作用的神經細胞軸突，引起鈉通道持續(xù)開放，導致膜電位長久去極化，從而引起神經興奮性傳導障礙；擬除蟲菊酯類農藥神經毒理的分子機制是多方面的，主要包括：對腦組織生物膜影響、對神經遞質的影響、對神經信號傳導過程的影響、對神經細胞損傷機理等。

1.2 手性農藥

周炳以人成神經細胞瘤細胞(SH-SY5Y)為體外研究模型，研究了馬拉硫磷對神經細胞以及馬拉硫磷對映體對神經細胞毒性的選擇性差異，以斑馬魚胚胎為體內研究模型研究馬拉硫磷對映體對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。在本研究中測定了馬拉硫磷R-體和S-體對SH-SY5Y神經細胞生長影響的選擇性差異。結果顯示，馬拉硫磷R型馬拉硫磷(R-體，馬拉硫磷對映體的一種)對神經細胞生長的抑制效應高于其外消旋體和S型馬拉硫磷(S-體，馬拉硫磷對映體的一種)。這種手性選擇性差異的來源，可能與手性化合物與生物大分子如蛋白質相互作用的差異以及手性化合物生物轉化的選擇性差異有關。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現，R-馬拉硫磷對于細胞的生長及其形態(tài)改變的影響最為顯著。這說明對于人成神經細胞的生長而言馬拉硫磷存在著一定的手性選擇性細胞毒性。造成這種對映體選擇性差異的原因可能是因為一般手性農藥作用的靶標和非靶標生物都是手性的，包括水體在內的自然環(huán)境也是手性的，外來的手性化合物進入手性環(huán)境中，不同對映體在環(huán)境中的代謝、毒理也會存在差異。而對于斑馬魚胚胎的研究結果表明：馬拉硫磷對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響也存在顯著的對映體選擇性，與其對神經細胞的毒性存在著明顯的對映體選擇性相一致[14-17]。

2 臨床藥物脅迫對斑馬魚的神經毒性效應

一些藥物由于不同程度的神經毒副作用威脅到病人的安全，嚴重影響了它的使用，即使已經在使用了這些隱患也會使其最終退出市場。因此，早期的神經毒性評估是藥物風險評估的重要構成部分。

2.1 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類(FQs)主要用以治療消化道感染和腹腔及軟組織等感染。肖超強通過測定具有典型結構的FQs對運動行為的影響方面，探索FQs結構與其神經毒性的關系，發(fā)現FQs結構的變化能夠改變其毒性特征，在C-7位置的哌嗪環(huán)結構的分裂可以降低藥物的神經毒性；C-3位的脫羧基和C-5的NH2取代衍生物可能具有更大的神經毒性[18]。賀詩靜利用反轉錄實時定量PCR(qRT-PCR)儀器以及全胚原位雜交技術和顯微注射法進行實驗得出氟喹諾酮類藥物諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)干擾了干細胞標志基因、神經元標志基因、神經膠質細胞標志基因的表達，并可能擾亂早期胚胎神經發(fā)育中各系細胞的分化平衡，影響胚胎正常的神經發(fā)育。實驗表明NOR對斑馬魚胚胎的神經毒性是通過破壞神經元、神經膠質細胞系的分化平衡來實現的[19]。此外，NOR的毒性作用可能與神經系統(tǒng)中細胞的凋亡異常有關，異?？赡苁怯捎贜-甲基-D-天冬氨酸受體的過度激活。

FQs的神經作用發(fā)生機制并未完全清楚，可能的機制包括與其他藥物的藥代相互作用；藥效相互作用；FQs自身的藥理作用，與神經遞質的相互作用被認為是主要原因。FQs自身藥理對神經系統(tǒng)的作用機制包括抑制γ-氨基丁酸受體、激活N-甲基-D-天冬氨酸受體等。

2.2 丙泊酚

丙泊酚是一種烷基酸類的短效靜脈麻醉劑，用于全身麻醉的誘導和維持。靜脈注射后快速穩(wěn)定地進入麻醉，并從麻醉中恢復所花費的時間少。

郭培培通過實驗探討丙泊酚對斑馬魚的神經毒性作用以及斑馬魚胚胎細胞凋亡與丙泊酚暴露是否有關，結果證實丙泊酚可以影響幼魚的大腦組織結構、誘導細胞凋亡[20]。此外，丙泊酚暴露對斑馬魚的神經毒性作用持續(xù)存在，丙泊酚在暴露后24 h仍能誘導幼魚腦細胞凋亡。丙泊酚可影響突觸的形成過程，通過影響樹突棘的形態(tài)和濃度，突觸結構的數量來改變神經信號的傳導，最終導致神經系統(tǒng)發(fā)育崎形，出現行為的異常

2.3 抗精神病藥

氯丙嗪(Chlorpromazine，Cpz)一種吩噻嗪類藥物，是中樞多巴胺受體的拮抗劑，臨床上用以治療精神類疾病、鎮(zhèn)吐等。史慧勤等用胚胎接觸氯丙嗪的方式，利用吖啶橙染色，發(fā)現胚胎中的凋亡細胞主要分布在中腦和后腦及其交接處，石蠟切片的病理檢查顯示Cpz暴露后斑馬魚幼年大腦發(fā)育不良，腦細胞體積減少，腦細胞間隙增大[21]。

氟哌啶醇(Haloperidol，Hal)一種丁酰苯類藥物，與Cpz療效類似，臨床上用于急性精神分裂癥的緩解和治療，同時作為吩噻嗪類藥物的替代和補充。王鎮(zhèn)的實驗結果進一步證實：Hal可以改變斑馬魚多巴胺能神經元的數量進而改變其行為[22]。此外，值得注意的是：在Hal環(huán)境下5 d后，將斑馬魚轉移至治療和減輕帕金森病(PD)的藥物左旋多巴中2 d，Hal對幼魚的神經毒性引起的僵硬、行動不便且緩慢等癥狀明顯減輕。此類實驗表明抗精神病藥是通過影響斑馬魚神經系統(tǒng)發(fā)育進而影響斑馬魚的行為。

3 金屬脅迫對斑馬魚的神經毒性效應

目前，水環(huán)境污染的特征是大量污染物，特別是包括神經毒素在內的微污染物混合物。其中重金屬具有蓄積性而且其來源廣泛，涵蓋大部分農用化學藥品、工業(yè)、冶煉、化工等行業(yè)，它不僅直接危害水生生物，還通過食物鏈威脅高營養(yǎng)級的物種健康。最終，它危害人類并對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重的破壞[23]。大量研究表明金屬尤其是重金屬中毒是造成神經疾病發(fā)生的重要原因之一。本文主要概述了兩種金屬Al和Pb。

3.1 Al

已有文獻報道，鋁能滲透血腦屏障進入大腦，在整個腦內積累，特別是海馬區(qū)；可能導致神經元凋亡和神經炎癥，最終造成學習記憶及運動行為的改變，但還未明確Al對神經系統(tǒng)作用的具體機制[24-28]。

崔國禎等通過斑馬魚行為學、ROS水平和轉錄組學研究，探討了鋁對斑馬魚神經毒性的作用及其毒性的分子相關機制。實驗結果表明：AlCl3處理顯著改變了介入調節(jié)兩種神經退行性疾病的基因表達，包括：肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)相關基因表達特異性上調；老年癡呆(AD)相關基因增強子特異下調表達。此外，AlCl3處理后，誘導斑馬魚幼魚發(fā)生了腦部等ROS產生增多，氧化應激水平升高，發(fā)生細胞損傷。斑馬魚幼魚的神經前體細胞中特異表達的轉錄因子Neurogenin1表達下調30多倍，對神經元的分化很可能有顯著的抑制作用。這說明鋁可能通過誘導氧化應激和調控Neurogenin1等多個與神經系統(tǒng)相關基因的表達，對行為學產生損害[29]。

談勇等通過熒光定量PCR檢測血腦屏障及神經系統(tǒng)相關蛋白-密封蛋白(claudin)的mRNA表達水平的變化來驗證Al對斑馬魚神經系統(tǒng)的影響，發(fā)現密封蛋白家族的cldn5amRNA水平在低濃度AlCl3暴露時變化并不明顯，但在高濃度長時間作用下明顯降低[30]。而密封蛋白家族的表達水平下調，會造成血腦屏障作用減弱，從而使鋁離子入腦[31]。

3.2 Pb

Pb具有多種毒性，包括神經毒性、生殖、免疫和肝臟毒性；但是神經系統(tǒng)是Pb中毒后機體表現最明顯的系統(tǒng)，也是Pb作用的主要靶標[32]。

陳香平等通過Pb急性暴露實驗說明Pb暴露對斑馬魚產生明顯的神經行為毒性，具體表現為：增加斑馬魚自主運動頻率，降低觸摸反應能力、自由泳動活力以及對光暗周期刺激的游泳速率等。斑馬魚運動行為異常與毒物影響其運動神經元生長，阻礙樹突和軸突之間的信號傳遞有關。這也證明了Pb抑制初級神經元的生長[33]。張晴等通過實驗進一步證明了Pb暴露會誘導精神運動損傷[34]。目前一些研究表明鉛暴露能夠誘導斑馬魚仔魚神經行為變化，可能的機制包括中樞神經系統(tǒng)基因表達的改變、運動神經元的損傷以及氧化損傷的增加等[35-38]。

4 阻燃劑脅迫對斑馬魚的神經毒性效應

阻燃劑是用于改善材料燃燒性能的化學物質制劑。其阻燃效果通過吸熱作用、遮蓋作用等來實現，并廣泛用于處理各種裝飾材料。根據阻燃元素可以把阻燃劑分為：磷系阻燃劑、鹵系阻燃劑等，本篇抽取了磷系阻燃劑中磷酸酯類阻燃劑磷酸三苯酯和鹵系阻燃劑中有機氯化物阻燃劑得克隆兩種典型的阻燃劑進行概述。

4.1 磷酸三苯酯

磷酸三苯酯(Triphenyl phos phate，TPP)是一種用于印刷、電子和制造業(yè)的有機酯類阻燃劑。有機磷酸酯類阻燃劑因在結構上與有神經毒性的有機磷殺蟲劑類似，所以TPP是否具有神經毒性也被大眾關注[39]。

彭濤等人研究表明：暴露于高濃度的TPP導致神經系統(tǒng)相關基因gap43和α1-tublin轉錄水平降低，這兩個基因轉錄水平變化提示神經元的發(fā)育受到干擾，所以這也能說明TPP可以改變參與神經發(fā)育的基因的轉錄[40]。同時，TPP暴露也可以影響斑馬魚幼魚的游泳行為，而這種行為的變化則很可能是由于神經發(fā)育相關基因轉錄水平以及乙酰膽堿酯酶的變化所導致的。

4.2 得克隆

得克隆(Dechlorane plus，DP)是一種脂肪族氯系阻燃劑，廣泛用于塑料、用于傳輸電的電纜電線和電腦里連接器等產品[41]。

陳香平等通過探討DP的急性暴露對斑馬魚胚胎的神經毒性作用得出了DP會抑制初級神經元軸突的生長，加快尾部細胞凋亡[33]。此外，DP可以干擾斑馬魚的甲狀腺激素水平，影響和改變泥鰍乙酰膽堿酯酶活性。甲狀腺激素和乙酰膽堿酯酶都與神經系統(tǒng)發(fā)育和神經遞質傳遞密切相關，這提示DP對斑馬魚具有潛在的神經毒性作用，但其作用機制目前并不清楚[42-44]。，

5 展望

斑馬魚在生態(tài)毒理學研究中具有非常高的應用價值，是水生生態(tài)毒理學新興領域具有前景的受試生物之一。目前，學者們對于斑馬魚開展了上述神經毒性研究，取得了顯著成效，但目前仍存在一些問題：(1)受體活性恢復現象發(fā)生在神經抑制類農藥的影響研究中，這可能與農藥的毒性機制和斑馬魚對農藥環(huán)境的適應有關。膽堿能系統(tǒng)是一個復雜的系統(tǒng)，各組分相互協(xié)調相互作用，就單從兩種受體的實驗并不能排除膽堿能系統(tǒng)中的其他因素的作用。此外，關于手性農藥的研究中，雖然證實了其對斑馬魚神經毒性的選擇對應性，但并不能很好的解釋為何會有這種差異的出現，這種手性選擇性差異是否與細胞膜上的離子通道的作用以及化合物與細胞大分子的作用有關，目前還不能確定。未來開展農藥污染物對斑馬魚的神經毒理效應的研究可以從離子通道和農藥化合物在斑馬魚體內的轉運機制以及膽堿能系統(tǒng)的整體性來進行。(2)臨床藥物對斑馬魚神經毒性的影響主要表現在細胞凋亡、神經元的數量變化等方面。值得關注的是有些藥物對斑馬魚的毒性影響經過拯救實驗是會有緩解的，如何抑制其有害特性同時維持藥物原有的功能是治療藥物毒理學研究的一個重要方向。(3)金屬污染物主要是透過血腦屏障對機體起毒害作用，但其具體的透過方式及機制在國內并未有比較明確的研究；此外，重金屬混合暴露毒性具有協(xié)同效應，因此即使少量的暴露仍具有強烈的毒性作用，至于其混合造成的影響是否改變了其單一暴露的毒性尚未明確，這也是未來開展重金屬污染物對斑馬魚的神經毒理效應研究提供了方向。目前相關的研究均停留在基因水平上，缺少蛋白水平的驗證，后期可以對確切的蛋白作用機制進行進一步的深入研究。(4)對于TPP是否因具有和有機磷殺蟲劑相似的結構而具有神經毒性，目前還存在爭議；已確認DP可干擾斑馬魚甲狀腺激素水平，開展阻燃劑類污染物對斑馬魚的神經毒理效應可以從內分泌干擾作用方面進行。

綜上所述，未來環(huán)境污染物對斑馬魚神經毒性的研究可以在以下三個方面做進一步探索：(1)加強神經毒性效應相關的基因分析，更多地在蛋白質組學和基因組學了解斑馬魚機體功能的應激機制。(2)污染物對蛋白質及酶等生物大分子的毒性作用機理。(3)信號通路和離子通道調控作用。