張瑞萍，劉紅凌

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)作為糖尿病患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致后天失明的主要因素，嚴(yán)重威脅患者生存質(zhì)量[1]。研究表明[2]，視網(wǎng)膜血管新生是DR發(fā)病的重要機(jī)制。而高糖血癥引起的慢性缺氧是導(dǎo)致DR的始發(fā)原因[3]。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是缺氧環(huán)境下調(diào)控機(jī)體機(jī)能的重要調(diào)節(jié)因子，包括α和β兩個(gè)亞基，其中，HIF-1α是主要的功能亞基，在缺氧環(huán)境中可穩(wěn)定表達(dá)，與靶基因結(jié)合而產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)[4]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[5]，HIF-1α在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中呈高表達(dá)，且與糖尿病病程有關(guān)。但HIF-1α是否參與了DR發(fā)病，以及在DR發(fā)病過(guò)程的作用鮮有報(bào)道。本研究擬采用小分子RNA干擾技術(shù)特異性沉默HIF-1α基因，觀察其對(duì)DR小鼠視網(wǎng)膜血管新生及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響，并探討可能的機(jī)制，以期為DR臨床防治提供基礎(chǔ)資料。

1材料和方法

1.1材料鏈脲佐菌素購(gòu)自上海然泰生物科技有限公司，焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司，葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司，Trizol總RNA提取試劑盒、LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、核因子-κB(NF-κB)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，siRNA-HIF-1α、siRNA-NC均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自上海研晶生物公司，山羊抗小鼠CD34單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物公司，兔抗鼠HIF-1α多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，兔抗小鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)多克隆抗體購(gòu)自上海滬峰化工公司，兔抗小鼠血管性血友病因子(vWF)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠40只購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2010-1-0003]，12周齡，體質(zhì)量28±2g，利用隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、糖尿病組、siRNA-HIF-1α組、siRNA-NC組，每組10只。糖尿病模型構(gòu)建：小鼠禁食10h，將鏈脲佐菌素按小鼠體質(zhì)量60mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射5d，第7d時(shí)取尾靜脈血檢測(cè)血糖，以血糖>11.1mmol/L作為成功建模標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于建模不成功的，補(bǔ)充小鼠，保證每組10只。正常組給予等量的檸檬酸緩沖液，連續(xù)注射5d。

1.2.2靶向HIF-1α的siRNA設(shè)計(jì)和合成利用GenBank基因庫(kù)得到HIF-1α基因序列(AF207206)，選取最有效的HIF-1α-siRNA基因序列：5’-GAAACTCTTCCAAGCAATTTT-3’，以及非靶向性siRNA作為對(duì)照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3’。將siRNA溶解于經(jīng)DEPC處理的生理鹽水中，調(diào)整濃度為15μmol/L。

1.2.3各組小鼠轉(zhuǎn)染處理建模4wk后，將4組小鼠腹腔注射麻醉后，用碘伏于眼周消毒，在顯微鏡觀察下，于各只大鼠雙眼，利用Hamilton微量注射器在角膜緣外1mm處進(jìn)針，沿視神經(jīng)方向直至瞳孔區(qū)，siRNA-HIF-1α組：將含HIF-1α-siRNA基因序列和轉(zhuǎn)染試劑的混合液注入玻璃體腔；siRNA-NC組：將含siRNA對(duì)照序列和轉(zhuǎn)染試劑的混合液注入玻璃體腔；正常組：將等量磷酸鹽緩沖液(PBS)注入玻璃體腔；糖尿病組：將等量PBS注入玻璃體腔。每14d重復(fù)注射1次，連續(xù)注射4次。

表1 基因序列

基因序列HIF-1α上游:5-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3下游:5-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3VEGF上游:5-AGGCGAGGCAGCTTGAGTTA-3下游:5-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3NF-κB上游:5-GCTCCTAAGGTGCTGACA-3下游:5-ACCTCCGAAAGCGAGATA-3IL-1上游:5-ACCTGGGCTGTCCTGATGAGAG-3下游:5-TGTTGATGTGCTGCTGCGAGAT-3IL-6上游:5-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3下游:5-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3TNF-α上游:5-TGGAACTGGCAGAAGAGGCACT-3下游:5-AGAGGCTGAGACATAGGCACCG-3β-actin上游:5-CCTAGGCACCAGGGTGTGAT-3下游:5-TTGGTGACAATGCCGTGTTC-3

1.2.4視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察各組小鼠于建模12wk后，處死摘取左眼球(每組10只左眼)，將角膜緣環(huán)形剪開(kāi)，甲醛固定24h，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約4μm，行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察各組視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)切片常規(guī)脫蠟后，用檸檬酸進(jìn)行高溫下組織抗原修復(fù)，加入H2O2，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將正常山羊血清加入，37℃孵育60min，加入山羊抗小鼠CD34單克隆抗體，37℃孵育60min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)參考文獻(xiàn)[6]：于低倍鏡下尋找新生血管密集區(qū)，換用高倍鏡分別選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)，取均值作為MVD，標(biāo)準(zhǔn)為任何被染成棕褐色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇記為1個(gè)MVD，對(duì)于組織結(jié)構(gòu)不相連的分支結(jié)構(gòu)亦作為1個(gè)MVD，但排除肌層較厚或管腔直徑超過(guò)8個(gè)紅細(xì)胞的血管。每張切片均由兩位病理科副主任醫(yī)師單獨(dú)閱片，MVD計(jì)數(shù)差值超過(guò)10%則重新閱片。

1.2.6利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)取各組小鼠右眼視網(wǎng)膜組織(每組10只右眼)，剪碎后，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度進(jìn)行檢查，以A260/A280≥1.80作為合格樣品。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。各引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 1min，92℃ 30s，92℃ 30s，58℃ 30s，73℃ 30s，連續(xù)進(jìn)行38次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法對(duì)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白表達(dá)取各組小鼠右眼視網(wǎng)膜組織(每組10只右眼)，剪碎后，加入細(xì)胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒獲得總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。取25μg總蛋白，行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2h，分別將一兔抗鼠HIF-1α多克隆抗體、兔抗小鼠ET-1多克隆抗體、兔抗小鼠vWF單克隆抗體加入(稀釋比1∶1200、1∶800、1∶1000)，4℃過(guò)夜孵育，TBST漂洗3次，將二抗加入，室溫下孵育2h，TBST漂洗3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒避光反應(yīng)25min。拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

圖1各組小鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)A：正常組；B：糖尿病組；C：siRNA-NC組；D：siRNA-HIF-1α組。

圖2各組小鼠視網(wǎng)膜組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)(免疫組化染色×400)A：正常組；B糖尿病組；C：siRNA-NC組；D：siRNA-HIF-1α組。黑色箭頭示CD34表達(dá)陽(yáng)性。

2結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況糖尿病組、siRNA-HIF-1α組和siRNA-NC組小鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素，7d時(shí)檢測(cè)血糖，血糖值均>11.1mmol/L，成功率100%。建模12wk后，處死前再次檢測(cè)體質(zhì)量和血糖，糖尿病組、siRNA-NC組和siRNA-HIF-1α組大鼠的體質(zhì)量均低于正常組，而血糖水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2各組小鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠視網(wǎng)膜中各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚、排列規(guī)整、形態(tài)正常(圖1A)，糖尿病組和siRNA-NC組小鼠視網(wǎng)膜中各層細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹、視網(wǎng)膜組織水腫(圖1B、C)；siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜中各層細(xì)胞排列趨于規(guī)則，細(xì)胞核腫脹減輕(圖1D)。

2.3各組小鼠視網(wǎng)膜組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2A)；糖尿病組和siRNA-NC組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(圖2B、C)；siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)細(xì)胞數(shù)較糖尿病組和siRNA-NC組減少(圖2D)。

正常組、糖尿病組、siRNA-NC組和siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中MVD分別為6.8±1.3、19.7±2.2、20.4±2.6和12.8±1.9個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.952，P<0.01)，兩兩比較，糖尿病組和siRNA-NC組均高于正常組，而siRNA-HIF-1α組均低于糖尿病組和siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs糖尿病組；eP<0.05vssiRNA-NC組。

組別n體質(zhì)量(g)血糖(mmol/L)正常組1030.91±2.544.55±0.32糖尿病組1023.24±3.02a24.67±2.34asiRNA-NC組1023.51±3.42a24.31±2.17asiRNA-HIF-1α組1023.12±2.83a25.14±2.63a F17.146197.464P<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常組。

2.4各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)比較與正常組相比，糖尿病組、siRNA-NC組和siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與糖尿病組和siRNA-NC組相比，siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

2.5各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白表達(dá)比較與正常組相比，糖尿病組、siRNA-NC組和siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與糖尿病組和siRNA-NC組相比，siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4，圖4。

組別nHIF-1αVEGFNF-κBIL-1IL-6TNF-α正常組101.08±0.091.16±0.131.12±0.081.05±0.101.08±0.071.16±0.09糖尿病組101.86±0.11a2.27±0.16a1.95±0.13a1.78±0.11a1.73±0.14a1.89±0.13asiRNA-NC組101.89±0.15a2.24±0.14a1.97±0.14a1.76±0.08a1.71±0.11a1.91±0.15asiRNA-HIF-1α組101.25±0.12a,c,e1.71±0.11a,c,e1.68±0.12a,c,e1.53±0.13a,c,e1.47±0.10a,c,e1.55±0.12a,c,e F127.624114.32949.037112.17393.47079.985P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs糖尿病組；eP<0.05vssiRNA-NC組。

組別nHIF-1α蛋白ET-1蛋白vWF蛋白正常組100.21±0.060.17±0.050.13±0.03糖尿病組100.68±0.09a0.61±0.08a0.54±0.06asiRNA-NC組100.71±0.12a0.59±0.07a0.55±0.08asiRNA-HIF-1α組100.49±0.08a,c,e0.38±0.06a,c,e0.34±0.05a,c,eF50.24671.690133.307P<0.01<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs糖尿病組；eP<0.05vssiRNA-NC組。

圖4各組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ET-1、vWF蛋白表達(dá)。

3討論

DR作為糖尿病患者常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且發(fā)病率高、致盲率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。研究表明[6]，長(zhǎng)期高糖狀態(tài)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能異常及微循環(huán)障礙在DR發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。本研究參考文獻(xiàn)[7]的方法，利用腹腔注射鏈脲佐菌素制備小鼠糖尿病模型，7d時(shí)血糖值均>11.1mmol/L，出現(xiàn)了“多飲多食、體質(zhì)量減輕”的癥狀，提示成功構(gòu)建了小鼠糖尿病模型，建模12wk后，HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜中各層細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹、視網(wǎng)膜組織水腫，提示高糖導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜發(fā)生病理性改變。免疫組化染色結(jié)果顯示，糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34陽(yáng)性表達(dá)數(shù)增加，MVD計(jì)數(shù)增加，而CD34是新生小血管特異性分化抗原[8]，提示血管新生參與了糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變。

研究表明[9]，糖尿病所致機(jī)體高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜供血不足而處于相對(duì)缺氧狀態(tài)。HIF-1α作為機(jī)體重要的氧含量感受器及調(diào)控蛋白，在調(diào)節(jié)血管新生、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]，本研究利用siRNA技術(shù)特異性將HIF-1α沉默，并注入玻璃體腔，PCR和Western blot結(jié)果均顯示，siRNA-HIF-1α組視網(wǎng)膜組織中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)降低，提示視網(wǎng)膜組織中HIF-1α基因被沉默。本研究顯示，siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜中各層細(xì)胞排列趨于規(guī)則，細(xì)胞核腫脹減輕，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)細(xì)胞數(shù)和MVD計(jì)數(shù)均較糖尿病組和siRNA-NC組減少，說(shuō)明特異性沉默HIF-1α基因可減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變以及微血管新生。VEGF作為促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵性因子，在調(diào)控血管新生中發(fā)揮主導(dǎo)作用[11]，同時(shí)，VEGF是HIF-1α信號(hào)通路下游重要的靶基因[12]，本研究顯示，糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，而siRNA-HIF-1α組均被抑制，說(shuō)明特異性抑制HIF-1α基因可能通過(guò)抑制VEGF而減少糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管新生。

有研究指出[13]，機(jī)體高糖狀態(tài)可導(dǎo)致大量炎癥因子釋放而引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷[14]。ET-1作為血管收縮因子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，與一氧化氮形成動(dòng)態(tài)平衡而維持和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能[15]，有研究指出[16]，HIF-1可直接激活ET-1表達(dá)。vWF作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷因子，與內(nèi)皮損傷程度呈正相關(guān)[17]，是血管內(nèi)皮受損的標(biāo)志物之一。本研究顯示，糖尿病組小鼠NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，且ET-1、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，說(shuō)明糖尿病小鼠機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮功能損傷，本研究顯示，siRNA-HIF-1α組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，ET-1、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說(shuō)明特異性沉默HIF-1α基因可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)而減少視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能損傷。

綜上所述，特異性沉默HIF-1α基因可保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜，其機(jī)制可能通過(guò)減少VEGF表達(dá)抑制血管新生，以及減少炎癥反應(yīng)減輕血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，有望成為DR基因治療的新靶位。本研究后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)HIF-1α作用靶點(diǎn)及具體的分子機(jī)制開(kāi)展研究，以明確其在抗炎、減少血管內(nèi)皮損傷中的相關(guān)機(jī)制。