李昊文 王雅杰 沈宓 李子瑞 曹敬麗 隋濱濱 高培毅

[摘要]目的 研究PR OCR基因多態(tài)性位點(diǎn)n;867186與中國人群缺血性腦卒中患者頸動(dòng)脈斑塊纖維帽厚薄及完整性的關(guān)系。方法前瞻性納入本院收治的缺血性腦卒中患者，采集人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料及腦卒中風(fēng)險(xiǎn)因素等臨床信息，頸動(dòng)脈高分辨磁共振（MRI）判斷頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚薄，依據(jù)纖維帽厚度及完整程度對納入患者進(jìn)行分組。利用Real-dme PCR方法，使用TaqMan探針對厚/完整型纖維帽組及薄/破損型纖維帽組患者PROM基因多態(tài)性位點(diǎn)rs867186進(jìn)行基因分型。結(jié)果 本研究共納入176例缺血性腦卒中患者，其中95例頸動(dòng)脈斑塊具有厚/完整型纖維帽，81例具有薄/破損型纖維帽。對兩組患者PROM基因n867186位點(diǎn)多態(tài)性分析顯示，等位基因A是形成薄/破損型纖維帽斑塊的風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=2.89，95% CI：1.03～8.06，P=0.04），其基因頻率在厚/完整型纖維帽組和薄/破損型纖維帽組中分別為91.58%和96.91%。結(jié)論P(yáng)ROM基因多態(tài)性位點(diǎn)rs867186與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄/破損相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]PROM;單核苷酸多態(tài)性;缺血性腦卒中;動(dòng)脈粥樣硬化;斑塊;纖維帽

中圖分類號：R543.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-816X（2019）05-0394-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.002

在中國，腦卒中發(fā)病率呈逐年上升趨勢。腦卒中由于其高發(fā)病率和高致死率，已成為世界各國共同面臨的公共健康問題[1]。動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破損引發(fā)的血栓栓塞是缺血性腦卒中主要的致病因素[2]。及時(shí)識別易損斑塊患者并進(jìn)行干預(yù)治療對于預(yù)防缺血性腦卒中有重要意義。診斷易損斑塊的主要標(biāo)準(zhǔn)包括：活動(dòng)性炎癥、薄纖維帽及大的脂質(zhì)核心、內(nèi)皮剝脫伴表面血小板聚集、斑塊有裂隙或損傷、嚴(yán)重狹窄[3，4]。其中纖維帽的厚薄及完整性是形態(tài)學(xué)上判斷易損斑塊的主要標(biāo)志之一，薄或破損的纖維帽提示該斑塊可能為易損斑塊。單核苷酸多態(tài)性（single nu-cleotide ploymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）顯示，動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等復(fù)雜疾病與許多基因的SNP相關(guān)[5，6]?；虻牟煌鄳B(tài)性不僅影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，還可能與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性相關(guān)。2017年，研究人員通過基因芯片及meta分析，發(fā)現(xiàn)蛋白C受體（endothelial protein C re-ceptor，PROCR）基因SNP位點(diǎn)rs867186可能與動(dòng)脈粥樣硬化及主動(dòng)脈疾病相關(guān)[7]，但該多態(tài)性位點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性及斑塊纖維帽完整性的研究未見報(bào)道。

本研究通過對176例缺血性腦卒中患者進(jìn)行頸動(dòng)脈高分辨率磁共振成像（MRI）檢查，判斷其頸動(dòng)脈斑塊纖維帽厚薄及完整性，并對PROM基因SNP位點(diǎn)rS867186進(jìn)行基因分型，探討PROCR基因多態(tài)性與中國人群缺血性腦卒中患者頸動(dòng)脈MRI影像的纖維帽變薄或破損的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：前瞻性納入2014年5月至2017年10月期間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院收治的缺血性腦卒中患者176例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床診斷為前循環(huán)、非心源性的缺血性腦卒中，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8];（2）年齡40～85歲;（3）腦卒中發(fā)病后6個(gè)月內(nèi)入院;（4）患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有MRI檢查禁忌證;（2）對釓對比劑過敏;（3）心源性腦卒中或動(dòng)脈炎等其他病因?qū)е碌娜毖X卒中病變;（4）既往行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)或支架置入術(shù);（5）既往行頸部放療;（6）既往肝腎病史及行肝移植患者。研究方案經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號為KY2014-004-04。

1.2 方法：收集研究對象基本臨床資料，包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息（性別、年齡）、身高、體重、收縮壓、舒張壓、腦卒中危險(xiǎn)因素[高血壓、糖尿病、高脂血癥、既往短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）或腦卒中史、吸煙史、腦卒中家族史、心肌梗死家族史]、基本實(shí)驗(yàn)室檢查[甘油三酷（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（GHb）]等。使用Trio Tim 3.0T超導(dǎo)MR設(shè)備（Siemens Medical Systems，德國）對納入患者進(jìn)行頸動(dòng)脈高分辨率MRI檢查。依據(jù)頸動(dòng)脈高分辨率MRI結(jié)果，按照斑塊纖維帽性質(zhì)，將患者分為厚/完整型纖維帽組95例和薄/破損型纖維帽組81例。

1.3 基因型分析：抽取患者外周血2mL，使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）提取DNA，方法見試劑盒操作說明書。利用TaqMan探針方法對PROCR基因SNP位點(diǎn)rs867186進(jìn)行基因分型。反應(yīng)體系：DNA模板20ng，TaqMan SNP GenotypingAssays Thermo Fisher，美國，Assay ID：C-25620145-10）0.25μL，2×TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fish-er）5μL，補(bǔ)水至10μL。7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美國）儀器進(jìn)行基因型檢測，反應(yīng)條件如下：95℃ 10min預(yù)變性;95℃15s，60℃ 1min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 17.0版對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Shapiro-Wilk方法對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（IQR）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ²檢驗(yàn)。基因型與Hardy-Weinberg平衡符合程度、組間基因型及等位基因頻率差異比較使用χ²檢驗(yàn)?；蛐团c纖維帽變薄/破損相關(guān)性用比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征：其中男131例，女45例，平均年齡（59.69±8.73）歲。兩組患者基本臨床信息比較，見表1。

2.2 PROM基因多態(tài)性位點(diǎn)rs867186與纖維帽完整性相關(guān)：經(jīng)過χ²檢驗(yàn)厚/完整型纖維帽組和薄/破損型纖維帽組的兩組患者中，rs867186位點(diǎn)的基因頻率和基因型分布比例均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。對PROCR基因rs867186位點(diǎn)的多態(tài)性分析顯示：在95例厚/完整型纖維帽組患者中，存在A/A，A/G、G/G三種基因型，在81例薄/破損型纖維帽組患者中只有A/A、A/G兩種基因型存在。A/A基因型在薄/破損型纖維帽組患者中分布比例更高，G/G基因型僅在厚/完整型纖維帽組患者中有分布。等位基因A是纖維帽變薄或破損的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，其基因頻率在薄/破損型纖維帽組中為96.91%，在厚/完整型纖維帽組為91.58%。風(fēng)險(xiǎn)等位基因OR值為2.89（95%CI=1.03～8.06，P=0.04），見表2。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（endothelial protein C recep-tor，EPCR）由PROCR基因編碼，參與激活蛋自C系統(tǒng)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)、抗炎、抗凝等作用[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PROM基因多態(tài)性與血栓性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等疾病有關(guān)[10～12]。PROCR SNP位點(diǎn)rs867186 A/G改變會(huì)引起EPCR跨膜區(qū)域第219位絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾被幔⊿er219Gly）[13]，導(dǎo)致表皮生長因子受體（opitelial growth factor receptor，EGFR）結(jié)構(gòu)改變，更易被蛋白酶水解而從內(nèi)皮細(xì)胞膜上脫落，從而使活化的凝血因子Ⅴ和Ⅷ（FⅤ a和FⅧa）增加，凝血酶生成增多，靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加[14，15]。另有研究報(bào)道，rs867186等位基因A/G的轉(zhuǎn)變對冠心病有保護(hù)作用（OR=0.93，95%CI=0.91～0.96）[7]，但其作用機(jī)制尚不明確。

斑塊纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（包含膠原纖維和彈性蛋白等）組成，其中細(xì)胞外基質(zhì)在纖維帽中的含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，其合成與降解受多種因子調(diào)節(jié)[16]。細(xì)胞外基質(zhì)主要由血管平滑肌細(xì)胞合成與分泌，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、自細(xì)胞介素（IL-s）、干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子可以誘導(dǎo)局部平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，平滑肌細(xì)胞的數(shù)量減少和功能減弱會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，纖維帽的膠原修復(fù)障礙[17]。此外，巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、膠原酶和彈性蛋自酶等可以降解細(xì)胞外基質(zhì)[18]。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)合成減少、降解增加時(shí)，纖維帽厚度變薄、強(qiáng)度減弱，更易破裂。

本研究通過對具有厚/完整型纖維帽和薄/破損型纖維帽的兩組缺血性腦卒中患者進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)PROM基因rs867186位點(diǎn)A/A基因型在薄/破損型纖維帽組患者中分布比例更高，G/G基因型在厚/完整型纖維帽組患者中分布比例更高。等位基因A是斑塊纖維帽變薄或破損的風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究揭示PROM基因SNP位點(diǎn)rs867186與中國人群缺血性腦卒中患者頸動(dòng)脈斑塊纖維帽完整性相關(guān)，但該多態(tài)性影響纖維帽完整性的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。我們推測PROCR基因多態(tài)性導(dǎo)致EGFR結(jié)構(gòu)改變，可能導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的含量或活性變化，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解平衡，最終引起纖維帽完整性變化。本研究為尋找新的斑塊纖維帽完整性預(yù)測指標(biāo)提供思路，對于指導(dǎo)臨床治療及腦卒中預(yù)防具有一定意義。后續(xù)研究可集中在PRO-CR基因rs867186位點(diǎn)多態(tài)性變化，對細(xì)胞因子水平、血管平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的影響，揭示rs867186SNP位點(diǎn)影響纖維帽完整性的可能的分子機(jī)制。

本研究的局限性在于納入患者量較小，尚需要長期收集樣本，進(jìn)一步擴(kuò)大研究規(guī)模來證實(shí)PROCR基因多態(tài)性與斑塊纖維帽厚薄的相關(guān)性。另外，由于動(dòng)脈粥樣硬化是全身性的復(fù)雜疾病，患者腦血管、冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈等血管中也可能存在斑塊，本研究未對這些血管中的斑塊狀態(tài)進(jìn)行評價(jià)，因此PROCR基因多態(tài)性與其他部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽完整性的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhou M，Wang H，Zhu J，et al.Cause-specific mortality for 240 causes inChina during 1990-2013：a systematic subnational analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2013[J].Lancet，2016，387（10015）：251-272.

[2]Spacek M，Zemanek D，Hutyra M，et al.Vulnerable atheroscleroticplaque-a review of current concepts and advanced imagine J].Biomed PapMel Far Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2018，162（1）：10-17.

[3]Sun R，Wang L，Guan C，et al.Carotid atherosclerotic plaque features inpatients with acute ischemic stroke[J].World Neurosurg，2018，112：e223-e228.

[4]Naghavi M，Libby P，F(xiàn)alk h：，et al.From vulnerable plaque to vulnerablepatient：a call for new definitions and risk assessment strategies[J]：Part1.Circulation，2003，108（14）：1664-1672.

[5]McPherson R，Tybjaerg-Hansen A.Genetics of coronary artery disease J].Circ Res，2016，118（4）：564-578.

[6]van der Hay，-，t P，Verweil N.Identification of 64 novel genetic loci providesan expanded view on the genetic architecture of coronary artery disease J].Circ Res，2018，122（3）：433-443.

[7]Howson JMM，Zhao W，Barnes DR，et al.Fifteen new risk loci for coro-nary artery disease highlight arterial-wall-specific mechanisms[J].NatGenet，2017，49（7）：1113-1119.

[8]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì).中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志，2015 ，48（4）：246-257.

[9]Pendurthi UR，Rao LVM.Endothelial cell protein Creceptor-dependentsignaling[J].Curr Opin Hematol，2018，250）：219-226.

[10]Wojtukiewiez MZ，Hempel D，Sierko E，et al.Endothelial protein Cre-ceptor（EPCR），protease activated receptor-1（PAR-1）and their interplayin cancer growth and metastatic dissemination[J].Cancers（Basel），2019，11（1）：pH：E51.

[11]Cole JW，Xu H，Ryan K，et al.Genetics of the thrombomodulin-en-dothelial cell protein C receptor system and the risk of early-onset ischemicstroke[J].PLoS One，2018，13（11）：e0206554.

[12]Anastasou G，POlltou M，Rallidis L，et al.Endothelial protein C recep-tor gene variants and risk of thrombosis[J].Clin Appl Thromb Hemost，2016，22（2）：199-204.

[13]van Zyl N，Milford EM，Dial）S，et al.Activation of the protein C path-way and endothelial glycocalyx shedding is associated with coagulopathy inan ovine model of trauma and hemorrhage[J].J Trauma Acute Care Surg，2016，81（4）：674-684.

[14]Wildhagen KC，Lutgens E，Loubele ST，et al.The structure-function re-lationship of activated protein C.Lessons from natural and engineered mu-tations[J].Thromb Haemost，2011，106（6）：1034-1045.

[15]Dennis J，Johnson CY，Adediran AS，et al.The endothelial protein C re-ceptor（PROCR）Ser219Gly variant and risk of common thrombotic disor-ders：a HUGE review and meta-analysis of evidence from observationalstudies[J].Blood，2012，119（10）：2392-2400.

[16]Sakakura K，Nakano M，Otsuka F，et al.Pathophysiology of atheroscle-rosis plaque progression J].Heart Lung Circ，2013，22（6）：399-411.

[17]Bennett MR，Sinha S，Owens GK.Vascular smooth muscle cells inatherosclerosis[J].Circ Res，2016，118（4）：692-702.

[18]Lin J，Kakkar V，LU X.Impact of matrix metalloproteinases onatherosclerosis[J].Curr Drug Targets，2014，15（4）：442-453.

（收稿日期：2019-5-9）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金國際合作交流項(xiàng)目（編號：81361120402）;國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：81572474）

作者單位：1.100070 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心;2.100015首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.100070 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)放射科;4.100070 北京市神經(jīng)外科研究所

作者簡介：李昊文（1983-），博士，副研究員

通訊作者：高培毅，博士，主任醫(yī)師，E-mail：cjr.gaopeiyi@vip.163.com