李泮霖，彭維，吳灝，王永剛，李沛波，張迷迷，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275)

化橘紅是嶺南特色中藥，用于治療咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等癥，是廣東省化州市的地理標(biāo)志產(chǎn)品。其應(yīng)用歷史悠久，在歷代本草及歷版藥典中均有記載，目前收載于《中華人民共和國藥典(2015版)》一部[1]。我們經(jīng)過大量的文獻(xiàn)考證、市場調(diào)研及實驗研究，認(rèn)為現(xiàn)行版藥典中的化橘紅質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在以下兩個問題：第一，植物基原混亂。2015年版藥典“化橘紅”項下規(guī)定，化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮?；蓁譃殍值囊粋€栽培變種，在分類學(xué)上歸于柚種的下一級，“化州柚或柚”并列的寫法是采用舊的分類觀念，不夠準(zhǔn)確[2]。此外，兩種基原藥材質(zhì)量有很大差異，而藥典標(biāo)準(zhǔn)無法進(jìn)行區(qū)分。第二，實際使用的藥用部位與藥典規(guī)定不一致。根據(jù)當(dāng)前的市場現(xiàn)狀及民間用藥習(xí)慣，化州柚普遍使用干燥未成熟幼果入藥，而藥典規(guī)定的外層果皮已非常少見?；蓁钟坠馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍處于空缺狀態(tài)，嚴(yán)重影響了其監(jiān)管及利用。

為了解決以上問題，本研究通過對化橘紅的歷史沿革進(jìn)行考證，弄清化橘紅多基原的產(chǎn)生及藥用部位變遷的緣由。通過收集并檢測市場上各類化橘紅樣品，探討不同基原及藥用部位間的差異，并建立化橘紅等級標(biāo)準(zhǔn)，可對基原進(jìn)行區(qū)分，對質(zhì)量優(yōu)劣進(jìn)行評價。本研究結(jié)果將為化橘紅藥典標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供建議，為規(guī)范化橘紅市場流通提供了依據(jù)。

1 材 料

1.1 樣品的收集

從廣東、廣西等地收集具代表性的化橘紅藥材124批(表1)，其中化州柚基原98批、柚基原26批?；蓁只杏职?1批幼果及17批外層果皮(即五爪或七爪)樣品；柚基原的樣品只收集到幼果樣品。代表性樣品圖片如圖1所示。

圖1 化橘紅樣品外觀A：化州柚幼果；B：柚幼果；C：化州柚外果皮(五爪)；D：化州柚外果皮(七爪)Fig.1 A photograph of Citri Grandis ExocarpiumA：immature fruit of Citrus grandis ‘Tomentosa’；B：immature fruit of C. grandis (L.)Osbeck；C：exocarp of C. grandis ‘Tomentosa’ (five lobes); D: exocarp of C. grandis ‘Tomentosa’ (seven lobes)

1.2 儀器

電子分析天平(ME204，瑞士Mettler toledo公司)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司，DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機、UPS-3000SL自動進(jìn)樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon 7.2數(shù)據(jù)處理軟件)；色譜柱：Welch XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，S.N.211604929)，依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，戴安Acclaim 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；超純水器(Simplicity 185 personal，美國Millipore公司)；移液管。

1.3 試藥

柚皮苷對照品(批號：110722-201111)，野漆樹苷對照品(批號：111919-201102)、異歐前胡素對照品(批號：110827-200407)，購自中國藥品生物制品檢定所；橙皮內(nèi)酯水合物對照品為實驗室自制，HPLC檢測純度高于98%；甲醇(分析純，色譜純)，冰醋酸(色譜純)。

2 方 法

2.1 外觀性狀

測量果實的橫切面直徑、縱切面直徑、果皮厚度，觀察外表面是否有茸毛。七爪、五爪樣品將其展平直徑作為原幼果周長，計算原幼果直徑。

2.2 特征圖譜[3]

2.2.1 色譜條件 以甲醇為流動相A，以φ=6%醋酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為1 mL/min，檢測波長為320 nm。洗脫程序為：0～25 min，30%流動相A，70%流動相B；25～75 min，30%→45%流動相A，70%→55%流動相B；75～110 min，45%→100%流動相A，55%→0%流動相B；110～120 min，100%流動相A，0%流動相B。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取柚皮苷對照品10.16 mg、野漆樹苷對照品10.25 mg、橙皮內(nèi)酯水合物對照品10.45 mg、異歐前胡素5.48 mg，加甲醇溶解，搖勻，分別制成每1 mL含柚皮苷508 μg、野漆樹苷16.4 μg、橙皮內(nèi)酯水合物8.36 μg、異歐前胡素54.8 μg的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取供試品粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱量，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率120 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Dionex Acclaim 120 C18(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流動相：甲醇(A)-φ=0.3%醋酸溶液(B)= 35∶65；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量柚皮苷對照品、野漆樹苷對照品，加甲醇制成每1 mL分別含柚皮苷496.5 μg、野漆樹苷20.23 μg的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱量，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(150 W，40 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察 根據(jù)中國藥典2015年版(通則9101)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，對方法的線性范圍、重復(fù)性、中間精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

2.4 浸出物

2.4.1 醇溶性浸出物 取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，水浴加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.4.2 水溶性浸出物 取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時時振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量(%)。

2.5 其他鑒別、檢查項

顯微鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分按藥典化橘紅項[1]相應(yīng)的方法進(jìn)行檢測。

3 結(jié) 果

3.1 樣品檢測結(jié)果

3.1.1 外觀性狀 檢視各批樣品的外觀，觀察外表面是否被茸毛；測量幼果的橫截面直徑、縱截面直徑、果皮厚度，結(jié)果如表1所示。化州柚和柚的外觀性狀主要區(qū)別在果實形狀及外表面是否被茸毛，具體描述如下。

化州柚幼果呈近球形、半球形、1/4球形或圓柱形，直徑3～8 cm。外層果皮或呈對折的七角或展平的五角星狀，單片呈柳葉形，完整者展平后直徑15～28 cm，厚0.2～0.5 cm。外果皮灰綠色或黃綠色，密布茸毛，有皺紋及小油室，有明顯的花柱殘跡或果梗痕。幼果質(zhì)堅硬，不宜切開，切面平整，中果皮黃白色或淡紅棕色，有脈絡(luò)紋；外緣有1列不整齊的下凹的油室；內(nèi)側(cè)可見瓤囊，黃棕色至棕褐色。外層果皮質(zhì)脆，易折斷，斷面不整齊，內(nèi)表面黃白色或淡黃棕色，有脈絡(luò)紋，外緣有1列不整齊的下凹的油室，內(nèi)側(cè)稍柔而有彈性。氣芳香，味苦，微辛。

柚幼果呈梨形或近球形，外果皮深褐色，無毛。外層果皮表面黃綠色至黃棕色，無毛。其余性狀與化州柚相同。

3.1.2 鑒別、檢查 顯微鑒別結(jié)果與藥典描述一致，其中由于化州柚外表面有茸毛，因此在化州柚中可見碎斷的非腺毛，在柚中則觀察不到?；偌t藥典標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別只對柚皮苷斑點進(jìn)行檢視，本研究結(jié)果表明(圖2)，該條件下可同時對黃酮類化合物(以柚皮苷為代表的綠色熒光斑點)及香豆素類化合物(以橙皮內(nèi)酯水合物為代表的藍(lán)色熒光斑點)進(jìn)行檢視。

圖2 化橘紅薄層色譜圖1:混合對照品(柚皮苷RF = 0.52, 橙皮內(nèi)酯水合物RF = 0.21); 2～4:化州柚幼果樣品(樣品1～3);5～7:化州柚外果皮樣品(樣品82～84); 8～10:柚幼果樣品(樣品114～116)Fig.2 Thin-layer chromatograms of Citri Grandis Exocarpium1: CRS (Naringin RF = 0.52, Meranzin hydrate RF = 0.21); 2～4:immature fruit of C. grandis‘Tomentosa’(Sample 1～3);5～7: exocarp of C. grandis ‘Tomentosa’ (Sample 82～84); 8～10: immature fruit of C. grandis (L.)Osbeck (Sample 114～116),(HPTLC Silica G 20 cm×10 cm) (23 ℃, 56%)

水分測定結(jié)果如表1所示?；蓁钟坠?、化州柚外層果皮、柚幼果樣品水分平均值分別為10.70%、9.06%、10.54%。幼果因保留了中果皮，水分含量也相應(yīng)變高。

表1 化橘紅樣品及其測定結(jié)果Table 1 Citri Grandis Exocarpium samples and their test results

續(xù)上表編號基原產(chǎn)地年份部位外表面被毛橫直徑縱直徑果皮厚度cmw/%水分柚皮苷野漆樹苷總黃酮聚類等級47化州柚廣東化州2010幼果有6.946.391.7511.707.410.247.653三48化州柚廣東化州2011幼果有5.345.751.8410.957.050.237.283二49化州柚廣東化州2011幼果有6.616.972.0011.565.840.296.134三50化州柚廣東化州2010幼果有6.276.201.8612.445.710.235.944三51化州柚廣東化州2012幼果有5.005.311.5612.2210.030.4210.452二52化州柚廣東化州2012幼果有6.806.531.6911.206.360.476.833三53化州柚廣東化州2012幼果有3.643.711.2311.3713.530.5714.101一54化州柚廣東化州2007幼果有4.594.841.4711.699.160.399.552一55化州柚廣東化州2008幼果有4.905.701.8210.739.450.8610.312二56化州柚廣東化州2008幼果有4.596.451.4611.3910.700.5511.252二57化州柚廣東化州2009幼果有4.256.641.3212.399.230.229.452二58化州柚廣東化州2007幼果有4.254.151.3811.7114.830.5615.391一59化州柚廣東化州2007幼果有4.464.791.6210.998.580.679.252一60化州柚廣東化州2007幼果有4.235.141.6511.6918.250.6618.911一61化州柚廣東化州2008幼果有3.814.811.519.6010.860.8411.702一62化州柚廣西玉林2011幼果有4.495.591.7210.639.070.119.182二63化州柚廣西玉林2012幼果有4.855.841.8511.659.850.139.982二64化州柚廣西玉林2010幼果有4.836.401.889.1110.480.1210.602二65化州柚廣西玉林2012幼果有4.806.251.839.378.450.128.573二66化州柚廣西玉林2010幼果有4.214.711.649.4510.540.1310.672一67化州柚廣西玉林2011幼果有4.585.462.0111.146.460.126.583二68化州柚廣西博白2011幼果有6.036.432.0511.178.460.288.743三69化州柚廣西博白2012幼果有6.796.702.0110.695.420.235.654三70化州柚廣西博白2010幼果有6.066.121.729.717.400.207.603三71化州柚廣西桂林2010幼果有7.358.202.648.335.170.185.354四72化州柚廣西桂林2011幼果有7.468.472.9111.804.710.164.874四73化州柚廣西桂林2011幼果有6.458.182.5912.607.650.307.953四74化州柚廣西桂林2012幼果有8.358.542.8212.416.280.266.544不合格75化州柚廣西2012幼果有6.356.351.4312.098.400.168.563三76化州柚廣西清湖2008幼果有4.975.731.8512.636.020.656.673二77化州柚廣西清湖2008幼果有7.498.122.397.325.030.405.434四78化州柚廣西清湖2009幼果有3.413.741.1911.6418.161.0919.251一79化州柚廣西桂林2007幼果有4.425.541.6511.678.320.989.303一80化州柚廣西清湖2007幼果有4.374.261.3211.758.891.2510.142一81化州柚廣西陸川2007幼果有4.885.251.157.7810.480.2310.712二82化州柚廣東化州2018外果皮有5.335.440.357.395.720.706.423二83化州柚廣東化州2018外果皮有4.984.750.4710.737.350.217.563二84化州柚廣東化州2018外果皮有5.035.290.417.185.960.716.673二85化州柚廣東化州2018外果皮有5.304.890.4510.077.830.488.313二86化州柚廣東化州2018外果皮有4.144.040.419.169.030.339.362一87化州柚廣東化州2018外果皮有5.965.460.3711.034.580.535.114三

續(xù)上表編號基原產(chǎn)地年份部位外表面被毛橫直徑縱直徑果皮厚度cmw/%水分柚皮苷野漆樹苷總黃酮聚類等級88化州柚廣東化州2018外果皮有4.143.820.328.849.970.9910.962一89化州柚廣東化州2018外果皮有5.785.660.449.265.850.806.653二90化州柚廣東化州2018外果皮有5.055.600.389.035.000.535.534三91化州柚廣東化州2018外果皮有5.995.550.4510.965.180.645.824三92化州柚廣東化州2018外果皮有5.375.340.4110.256.200.316.513二93化州柚廣東化州2018外果皮有5.575.750.408.654.770.605.374三94化州柚廣東化州2018外果皮有5.525.180.229.648.341.049.383二95化州柚廣東化州2018外果皮有6.116.610.349.463.180.403.584四96化州柚廣東化州2018外果皮有5.134.990.299.785.180.275.454三97化州柚廣東化州2018外果皮有7.205.570.3710.373.830.584.414三98化州柚廣東化州2018外果皮有5.135.490.269.954.030.474.504三99柚廣東肇慶2007幼果無7.249.662.1013.413.870.043.914不合格100柚廣東梅縣2009幼果無7.049.412.4412.462.950.073.024不合格101柚廣東化州2007幼果無7.2810.322.5611.982.920.062.984不合格102柚廣東化州2007幼果無6.429.262.6312.744.440.054.494四103柚廣東懷集2007幼果無4.957.632.2011.026.300.126.423四104柚廣東化州2008幼果無7.349.752.2312.874.310.084.394不合格105柚廣東湛江2007幼果無7.8110.202.3412.606.420.086.504不合格106柚廣東化州2009幼果無5.316.461.8511.936.930.107.033四107柚廣東化州2008幼果無6.518.761.9811.364.250.084.334四108柚廣東化州2008幼果無8.0110.993.368.374.110.074.184不合格109柚廣東化州2008幼果無6.959.812.336.352.660.072.734不合格110柚廣東梅縣2009幼果無4.556.832.166.153.160.063.224不合格111柚廣東2008幼果無3.754.251.889.897.750.137.883四112柚廣東2009幼果無6.336.611.8810.007.300.197.493四113柚廣東2009幼果無4.755.111.839.897.990.128.113四114柚廣東2010幼果無3.964.952.0110.2610.210.1610.372四115柚廣西2018幼果無6.937.722.7110.346.950.177.123四116柚廣西2018幼果無3.684.741.578.0010.090.1310.222四117柚廣西2018幼果無4.516.091.6512.264.460.074.534四118柚廣西2018幼果無3.454.421.477.7610.730.1410.872四119柚廣西2018幼果無7.168.421.9910.323.530.073.604四120柚廣西江口2007幼果無8.1310.422.8912.915.730.105.834不合格121柚廣西玉林2007幼果無3.974.801.8912.228.560.088.642四122柚廣西玉林2007幼果無4.626.021.6710.316.850.167.013四123柚廣西玉林2007幼果無4.024.661.669.7814.300.4714.771四124柚廣西玉林2007幼果無3.454.361.578.948.720.138.852四

總灰分測定結(jié)果如表2所示，不同類樣品總灰分沒有顯著差異，平均值為3.62%。27批樣品的浸出物檢測結(jié)果表明(表2)，不同基原及部位的醇溶性浸出物沒有顯著差異，平均值為27.20%。水溶性浸出物總平均值為42.44%，其中化州柚外果皮樣品的水溶性浸出物相對較低(平均值34.15%)，可能是因為除去了部分中果皮導(dǎo)致。

表2 化橘紅樣品總灰分、浸出物、特征圖譜檢測結(jié)果Table 2 The results of total ash, soluble extractives and characteristic chromatogram of Citri Grandis Exocarpium samples

3.1.3 特征圖譜 各類樣品的對照特征圖譜如圖3所示，結(jié)果表明，以化州柚為基原的樣品中呈現(xiàn)4個主要特征峰，經(jīng)確證分別為柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、異歐前胡素；而柚基原樣品僅有柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物3個主要特征峰。以柚皮苷峰(峰1)為S峰，計算野漆樹苷(峰2)、橙皮內(nèi)酯水合物(峰3)、異歐前胡素(峰4)的相對保留時間，結(jié)果如表2所示。

圖3 化橘紅特征圖譜色譜圖A:化州柚幼果; B:化州柚外果皮; C:柚幼果；峰1(S):柚皮苷; 峰2: 野漆樹苷; 峰3: 橙皮內(nèi)酯水合物; 峰4:異歐前胡素Fig.3 Characteristic chromatograms of Citri Grandis ExocarpiumA: immature fruit of Citrus grandis‘Tomentosa’; B: exocarp of C. grandis ‘Tomentosa’ ; C: immature fruit of C. grandis (L.)Osbeck ；Peak 1 (S):Naringin; Peak 2: Rhoifolin; Peak 3: Meranzin hydrate; Peak 4: Isoimperatorin

3.1.4 含量測定 黃酮類成分柚皮苷、野漆樹苷含量較高且為主要活性成分[4]，因此選擇柚皮苷、野漆樹苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。采用外標(biāo)法測定，并以二者之和作為總黃酮含量。經(jīng)過供試品制備方法及色譜條件考察選擇最優(yōu)條件，并進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果如表3所示。利用該方法對124批樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果(表1)表明，化州柚基原樣品中的w(柚皮苷)和w(野漆樹苷)分別為(8.13±2.74)%、(0.46±0.29)%，均顯著高于柚基原樣品中的(6.36±2.90)%、(0.12±0.08)%；化州柚幼果中w(柚皮苷)為(8.58±2.69)%, 顯著高于外果皮中的(6.97±1.94)%，但二者的w(野漆樹苷)分別為(0.44±0.30)%和(0.57±0.24)%，沒有顯著差異。

表3 柚皮苷、野漆樹苷含量測定方法學(xué)考察結(jié)果Table 3 Method validation for the determination of Naringin and Rhoifolin

3.2 對化橘紅基原的修改建議

3.2.1 化橘紅的歷史沿革 據(jù)考證，廣東的化橘紅，始種于梁朝，至今已有約一千五百年的歷史[5]?；偌t的來源為化州柚而不是橘。之所以稱為橘紅，是借助于宋、明以來橘紅的聲譽，后來又發(fā)現(xiàn)其功效優(yōu)于橘皮橘紅，所以冠名化州橘紅(又稱化橘紅)，以示區(qū)別。有關(guān)化橘紅的文字記載，始見于1675年(康熙十四年)《廣東通志》。其在高州府藥之屬類別下有如下記載：“粵中雖稱沃壤，然風(fēng)土淺薄賦質(zhì)柔脆，人物同之，至于靈奇珍異，物亦獨擅其美者，若化州之橘紅，增城之荔枝，瓊南之香犀、象貝”。1748年(乾隆十三年)的《化州志》中化州藥屬收載42味中藥的最后一味是化橘紅，并指出“化州惟橘紅最為佳品”。

化橘紅的原植物是化州柚而非橘，文獻(xiàn)有明確記載[2]，并對此進(jìn)行了討論。《廣東省化州志》卷十一引《橘紅辨》：“化州所產(chǎn)橘紅，醫(yī)家以之利氣化痰，功峻于他藥。(果實)有紅白瓤兩種，明明柚也，無毫發(fā)異，而混呼之曰橘，且飾其色曰紅。夫果有利于用，即存其名以著其實可也。奚必橘之貴而柚之賤哉。或曰柚誠柚也，何以他產(chǎn)不利于用，予曰此正所謂道地也?！薄稄V東省高州府志》清光緒十五年卷記載：“若夫化州之橘非橘也，柚也，天下之人皆橘之，吾亦不得不橘之?！?765年(乾隆三十年)趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》中，化橘紅正式單獨立目，與橘皮橘紅相區(qū)別。

清代中葉，化州全縣種植化州柚300多畝(1畝=0.067 hm2)。清末民初戰(zhàn)火頻繁，當(dāng)局不重視中藥的發(fā)展，導(dǎo)致化州柚果樹損失嚴(yán)重，到1949年時全縣僅存30多畝(1畝=0.067 hm2)。因化州柚瀕危滅絕，為保護(hù)珍貴植株，滿足臨床用藥需求，有人提出可將其他品種柚皮也作為化橘紅使用，自此化橘紅便出現(xiàn)了多基原。但是將柚皮作為化橘紅藥材使用的科學(xué)性，當(dāng)時就有學(xué)者提出質(zhì)疑[6]。

化橘紅首次出現(xiàn)在中國藥典是在1963年版，但是以柚類橘紅收載在“橘紅”項下。“橘紅”包括橘類橘紅和柚類橘紅，其中柚類橘紅又分為毛橘紅(化州柚)和光橘紅(柚)，二者的主要區(qū)別即果實外表面是否被茸毛。1977年版藥典將柚類橘紅單獨立項，首次收載“化橘紅”項，同樣包括化州柚和柚兩個基原，并一直沿用至今。

3.2.2 兩種基原藥材的差異 化州柚為柚的栽培變種，除具有柚的一般植物學(xué)特征之外，還具有“果被柔毛、果皮厚”的特異性特征[2]。從分子水平來看，化州柚與其近緣品種存在一定遺傳距離[7]。在化學(xué)成分上，化州柚所含成分的種類和含量均與柚有明顯區(qū)別。本研究結(jié)果表明，化州柚中含有一定量的異歐前胡素，在柚中沒有檢到(圖3)，化州柚中柚皮苷、野漆樹苷及總黃酮含量均顯著高于柚，這也與文獻(xiàn)報道一致[8-10]。此外，二者的藥效也有區(qū)別，在相同劑量下，化州柚的化痰和抗炎作用強度顯著大于柚[11]。

綜上所述，我們對化橘紅的歷史沿革進(jìn)行考證后認(rèn)為，化州柚是化橘紅最初的植物來源及道地品種。直至近代由于化州柚植物數(shù)量減少，為保證用藥需求，才將柚皮也作為化橘紅使用，柚是化州柚匱乏時出現(xiàn)的替代品。但是現(xiàn)代研究結(jié)果表明，化州柚與其他柚類品種存在遺傳距離，且其有效成分含量、藥效作用均明顯高于柚，因此柚不足以替代化州柚入藥。如今化州柚的種植面積快速擴大，產(chǎn)量大大提高，完全可以滿足市場需求?；蓁忠殉蔀榛莸牡乩順?biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，在化橘紅藥材銷售市場中占有很大比例，且價格高于柚基原的藥材10倍之多。為了避免用藥混亂、以次充好，我們建議將化州柚規(guī)定為化橘紅的唯一基原。

3.3 對化橘紅藥用部位的修改建議

通過歷史沿革考證，我們認(rèn)為化橘紅除了借“橘紅”之名，其炮制方法也效仿橘紅“去白取皮”，即除去部分中果皮，使用外層果皮入藥。由于化州柚皮厚肉酸沒有食用價值，在實際使用中，逐漸演變?yōu)橹苯邮褂梦闯墒煊坠胨帯；蓁钟坠址Q為橘紅珠或橘紅胎，同樣具有祛痰止咳作用[12]，在中藥大辭典中已有收載[13]?；蓁止麑嵱晒ず腿磕医M成，其中果皮又包括外果皮(最外層灰綠色部分)、中果皮(中間黃白色部分)和內(nèi)果皮(包裹瓤囊的薄膜)。中果皮所占的比例最大，其中柚皮苷、野漆樹苷等活性成分含量很高，將其除去則不利于資源的合理利用。本研究結(jié)果表明，化州柚幼果與外層果皮所含化學(xué)成分種類沒有差異，且幼果中有效成分柚皮苷和野漆樹苷含量更高。

經(jīng)過幾十年的市場流通，幼果已成為化州柚的主流加工規(guī)格，作為化橘紅藥材使用；而符合藥典規(guī)定的外層果皮藥材，市場上已非常少見。目前化州柚幼果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍空缺，為了規(guī)范化橘紅的市場流通，建議化橘紅的藥用部位對幼果進(jìn)行補充。

3.4 化橘紅等級標(biāo)準(zhǔn)的建立

化橘紅藥典標(biāo)準(zhǔn)檢測指標(biāo)單一且限度規(guī)定較低，無法評判藥材質(zhì)量優(yōu)劣。本研究對藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善，并建立等級標(biāo)準(zhǔn)，從而區(qū)分藥材基原、評價質(zhì)量優(yōu)劣。

3.4.1 基原的區(qū)分 化州柚果實外表面有茸毛，顯微鑒別可見碎斷的非腺毛，而柚中則觀察不到。特征圖譜中，化州柚呈現(xiàn)柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、異歐前胡素4個特征峰，而柚中僅有3個特征峰，無異歐前胡素色譜峰。以此可對化州柚和柚進(jìn)行區(qū)分。

3.4.2 質(zhì)量等級的劃分 將含量測定結(jié)果結(jié)合外觀性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，制定等級劃分依據(jù)。外觀參數(shù)選取平均直徑(表征大小)、橫縱截面直徑比(表征形狀)、果皮厚度/半徑比(表征果皮厚度及瓤囊大小)、外表面是否有茸毛(是為1，否為0)。七爪、五爪樣品為了與幼果保持一致，將其展平直徑換算為原幼果直徑(展平直徑=π×幼果直徑)。

采用SPSS19.0軟件對各參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。柚皮苷含量和果實直徑呈負(fù)相關(guān)(-0.632)，橫縱截面直徑比和外表面是否被毛呈正相關(guān)(0.628)，其余參數(shù)間沒有明顯的相關(guān)性。我們前期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，柚皮苷含量隨著果實直徑增大而呈現(xiàn)降低的趨勢[14]，因此果實大小與藥材內(nèi)在活性密切相關(guān)，應(yīng)該作為藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)之一。另外，橫縱截面直徑比越大，表示果實越扁圓，反之則表示越尖瘦。與柚的梨形果實不同，化州柚幼果一般呈球形，較扁圓，外表面也密布茸毛，這兩個外觀參數(shù)之間的相關(guān)性，恰恰與化州柚果實的特征相符；外表面是否被毛已作為區(qū)分基原的重要依據(jù)，且便于觀察，因此不再對橫縱截面直徑比進(jìn)行規(guī)定。而果皮厚度即瓤囊大小，沒有表現(xiàn)出與活性成分的相關(guān)性，因此在后續(xù)分析中不再包含。

表4 各參數(shù)間的相關(guān)矩陣Table 4 Correlation matrix among indexs

同時根據(jù)檢測結(jié)果對各樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(表1)，并進(jìn)一步利用K-均值聚類，找出各類中心參數(shù)(表5)，以此為依據(jù)設(shè)定等級劃分限度。結(jié)果表明，樣品被分為4大類，質(zhì)量由高到低，各類樣品批數(shù)分別為6、32、55、31。其中，大多數(shù)的化州柚外果皮及柚幼果樣品，被分在第3、4類。由于第一類包括的樣本較少，標(biāo)準(zhǔn)過高，因此其余第二類合并作為一等。以各中心參數(shù)下浮約20%作為相應(yīng)的限度，同時以柚皮苷和野漆樹苷含量之和作為總黃酮含量。

表5 化橘紅樣品K-均值聚類的最終聚類中心值Table 5 The final cluster centers of K-means cluster analysis of Citri Grandis Exocarpium samples

此外，水分、總灰分及浸出物含量因不同樣品差異不大，統(tǒng)一規(guī)定限度。水分、總灰分分別以平均值(10.44%、3.62%)上浮20%，規(guī)定不得過13.0%、5.0%?；偌t藥典標(biāo)準(zhǔn)中未包含浸出物檢查項，本研究進(jìn)行了補充。醇溶性浸出物以總平均值(27.20%)下浮20%，規(guī)定不得少于20.0%。化州柚外果皮樣品的水溶性浸出物相對較低，平均值為34.15%，可能是因為除去了部分中果皮；若以總平均值(42.44%)下浮20%作為限度，則外果皮樣品大多不合格，因此下浮30%作為限度，規(guī)定不得少于30.0%。

最終確定的質(zhì)量分級依據(jù)如表6所示，樣品等級劃分情況如表1、表6所示。另有10批不合格樣品，其中1批為化州柚幼果，總黃酮含量不達(dá)標(biāo)；9批為柚幼果，4批總黃酮含量不達(dá)標(biāo)，5批果實直徑過大。

表6 化橘紅等級標(biāo)準(zhǔn)Table 6 The grade standard of Citri Grandis Exocarpium

4 討 論

化橘紅在發(fā)展變遷中產(chǎn)生了多基原，對擴大藥源、滿足制藥工業(yè)需要、保障臨床用藥的需求有一定的作用，但同時卻導(dǎo)致了藥材品種混亂、質(zhì)量監(jiān)控困難等問題。柚是化州柚匱乏時出現(xiàn)的替代品，藥材品質(zhì)明顯低于化州柚，在化州柚已有能力滿足市場需求的情況下，應(yīng)當(dāng)對其正本清源，將化州柚規(guī)定為化橘紅的唯一基原。

化橘紅在實際使用中，藥用部位由外層果皮逐漸演變?yōu)槲闯墒煊坠??；蓁钟坠c外層果皮所含化學(xué)成分種類相同，且幼果中黃酮類成分含量更高，香豆素類含量較低。黃酮類是化橘紅止咳化痰的主要活性成分，香豆素類藥效貢獻(xiàn)較小，且對肝藥酶活性有抑制作用，可能會提高由于藥物相互作用導(dǎo)致的不良反應(yīng)風(fēng)險[15]。使用幼果更有利于充分利用化州柚資源。經(jīng)過幾十年的市場流通，化州柚幼果臨床療效確證，目前已成為化州柚的主流加工規(guī)格，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍處于空缺狀態(tài)。因此，建議化橘紅藥用部位對幼果進(jìn)行補充。

現(xiàn)有化橘紅中國藥典標(biāo)準(zhǔn)尚無法區(qū)分不同藥材基原，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行完善，增加了特征圖譜及多成分含量測定等項，提高標(biāo)準(zhǔn)的專屬性；并將外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量相結(jié)合，建立了化橘紅等級標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)可根據(jù)外觀性狀、顯微鑒別及特征圖譜，對不同基原進(jìn)行區(qū)分；并以果實直徑及總黃酮含量，對藥材質(zhì)量等級進(jìn)行劃分。等級劃分結(jié)果也表明化州柚幼果質(zhì)量普遍較高。

本研究通過梳理化橘紅多基原及多藥用部位的產(chǎn)生過程，并參考現(xiàn)代研究結(jié)果，認(rèn)為在基原上，有必要對化州柚和柚進(jìn)行區(qū)分，將化州柚作為唯一基原；在藥用部位上應(yīng)增加幼果。同時，本研究建立了化橘紅等級標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)可以區(qū)分藥材基原，判別質(zhì)量優(yōu)劣，為提高優(yōu)質(zhì)化橘紅藥材的競爭力，保護(hù)道地品種，促進(jìn)資源的合理利用提供了依據(jù)，也為化橘紅藥典標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了參考。