李鵬飛，張興昌，郝明德，崔勇興，2，張燕江，朱世雷

（1.中國科學(xué)院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，陜西 楊凌712100；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.水利部 黃河水利委員會黃河上中游管理局，陜西 西安710021；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100）

礦產(chǎn)開發(fā)對土壤環(huán)境造成了嚴重破壞，對土壤性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的功能和穩(wěn)定性產(chǎn)生了不利影響，特別是在黃土高原生態(tài)脆弱區(qū)。對礦區(qū)重構(gòu)土壤進行植被恢復(fù)的最終目的是維持礦區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展［1］。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中至關(guān)重要，土壤真菌作為土壤微生物的重要組成部分，在改善土壤質(zhì)量方面具有重要作用［2］，探索不同植被恢復(fù)條件下土壤真菌群落特征可為生態(tài)恢復(fù)提供重要信息。土壤真菌作為土壤中的分解者，不僅能夠分解土壤中有機物，還能分解植物殘體中的木質(zhì)素和纖維素，對陸地系統(tǒng)碳循環(huán)至關(guān)重要［3-4］，此外，部分真菌在提高植物抗逆性方面發(fā)揮著重要功能［5］。植物和微生物產(chǎn)生的酶在土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量流動中起著重要作用。例如，蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶與土壤中的碳、氮、磷循環(huán)密切相關(guān)［6］。酶在許多土壤生態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用，與土壤微生物群落密切相關(guān)，可以快速響應(yīng)植被恢復(fù)下微生物群落的變化。

以往對礦區(qū)重建土壤的植被恢復(fù)效果評價主要集中在土壤質(zhì)量評價［7］、理化特征［8-9］和植被特征［10］等方面，而對微生物，特別是真菌群落的研究仍然較少。在真菌群落研究方法方面，大多數(shù)仍然采用磷脂脂肪酸法（phospholipid fatty acid，PLFA）［11-12］，該方法具有一定的局限性，不能全面反映出植被恢復(fù)過程中土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。

近年來，擴增子高通量測序技術(shù)的應(yīng)用極大促進了微生物研究進展，為我們了解環(huán)境中微生物狀況提供了新的方法。因此，本研究在黃土高原礦區(qū)排土場選擇3種植被恢復(fù)類型（灌木、喬木、草本）及未復(fù)墾地的重構(gòu)土壤，采用擴增子高通量測序技術(shù)對土壤真菌群落組成和多樣性進行研究。測定土壤理化性質(zhì)和酶活性，在此基礎(chǔ)上探討植被恢復(fù)過程中礦區(qū)重構(gòu)土壤理化性質(zhì)的變化，以期揭示了土壤理化性質(zhì)與真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)系，進一步準確評價植被恢復(fù)對黃土高原礦區(qū)重構(gòu)土壤生態(tài)的恢復(fù)效果。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究在內(nèi)蒙古自治區(qū)準格爾旗東南（北緯39°43′—39°49′，東經(jīng)111°13′—111°20′）黑岱溝露天煤礦開展。研究區(qū)地形為典型的黃土丘陵區(qū)，屬半干旱、溫帶大陸性氣候。年平均降水量401.6 mm，集中在7—9月，約占年降水量的60%～70%，年蒸發(fā)量1 824.7～2 896.1 mm。地帶性土壤為以砒砂巖為母巖的栗褐土，礦區(qū)土壤為黃土性土壤和風(fēng)沙土，土壤疏松，抗蝕性差，堿性弱，肥力低。嚴重的采礦擾動使當?shù)赝寥拦逃械睦砘蜕锾匦园l(fā)生了很大的變化，主要表現(xiàn)在對土壤團聚體的嚴重破壞、養(yǎng)分的嚴重流失、地形的變化等方面，因此被認為是一種重構(gòu)土壤。礦區(qū)地帶性植被屬于暖草原帶，植被稀疏，覆蓋度低，一般小于30%。主要植被類型有：喬木（北京楊、油松、樟子松、山杏）；灌木（歐李、檸條錦雞兒、丁香、沙棘、紫穗槐）和草本植物（長芒草、沙蒿、達烏里胡枝子、硬質(zhì)早熟禾、草木犀狀黃芪、沙打旺、紫花苜蓿、冰草、拂子茅、阿爾泰狗娃花、狗尾草）［13］。

1.2 研究方法

2017年8月下旬選擇黑岱溝煤礦北排土場和東排土場進行采樣。為了減少由于土壤固有屬性引起的變異，采樣點選擇采用相似地形，同時與礦區(qū)工作人員進行溝通，并查閱相關(guān)資料，保證了采樣點植被恢復(fù)年限的基本一致，復(fù)墾年限在18～20 a之間。采樣地為3種典型植被類型（灌木地、喬木林和草地）和未復(fù)墾地。在3種典型植被恢復(fù)下各建立了3個采樣小區(qū)，由于未復(fù)墾地面積較小，因此在未復(fù)墾地建立了兩個采樣小區(qū)。使用直徑5 cm 的土鉆從每個小區(qū)按照S形線路采集5個土樣，采樣深度為0—20 cm，攪拌均勻，形成一個混合樣品。每一個混合樣品立即通過一個2 mm 的篩子，然后被分成3個部分進行下一步分析。第一部分保存在－80 ℃環(huán)境中，用于DNA 的提??；第二部分保存在4 ℃環(huán)境中，進行酶活性測定；第三部分保留下來，進行試驗預(yù)處理后的化學(xué)性質(zhì)分析。

（1）土壤物理性質(zhì)測定。采用烘干法測定土壤含水量，采用環(huán)刀法測定土壤容重。

（2）土壤化學(xué)性質(zhì)測定。采用水土比1∶1電極法測定p H 值，采用重鉻酸鉀容量法測定有機質(zhì)，采用堿解擴散法測定速效氮，采用Olsen 法測定速效磷［14］。

（3）土壤酶活性測定。采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶，采用苯磷酸二鈉比色法測定堿性磷酸酶，采用靛酚藍光度法測定脲酶，3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶［15］。

（4）土壤真菌群落多樣性測定。取0.25 g左右新鮮土壤樣品，按照PowerSoilkit（MOBIOLaboratories，Carlsbad，USA）試劑盒的方法提取土壤DNA，隨后對樣本進行ITS1 區(qū)域的擴增，引物為：1743F-5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和2043R-5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。擴增完畢后建立樣本原始文庫，采用北京百邁客生物科技有限公司Illumina Hiseq 2500 平臺（Illumina Corporation，USA），2×250 bp 的雙端測序策略對文庫進行測序。使用Trimmomatic 軟件（version on0.33）對原始序列進行質(zhì)控并去除嵌合體。采用軟件Mothur軟件將相似性大于97%的序列歸為同一種可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），對每個OTU 的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息［2，5］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

首先采用Microsoft Excel 2015進行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)性分析和逐步回歸分析，R 語言Vegan程序包進行主坐標分析、冗余分析和Adonis分析，Microsoft Excel 2015繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型下土壤理化性質(zhì)及酶活性變化

不同植被類型下土壤理化性質(zhì)及酶活性的結(jié)果如表1所示。研究區(qū)域土壤偏堿性，養(yǎng)分含量較低。含水量、有機質(zhì)、速效磷、脲酶以及蔗糖酶在不同植被類型下差異顯著（p＜0.05），容重、p H 值、速效氮、過氧化氫酶以及堿性磷酸酶在不同植被類型下均未呈現(xiàn)出顯著差異。灌木林、喬木林和草地3 種植被類型下土壤含水量顯著高于未復(fù)墾地含水量（p＜0.05），草地土壤含水量最高，為8.85%。灌木林土壤具有最高的有機質(zhì)（15.85 g／kg）、速效氮（8.98 mg／kg）、速效磷（8.11 mg／kg）、堿性磷酸酶〔0.45 mg／（g·24 h）〕、脲酶〔0.87 mg／（g·24 h）〕以及蔗糖酶〔3.28 mg／（g·24 h）〕含量。未復(fù)墾地有機質(zhì)（5.22 g／kg）、速效氮（7.46 mg／kg）、速效磷（1.91 mg／kg）、過氧化氫酶〔3.49 mg／（g·24 h）〕、堿性磷酸酶〔0.18 mg／（g·24 h）〕、脲酶〔0.10 mg／（g·24 h）〕以及蔗糖酶〔0.68 mg／（g·24 h）〕均為最低。然而，容重和p H 值均在未復(fù)墾地土壤中最高，分別為1.33 g／cm3和8.76。

表1 黃土高原礦區(qū)不同植被恢復(fù)下土壤理化性質(zhì)和酶活性

2.2 不同植被類型下土壤真菌群落多樣性

不同植被類型下土壤真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)如表2所示。不同植被恢復(fù)下土壤真菌豐富度指數(shù)（ACE 估計量和Chao1 指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）差異極顯著（p＜0.01）。所有樣本覆蓋度均在99%以上，說明測序結(jié)果可靠，反映了土壤真菌群落的真實情況。灌木地、喬木林以及草地3種植被類型恢復(fù)下土壤真菌OTU、群落豐富度和多樣性均與未復(fù)墾地差異極顯著（p＜0.01），且未復(fù)墾地土壤真菌OTU，ACE估計量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均為最低。這些結(jié)果表明植被恢復(fù)顯著提高了真菌群落豐富度和多樣性。

表2 黃土高原礦區(qū)不同植被恢復(fù)下土壤真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

不同植被恢復(fù)下土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)如圖1所示。4 個樣地主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota）、球 囊 菌 門（Glomeromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、絲足蟲類（Cercozoa）、梳霉門（Kickxellomycota）、油 壺 菌 門（Olpidiomycota）。其中以子囊菌門、擔(dān)子菌門和球囊菌門為主要真菌類群，3種主要真菌類群相對豐度總和在各樣地所占比重均超過50%。不同樣地中各個真菌門相對豐度所占比例不同，子囊菌門和擔(dān)子菌門均在未復(fù)墾地中最高，分別約為64%和29%；球囊菌門在草地中最高，約為11%。子囊菌門在4個樣地中相對豐度排序為：未復(fù)墾地＞灌木地＞喬木林＞草地；擔(dān)子菌門相對豐度排序為：未復(fù)墾地＞喬木林＞灌木地＞草地；球囊菌門相對豐度排序為：草地＞喬木林＞灌木地＞未復(fù)墾地。其中，擔(dān)子菌門，球囊菌門以及無法識別菌門的相對豐度在4個樣地之間差異顯著（p＜0.05）。

由表3及圖2可以看出，3種植被類型之間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，未復(fù)墾地土壤真菌群落與3種植被類型之間的差異大于3種植被類型兩兩之間的組間差異?？傮w上，4個樣地兩兩組間差異并不顯著，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化在4 個樣地間相對穩(wěn)定。

表3 黃土高原礦區(qū)不同樣地之間土壤群落結(jié)構(gòu)Adonis分析

圖1 黃土高原礦區(qū)不同植被恢復(fù)下土壤門分類水平真菌群落結(jié)構(gòu)特征

圖2 黃土高原礦區(qū)不同植被恢復(fù)下土壤真菌群落主坐標分析

2.3 土壤理化性質(zhì)、酶活性與真菌群落多樣性

從研究區(qū)的土壤理化性質(zhì)、酶活性與真菌群落多樣性相關(guān)性分析結(jié)果（詳見表4）可知，土壤含水量與OUT，ACE估計量和Chao1指數(shù)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.701，0.697和0.710，與Shannon指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.747；土壤速效磷與ACE估計量和Chao1 指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.608和0.619；土壤脲酶與OTU，ACE 估計量和Chao1指數(shù)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.676，0.704和0.709；土壤蔗糖酶與OTU，ACE 估計量，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.712，0.693，0.697和0.690。其余土壤理化性質(zhì)與真菌群落多樣性之間沒有表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

表4 黃土高原礦區(qū)土壤理化性質(zhì)、酶活性與真菌群落多樣性相關(guān)性分析

門水平上土壤理化性質(zhì)、酶活性與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析（RDA）如圖3所示。RDA 分析結(jié)果中，真菌群落差異在第一和第二排序軸上的解釋率分別是61.78%和13.79%，土壤理化性質(zhì)和酶活性箭頭的連線長度以及土壤理化性質(zhì)、酶活性箭頭與真菌物種之間箭頭夾角可以看出土壤理化性質(zhì)、酶活性對真菌群落的影響［16］，除了擔(dān)子菌門，真菌群落主要分布在第一、三、四象限。擔(dān)子菌門與p H 值和容重呈正相關(guān)，與其他土壤理化性質(zhì)和酶活性呈負相關(guān)；子囊菌門除與有機質(zhì)、過氧化氫酶、速效氮和含水量呈負相關(guān)外，與其他土壤理化性質(zhì)、酶活性之間相關(guān)性不明顯；球囊菌門與p H 值和容重呈負相關(guān)，與速效磷相關(guān)性不明顯，與其他土壤理化性質(zhì)和酶活性呈正相關(guān)。

圖3 黃土高原礦區(qū)門水平土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的冗余分析（redundancy analysis，RDA）

通過土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)進行逐步回歸分析，結(jié)果得出土壤真菌OTU，ACE 估計量，Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)的最大影響因素為土壤含水量，回歸方程和R2如表5所示。

表5 黃土高原礦區(qū)土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)逐步回歸分析

3 討論

3.1 不同植被類型下土壤理化性質(zhì)及酶活性

對礦區(qū)重構(gòu)土壤進行植被恢復(fù)有效改善和提高了土壤理化性質(zhì)、酶活性和真菌群落多樣性。與之前的研究結(jié)果類似，植被恢復(fù)在促進和恢復(fù)脆弱地區(qū)生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用，特別是在黃土高原礦區(qū)［17］；Yang等［18］發(fā)現(xiàn)在干旱地區(qū)復(fù)墾可以顯著提高土壤養(yǎng)分含量；王雅等［16］通過研究黃土高原不同植被類型對土壤理化性質(zhì)及酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，不同植被類型對土壤養(yǎng)分及酶活性的影響具有顯著差異。本研究中，不同植被類型導(dǎo)致了土壤理化性質(zhì)和酶活性的差異。如表1所示，灌木地土壤在大多數(shù)土壤性質(zhì)和酶活性上要優(yōu)于其他3個樣地。在一系列生化過程的影響下，干旱半干旱地區(qū)灌木土壤通常具有較高的土壤養(yǎng)分含量，這種現(xiàn)象被稱為“沃島效應(yīng)”［19-20］。土壤養(yǎng)分的有效性與土壤酶活性密切相關(guān)，土壤酶活性直接對土壤養(yǎng)分礦化產(chǎn)生影響，植被恢復(fù)通過改變酶活性和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化率從而改變了生態(tài)資源的有效性［18］。

3.2 不同植被類型下土壤真菌群落多樣性

如表2所示，不同植被恢復(fù)類型對真菌OTU、群落豐富度（ACE 估計量和Chao1 指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）指標均有顯著影響（p＜0.01）。一般來說，土壤含水量是影響微生物群落豐富度的重要因素［20］，由于未復(fù)墾地土壤含水量顯著低于其他3種植被類型下土壤含水量（p＜0.01），導(dǎo)致真菌群落豐富度和多樣性顯著低于3種植被類型。從圖1可以看出黃土高原礦區(qū)重構(gòu)土壤真菌主要門類為子囊菌門、擔(dān)子菌門和球囊菌門，這與黃土高原梯田土壤［21］、云南茶園酸性土壤［22］以及黃河三角洲地區(qū)油泥污染土壤［23］中真菌主要門類相似，說明以上幾種真菌門類在土壤中廣泛存在，并不是該研究區(qū)域特有的。未復(fù)墾地子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度高于其他3種植被類型土壤，有研究對全世界真菌種類進行了估計，被正式描述的不足10%［24］，因此，對未識別真菌種類的深入研究具有重要意義，相比于未復(fù)墾地，3種植被恢復(fù)下土壤無法識別真菌相對豐度增加（p＜0.05），真菌種類的增加導(dǎo)致了物種之間能量和營養(yǎng)的競爭加劇，使得主要門類真菌相對豐度的降低，也進一步說明了植被恢復(fù)豐富了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)。盡管植被恢復(fù)對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在4個樣地之間仍然保持了一定穩(wěn)定性（表3），說明礦區(qū)重構(gòu)土壤真菌群落的生態(tài)恢復(fù)是一個漫長的過程。

3.3 土壤理化性質(zhì)以及酶活性和真菌群落的關(guān)系

土壤性質(zhì)的差異會導(dǎo)致土壤微生物群落產(chǎn)生一定程度的差別。Lauber等［25］認為不同植被土壤主要真菌門類相對豐度的不同是由于土壤有機質(zhì)、氮素等養(yǎng)分狀況的不同而導(dǎo)致的，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化受到土壤養(yǎng)分狀況的影響。RDA 結(jié)果（圖3）表明，土壤含水量和p H 值為影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。有研究表明，含水量的增加有利于提高微生物的養(yǎng)分利用率，從而影響微生物群落［26］。p H 值能夠影響土壤中化合物形態(tài)，進而影響土壤微生物對養(yǎng)分的吸收利用，最終影響土壤真菌群落［5］。巨天珍等［27］以天水小隴山紅豆杉林土壤為研究對象，發(fā)現(xiàn)真菌總數(shù)與水分呈顯著正相關(guān)，而與p H 值呈顯著負相關(guān)。鄭智［28］以浙江濱海鹽堿土為研究對象，發(fā)現(xiàn)土壤水分和p H值的變化均能顯著影響真菌多樣性。本研究區(qū)氣候干旱，土壤含水量是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的最主要因素。真菌對于不同土壤p H 值的適應(yīng)范圍不同，大多為5～8之間［5］，本研究中p H 值均在8以上，一定程度上限制了土壤真菌的生長發(fā)育，因此與大多數(shù)真菌門類呈負相關(guān)。土壤酶活性總體上與真菌群落呈正相關(guān)，這是由于微生物群落與酶活性的高度自相關(guān)性，土壤養(yǎng)分含量的增加促進了微生物數(shù)量的增加從而促進了微生物分泌的酶增加。資源的異質(zhì)性有助于維持微生物的高度多樣性和共存。一般來說，植被通過凋落物分解和根系分泌等多種因素為土壤微生物群落提供了資源異質(zhì)性。因此，植被恢復(fù)對于提高微生物多樣性具有重要作用；此外，對植被恢復(fù)的人為管理養(yǎng)護，例如養(yǎng)分的施用，也增加了土壤微生物資源的異質(zhì)性［29］。

本研究結(jié)果有助于對植被恢復(fù)效果有一個大致了解，但由于研究區(qū)域的特定性以及土壤微生物群落的復(fù)雜性，今后需在不同地區(qū)和土壤類型下開展相關(guān)研究，進一步探討土壤、植被和微生物之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

（1）與未復(fù)墾地相比，經(jīng)過18～20 a的植被恢復(fù)，3種典型植被類型均顯著改善了土壤含水量、有機質(zhì)、速效氮、速效磷含量以及酶活性，而對容重和p H值的改善不顯著。

（2）與未復(fù)墾地相比，經(jīng)過18～20 a的植被恢復(fù)，3種典型植被類型均顯著提高了真菌群落多樣性，灌木地土壤具有最佳的土壤真菌多樣性，而4個樣地之間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)保持了一定的穩(wěn)定性，植被恢復(fù)不足以顯著影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

（3）土壤含水量是影響土壤真菌群落多樣性的最重要因素，種植灌木對黃土高原礦區(qū)重構(gòu)土壤生態(tài)恢復(fù)效果最好。