何平 劉家豐 寧瑞卓 鄒曉微 申龍健 范文慧

[摘要]目的 分析血漿長鏈非編碼RNA INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，AN-RIL）聯(lián)合脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）及血漿淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）在缺血性腦卒中（ischemic stroke，LS）的診斷、預(yù)后價值。方法分別收集我院IS患者和健康人群各140例作為觀察組和對照組。血漿ANRIL采用實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測;Lp-PLA2與SAA分別采用酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光法檢測。結(jié)果觀察組血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平均顯著高于對照組（P<0.05）。LS患者血漿4NRIL，Lp-PLA2與SAA水平與NIHSS評分顯著相關(guān)（r=0.57，P<0.05;r=0.55，P<0.05;r=0.54，P<0.05）。ANRIL聯(lián)合Lp-PLA2與SAA在區(qū)分IS與健康對照者的曲線下面積為0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05），靈敏度82.71%，特異度98.42%。在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等影響因素后，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發(fā)病的獨立危險因素。Kaplan Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，相比低ANRIL組，高ANRIL組生存時間顯著降低（χ²=17.66，P<0.05）;相比低Lp-PLA2組，高Lp-PLA2組生存時間顯著降低（χ²=8.94，P<0.05）;相比低SAA組，高SAA組生存時間顯著降低（χ²=4.53，P<0.05）。結(jié)論 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA是IS診斷及預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]缺血性腦卒中;長鏈非編碼RNA;脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2;血漿淀粉樣蛋白A

中圖分類號：R743 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-816X（2019）05-0397-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.003

腦卒中是一種因突發(fā)性腦血管發(fā)生阻塞或破損導(dǎo)致大腦供血不足/失去供血而使腦組織缺氧受損的疾病，其中，又以缺血性腦卒中（ischermc stroke，IS）最為常見[1]。炎癥反應(yīng)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，進(jìn)而加快粥樣斑塊在損傷的內(nèi)皮細(xì)胞表面沉積，加速IS的形成[2]。因此，炎癥指標(biāo)升高被認(rèn)為是IS形成的一個重要誘因[3]。研究指出，長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，lnCRNA）INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）水平在經(jīng)缺氧或高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，被認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要分子[4]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholi-pase A2，Lp-PLA2）是一類重要的血管炎癥標(biāo)志物，其水平增高被認(rèn)為是誘發(fā)心血管疾病的高危因素[5]。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）屬于急性相反應(yīng)蛋白，對于評估體內(nèi)炎癥程度有一定價值[6]。本研究通過比較IS患者與健康體檢者血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平，旨在探究三者在IS診斷及預(yù)后評估中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集本院2017年1月到2018年1月期間經(jīng)CT或MRI確診IS的患者140例為觀察組，其中男93例，女47例，年齡48～66歲，平均（58.31±5.81）歲，并計算國立衛(wèi)生院卒中量表（national insti-tutes of health stroke scale，NIHSS）評分[7]。同期納入我院健康體檢者140例為對照組，其中男95例，女45例，年齡49～67歲，平均（60.11±6.32）歲。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。樣本例數(shù)計算的統(tǒng)計學(xué)依據(jù)為：n=2&μ_α+μ_β）2γ²/δ²，其中μ_α為一類錯誤概率μ的值，本次研究規(guī)定α=0.05，查表得μ_α為1.96;μ_β為二類錯誤概率μ的值，本次研究規(guī)定β=0.20，查表得μ_β為0.84;γ²為總體方差，查表得γ（0.05，0.20）²為12.65;δ為觀察組與對照組的患病率之差，因人群中IS發(fā)病率約為15%，故δ值約為0.85。最終計算得到的病例標(biāo)本量至少應(yīng)為127例。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法：收集研究對象吸煙史、飲酒史、高血壓（收縮壓/舒張壓大于140/90mmHg或高血壓病史或正在服用降壓藥者）、糖尿?。崭寡谴笥?26mg/dL或糖尿病史或正在服用降血糖藥物）、高膽固醇血癥（正在服用降脂藥物）等資料。此外，對納入的140例IS患者進(jìn)行3個月的隨訪。采用乙二胺四乙酸抗凝紫管采集觀察組入院2h后及對照組外周靜脈血2mL，并于1h內(nèi)分離血漿。血漿SAA的檢測采用化學(xué)發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組血漿Lp-PLA2水平，檢測試劑盒購自北京金山川科技發(fā)展有限公司。按照血漿RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測。反應(yīng)采用20[L體系，即：SYBR GREEN Mix 8μL，上下游引物各0.80μL，cDNA4μL，去除RNA酶水6.40μL。循環(huán)條件：95℃變性5min;95℃30s，58℃30s，72℃ 30s，38個循環(huán)。使用的ANRIL與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列見表1。采用2^-△Ct法計算ANRIL的相對表達(dá)量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 19.0版軟件分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用斯皮爾曼檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）計算ANRIL、Lp-PLA2與SAA對IS的鑒別價值。采用二元Logistic回歸計算三者預(yù)測is風(fēng)險的比值比（odds ra-tio，OR）。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料及血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平比較：與對照組相比，觀察組血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平顯著升高（P<0.05），見表2。

2.2 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平與IS臨床特征間的相關(guān)性：血漿ANRIL、Lp-PLA2及SAA水平與IS患者NIHSS呈線性關(guān)聯(lián)，見表3。

2.3 ROC曲線分析：血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA區(qū)分IS患者與健康對照者的曲線下面積分別為0.91（95%CI：0.88～0.99，P<0.05）、0.88（95%CI：0.83～0.95，P<0.05）和0.67（95%CI：0.59～0.78，P<0.05）;靈敏度及特異度分別為81.21%/83.72%、77.10%/81.42%和70.11%/57.93%;截斷值分別為17.32（-log）、220.83μg/L和28.22mg/L（圖1A）。聯(lián)合血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA時，3種指標(biāo)在區(qū)分IS患者與健康對照者的曲線下面積為0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05，圖1B），靈敏度82.71%，特異度98.42%。

2.4 ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平對IS發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測價值：單因素分析結(jié)果顯示，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發(fā)病的危險因素。多因素分析顯示，在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等因素影響后，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發(fā)病的獨立危險因素。見表4。

2.5 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平對LS患者的生存分析：140例IS患者中死亡28例。依據(jù)ANRIL、Lp-PLA2與SAA中位數(shù)分別分為各高、低水平組。高ANRIL組患者的生存時間較低ANRIL組顯著降低（χ²=17.66，P<0.05，圖2A）;高環(huán)-PLA2組患者的生存時間較低Lp-PLA2組顯著降低（χ²=8.94，P<0.05，圖2B）;高SAA組患者的生存時間較低SAA組顯著降低（χ²=4.53，P<0.05，圖2C）。

3 討論

隨著1ncRNAs參與IS機制研究逐漸深入，1ncR-NA通過炎癥反應(yīng)通路在IS進(jìn)程中的作用有了越來越深入的了解。本研究探討了ANRIL在IS中的臨床價值，發(fā)現(xiàn)IS患者血漿ANRIL水平明顯高于健康對照，且與NIHSS評分相關(guān)。近年來，越來越多的證據(jù)表明ANRIL和心血管疾病如心肌梗死、糖尿病視網(wǎng)膜病變等關(guān)系密切[8，9]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL參與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生，而在敲除ANRIL后可以顯著降低多種促炎癥因子的表達(dá)[8]。Schulz等[9]發(fā)現(xiàn)ANRIL表達(dá)水平的增高可以促進(jìn)微血管滲漏和炎癥反應(yīng)等的發(fā)生，而降低ANRIL的表達(dá)可提高視覺功能并能降低糖尿病誘導(dǎo)的促炎癥蛋白的表達(dá)。這些研究表明，IS患者血漿中ANRIL水平的增高可能參與了機體的炎癥反應(yīng)。本文通過臨床樣本檢測出IS患者高水平血漿ANRIL的表達(dá)，與前期的基礎(chǔ)研究結(jié)果相一致[8，9]。

Lp-PLA2主要是由巨噬細(xì)胞合成釋放，是反映血管炎癥的重要標(biāo)志物之一，國內(nèi)外研究也指出高水平Lp-PLA2是心血管疾病的危險因素[10，11]。本研究結(jié)果表明，與健康對照組相比，IS患者血漿Lp-PLA2水平顯著上升，分析主要是由于IS患者腦脊液中Lp-PLA2由血腦屏障進(jìn)入外周血造成。SAA是評估機體急性相反應(yīng)程度的重要生物學(xué)指標(biāo)，其在提示機體氧化應(yīng)激狀態(tài)下所引起的炎癥反應(yīng)方面具有較高的靈敏度[12，13]。血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥與氧化應(yīng)激是IS發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。本文通過臨床樣本檢測出IS患者高水平血漿SAA的表達(dá)，與前期的基礎(chǔ)研究結(jié)果相呼應(yīng)[12，13]。

ROC曲線分析顯示，血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA區(qū)分IS患者與健康對照者時具有一定的價值，當(dāng)聯(lián)合ANRIL、Lp-PLA2與SAA指標(biāo)時在區(qū)分IS患者與健康對照者的特異度達(dá)到98.42%，提示聯(lián)合上述三種標(biāo)志物具有較高的臨床應(yīng)用價值。在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等多個傳統(tǒng)IS風(fēng)險因素影響后，本文發(fā)現(xiàn)血漿高ANRIL、高Lp-PLA2與高SAA水平是IS發(fā)病的獨立危險因素。進(jìn)一步的生存分析也提示，高ANRIL、高Lp-PLA2與高SAA水平患者的預(yù)后較低水平者更差。上述研究提示，血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA在IS診斷及預(yù)后中具有重要臨床價值。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA的差異表達(dá)在用于IS患者診斷及預(yù)后評估時具有較高價值。

參考文獻(xiàn)

[1]Kim BJ，Lee SH，Ryu WS，et al.Adipocytokines and ischemic stroke，differential associations between stroke subtypess[J].J Neurol Sci，2012，312（1-2）：1 17-122.

[2]Li R，Liu W，Yin J，et al.TSC-6 attenuates inflammation-induced braininjury via modulation of microglial polarization in SAE rats through theSOCS3/S'I'A13 pathway[J].J Neuroinflammation，2018，15（1）：231.

[3]Malone K，Amu S，Moore AC，et al.The immune system and stroke：fromcurrent targets to future therapy[J].lmmunol Cell Biol，2019，97（1）：5-16.

[4]Bao MH，Szeto V，Yang BB，et al.Long non-coding R1NAs in ischemicstroke[J].Cell Death Dis，2018，9（3）：281.

[5]Tibuakuu M，Kianoush S，DeFilippis AP，et al.Usefulness of lipoprotein-associated phospholipase A2 activity and C-reactive protein in identifyinghiglrrisk smokers for atherosclerotic cardiovascular disease（from theAtherosclerosis Risk in Communities Study）[J].Am J Cardiol，2018，121（9）：1056-1064.

[6]朱穎煒，韋凡平，程震鋒.丹參川芎嗪注射液對AFCOPD并發(fā)肺心病患者血清SAA、BNP的影響[J].心腦血管病防治，2017，17（3）：215-216.

[7]Kwah LK，Diong J.National Institutes of Health Stroke Scale（NIHSS）[J].J Physiother，2014，60（1）：61.

[8]Xiong L，Liu W，Gao L，et al.The anril genetic variants and their inter-actions with environmental risk factors on atherothrombotic stroke in a hanChinese population[J].J Stroke Cerebrovase Dis，2018，27（9）：2336-2347.

[9]SchulZ S，Seitter L，Werdan K，et al.Single nucleotide polymorphisrs inlong noncoding RNA，ANRIL，are not associated with severe periodontitisbut with adverse cardiovascular events among patients with cardiovasculardisease[J].J Periodontal Res，2018，53（5）：714-720.

[10]Alkumishy HM，Al-Gareeb Al，Waheed HJ.Lipoprotein-associated phos-pholipase A2 is linked with poor cardio-metabolic profile in patients with is-chexnic stroke：A Study of Effects of Statins[J].J Neurosci Rural Pract，2018，9（4）：496-503.

[11]王賢進(jìn)，趙艷芳.最大頸動脈內(nèi)膜中層厚度與脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2對冠心病的預(yù)測作用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2016，44（11），1487-1492.

[12]Uhde M，Ajamian M，Li X，et al.expression of C-reactive protein andserum amyloid A in early to late manifestations of lyme disease[J].ClinInfect Dis，2016，63（11）：1399-1404.

[13]Watanabe K，Uchida K，Chambers JK，et aI.Deposition，clearance，andreinduction of amyloid A amyloid in interleukin 1 receptor antagonist knock-out mice[J].Vet Pathol，2017，54（1）：99-110.

（收稿日期：2019-5-19）

作者單位：150010 黑龍江哈爾濱市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

作者簡介：何平（1986-），碩士，醫(yī)師