蘭玉艷 李巖

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

白鮮皮又稱白蘚皮是一種常用的中草藥〔1〕，其為蕓香科白鮮屬植物白鮮的根皮〔2〕，主產(chǎn)于東北、華北、西北、西南等地〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，白鮮皮的主要化學(xué)成分有白鮮堿、倍半萜、倍半萜甙類化合物、黃酮類化合物、檸檬苦素類化合物、多糖和甾體類化合物等〔4〕，不但具有消炎、殺菌、除蟲、抗非特異性變態(tài)反應(yīng)、治療濕疹等功效，還在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用〔5〕。現(xiàn)階段白鮮皮對紅細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用的研究尚未見報道，因此，本實驗以白鮮皮乙醇提取物(AEDP)為受試藥物，以紅細(xì)胞自氧化溶血和過氧化氫(H2O2)引起氧化溶血為研究模型，通過對人紅細(xì)胞自氧化溶血度和H2O2所致紅細(xì)胞溶血度的測定，探討其對紅細(xì)胞的抗氧化作用，并對其抗氧化活性成分進(jìn)行定性分析。

1 材料與方法

1.1藥物制備 野生白鮮皮于2013年9月采自吉林省敦化市雁鳴湖自然保護(hù)區(qū)，自然蔭干后粉碎，水煮醇沉、大孔樹脂吸附等處理得到AEDP。

1.2主要儀器、試劑 LD5-100型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；XSS250(FZ)型深部X線治療機(jī)，溫州大華儀器儀表有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；722型光柵分光光度計，上海第三分析儀器廠。肝素鈉10% NaOH，長春市化學(xué)試劑。

1.31%人紅細(xì)胞懸液的制備〔6〕取健康成人靜脈血2 ml加入肝素抗凝。用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，1 500 r/min，離心10 min。用相同的PBS配成1%紅細(xì)胞懸液置于4℃冰箱保存，待用。

1.4人紅細(xì)胞溶血度的測定 取1%人紅細(xì)胞懸液，加入預(yù)先配置好的不同濃度的AEDP，分別以恒溫水浴箱孵育24 h和H2O2誘導(dǎo)為損傷因素，用比色法測定紅細(xì)胞溶血度。

1.6H2O2所致紅細(xì)胞溶血度的測定 分成空白組、對照組、AEDP各劑量組?？瞻捉M3 ml 1%紅細(xì)胞懸液加入250 μl PBS；對照組3 ml 1%紅細(xì)胞懸液加入200 μl PBS 和50 μl 30%H2O2；實驗組3 ml 1%紅細(xì)胞懸液加入200 μl PBS配制的含有不同濃度AEDP(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml)和50 μl 30% H2O2。充分混勻后，將空白組、對照組、各實驗組試管同時置于37℃恒溫水浴1 h，1 500 r/min，離心10 min。722型分光光度計，455 nm波長測定吸光度，視對照組為100%溶血，計算溶血度。每次實驗設(shè)6個平行管且重復(fù)6次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1人紅細(xì)胞自氧化溶血度測定的結(jié)果 對照組和AEDP各劑量組均出現(xiàn)了不同程度的溶血現(xiàn)象，AEDP各劑量組紅細(xì)胞溶血度顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。AEDP對紅細(xì)胞自氧化溶血有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增加，紅細(xì)胞溶血度逐漸降低，提示AEDP與紅細(xì)胞自氧化溶血度可能存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。

表1 各組紅細(xì)胞自氧化吸光度及溶血程度比較

與對照組比較：1)P<0.05；表2同

2.2H2O2所致人紅細(xì)胞溶血度的測定結(jié)果 空白組、對照組、AEDP各劑量組紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象顯著，AEDP各劑量組紅細(xì)胞溶血度顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。AEDP對H2O2所致紅細(xì)胞溶血有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增加，紅細(xì)胞溶血度逐漸降低，提示AEDP與H2O2所致紅細(xì)胞的溶血度可能存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。

表2 各組H2O2所致紅細(xì)胞氧化吸光度及溶血度的測定

3 討 論

紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，同時也是氣體交換的主要媒介，同時還具有免疫功能，紅細(xì)胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸，大量研究表明這些不飽和脂肪酸最易受到自由基、活性氧(ROS)或活性氮(RON)的攻擊，而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔7，8〕。脂質(zhì)過氧化〔9，10〕不僅破壞紅細(xì)胞膜脂質(zhì)，從而使紅細(xì)胞膜完整性發(fā)生改變，導(dǎo)致其溶血；還可與鄰近的分子如膜蛋白質(zhì)反應(yīng)，或擴(kuò)散至細(xì)胞核與DNA反應(yīng)〔11～13〕。而H2O2本身就是一種強(qiáng)氧化劑，是細(xì)胞氧化應(yīng)激，應(yīng)激原ROS家族中的一員〔14〕。生理狀態(tài)下，ROS和RON是機(jī)體維持多種生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，當(dāng)機(jī)體暴露毒物時會導(dǎo)致機(jī)體抗氧化的能力減弱從而引起機(jī)體清除自由基、ROS或RON的能力減弱，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基、ROS或RON破壞了機(jī)體的氧化、還原的正常平衡，導(dǎo)致機(jī)體組織和細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激〔15，16〕。氧化應(yīng)激是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激的早期，機(jī)體通過啟動細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，清除過量的自由基，使細(xì)胞免于氧化性損傷。然而，氧化應(yīng)激通常具有細(xì)胞應(yīng)激特有的兩重性：即隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)，機(jī)體在清除過量的自由基、ROS或RON的同時，有可能導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)節(jié)功能和細(xì)胞維持功能的障礙，甚至引起細(xì)胞的凋亡和自噬。所以，當(dāng)紅細(xì)胞處于充足的氧環(huán)境和大量H2O2存在的情況下，容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象〔17，18〕?？梢姳苊膺^量的自由基、ROS或RON產(chǎn)生就可抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制紅細(xì)胞溶血，保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性。

本實驗提示H2O2可能破壞紅細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生；AEDP對H2O2所致紅細(xì)胞溶血有明顯的抑制作用；H2O2所致人紅細(xì)胞的溶血度與AEDP可能存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明AEDP對紅細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，防止紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象。

綜上，AEDP對體外紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用可能是機(jī)體通過啟動細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，清除機(jī)體內(nèi)過量的自由基、ROS或RON等，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防止紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象，保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞免于氧化性損傷〔13，19，20〕。