沈宇健，張 蕾，景思佳，劉 洋，張 帆

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院生物工程系，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；4.杭州市園林科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013）

樟芝Ganoderma camphoratum是臺灣地區(qū)特有珍貴食（藥）真菌。近年已證實(shí)的具有保肝、抗氧化、抗發(fā)炎、抗腫瘤、抗血小板凝集等作用[1-10]，其中主要生物活性成分有三萜類化合物，多糖、腺苷等[11]。但樟芝的自然生長條件苛刻，生長極為緩慢，再加上野生牛樟樹Cinnamomum kanehirai老樹更是罕見，導(dǎo)致其自然資源嚴(yán)重短缺，價格一路飆升，因此人工培養(yǎng)樟芝是未來發(fā)展的方向，只是不同的培養(yǎng)方法都有缺陷[12]。目前認(rèn)為椴木培養(yǎng)法所獲得的樟芝子實(shí)體功效最佳，該方法用樟芝原特有宿主牛樟樹椴木為培養(yǎng)基，可獲得與野生子實(shí)體相同的生物活性成分，尤其是三萜類化合物，但其存在培養(yǎng)時間長達(dá)1～ 3 a、培養(yǎng)成本較高，且發(fā)展樟芝的椴木培養(yǎng)法成為了牛樟樹被盜伐的主要原因，也讓原本就稀少的牛樟樹到了瀕臨絕種的地步[13-14]。雖然樟芝仍無法以椴木方式大量栽培子實(shí)體，但已可用固體及液體菌種培養(yǎng)方式進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)樟芝菌絲體。固體菌種培養(yǎng)法獲得的子實(shí)體具有與野生樟芝更為接近的生物活性，培養(yǎng)時間約3 個月[15]，但是此方法面臨不能去除木屑及其他不可食用部分、產(chǎn)量少，且周期長，不太適宜工業(yè)化生產(chǎn)。液體培養(yǎng)具有生長周期短、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在生物活性含量較低的問題，所以有關(guān)如何提高樟芝液體培養(yǎng)生物活性產(chǎn)物的研究報道就一直層現(xiàn)疊出。

本實(shí)驗(yàn)前期通過添加牛樟樹C.kanehirai，黃樟C.porrectum，華南桂C.austrosinense，樟C.camphora，山橿Lindera reflexa，香桂C.subavenium，銀木C.septentrionale，猴樟C.bodinieri，蘭嶼肉桂C.kotoense，浙江桂C.chekiangense，天竺桂C.japonicum，新木姜子Neolitsea aurata共12 種樟科Lauraceae 植物的提取物對樟芝液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明猴樟水提物對樟芝液體培養(yǎng)具有很好的促進(jìn)作用。但提取主要分布在樟科植物纖維內(nèi)側(cè)的活性成分，就必須克服表皮、纖維層，以及細(xì)胞壁的傳質(zhì)阻力，特別是結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞壁，是提取活性成分的主要障礙，現(xiàn)行的化學(xué)浸提等方法的效率不高且容易對人體有害[16]。因此迫切需要一種預(yù)處理方法，即可提高得率、縮短時間、且成本低對環(huán)境無害。經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、處理時間短且易于大規(guī)模生產(chǎn)的蒸汽爆破[17-20]（以下簡稱汽爆）預(yù)處理法是近年來逐漸發(fā)展起來的一種方法，使用一定壓力的水蒸氣、空氣等介質(zhì)對植物進(jìn)行爆破，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于制漿工業(yè)、動物飼料的生產(chǎn)，根據(jù)徐紅關(guān)于蒸汽爆破預(yù)處理紅柳Tamarix ramosissima的酶解發(fā)酵性能研究[18]，降低蒸汽壓力而延長維壓時間對提取效果更好，因此汽爆技術(shù)在對樟科植物的預(yù)處理中具有一定的可行性。本實(shí)驗(yàn)在汽爆壓力為2.00 MPa 的條件下，選擇7 個維壓時間來分析汽爆對于猴樟樹枝水提物的影響，以期優(yōu)化樟芝液體培養(yǎng)的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 樟芝，2012 年從臺灣自然科學(xué)博物館引進(jìn)，在浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用超低溫保藏法-80℃低溫保藏。

1.1.2 植物材料 2016 年10 月和2017 年10 月分別在杭州植物園采集樹齡10 a 以上的猴樟樹枝，由于樟芝僅生長在牛樟樹腐朽之心材內(nèi)壁或枯死倒地的牛樟木之陰暗潮濕面，故使用高枝剪剪取同一株樹的老枝，使用粉碎儀進(jìn)行粉碎至小碎片，粉碎后的總樹枝量在720.00 g 以上。

1.1.3 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）、樟腦油、95%乙醇、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、高氯酸、冰醋酸、香蘭素、香草醛、二氯甲烷、濃硫酸、蒽酮，均購自浙江常青化工有限公司，其中試劑類為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.1.4 試劑配制 0.80 mol·L-1重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：基準(zhǔn)重鉻酸鉀39.25 g·L-1；0.20 mol·L-1硫酸亞鐵溶液：硫酸亞鐵56.00 g·L-1，濃硫酸15.00 mL；鄰啡羅啉指示劑：鄰二氮菲11.46 g·L-1，硫酸亞鐵6.95 g·L-1；1.00%醋酸溶液：36.00%乙酸1.00 mL；72.00%硫酸溶液：98.00%硫酸652.00 mL；10.00%氯化鋇溶液：氯化鋇100.00 g·L-1；10.00%硫酸溶液：98.00%硫酸593.40 mL；20.00%碘化鉀溶液：碘化鉀200.00 g·L-1；1.00%淀粉溶液：淀粉10.00 g·L-1；0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液：硫代硫酸鈉49.60 g·L-1，碳酸鈉0.50 g；0.10 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液：硫代硫酸鈉24.80 g·L-1，碳酸鈉0.50 g；以上試劑配制的溶液均為去離子水。乙醇、乙醚混合液：乙醚 1.00 mL，乙醇 20.00 mL；醋酸、硝酸混合液：醋酸5.00 mL，硝酸5.00 mL。

1.1.5 培養(yǎng)基 菌種活化培養(yǎng)基：PDA 39.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，瓊脂10.00 g·L-1，pH 自然；液體一級培養(yǎng)基：PDB 24.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，pH 自然；液體二級培養(yǎng)基：PDB 24.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，pH 自然。

1.1.6 主要儀器 QBS-80 汽爆試驗(yàn)臺，鶴壁正道生物能源有限公司；紫外分光光度計(jì)UV-5500PC，上海元析儀器有限公司；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；真空冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，美國waters 公司；無菌操作臺，蘇州佳寶凈化工程設(shè)計(jì)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 汽爆處理 將粉碎并放置于烘箱50℃烘干至恒質(zhì)量后的猴樟樹枝進(jìn)行汽爆，每次投料量為90.00 g 左右，加熱介質(zhì)為150～ 180℃飽和水蒸汽，汽爆壓力為2.00 MPa，按120，180，240，300，360，420，480 s 共7 個維壓時間分7 個實(shí)驗(yàn)組，汽爆后，再放置于烘箱50℃烘干，干燥保存，對照組為同樣放置于烘箱50℃烘干至恒質(zhì)量但未汽爆的猴樟，共8 個組。

1.2.2 樹枝提取物制備 將8 個組的猴樟，各取16.00 g 分別加入400.00 mL 的去離子水中，100℃水浴1 h，過濾，再將濾渣加入400.00 mL 的去離子水，100℃水浴1 h，過濾后將2 次濾液合并，真空冷凍干燥后，保存在4℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 掃描電鏡 8 個組各取一小片烘干后的猴樟，用黑色導(dǎo)電膠固定于玻片上，放入儀器進(jìn)行掃描。

1.2.4 碳元素的測定 8 個組各取0.010 g 的樣品放入硬管，加5.00 mL 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液和5.00 mL 濃硫酸并轉(zhuǎn)移至試管。油浴加熱，油浴溫度為170～ 180℃，保持溶液沸騰5 min。取出并冷卻后進(jìn)行滴定，指示劑為鄰啡羅啉，滴定液為硫酸亞鐵溶液，滴定終點(diǎn)為溶液從橙黃變到棕紅色時。同時以加0.10～ 0.50 g 的石英砂作為空白對照進(jìn)行空白滴定，記錄硫酸亞鐵的用量（V0），并以重量法測定樣品水分，根據(jù)公式（1）計(jì)算出含碳量。每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。

式中，0.800 0 為1/6 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；0.003 為1/4 碳原子的摩爾質(zhì)量，g·mol-1；1.1 為氧化校正系數(shù)；V0為空白滴定用去硫酸亞鐵溶液的體積，mL；V為滴定試樣用去硫酸亞鐵溶液的體積，mL；m為風(fēng)干試樣質(zhì)量，g；K為將風(fēng)干試樣換算成烘干試樣的水分換算系數(shù)。

1.2.5 氮元素的測定 8 個組各稱取1.00～ 2.00 g 的樣品，放入裝有10.00 mL 硝酸、20.00 mL 濃硫酸的消化管，加入0.20 g 硫酸銅和6.00 g 硫酸鉀，進(jìn)行消化并升溫：140℃維持30 min，320℃維持10 min，420℃維持40 min。然后使用凱氏測氮儀測定含氮量[21]。每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.6 木質(zhì)素的測定 8 個組各稱取 0.050 g 的樣品于離心管中，加入1%的醋酸溶液10.00 mL，離心15 min。加3.00～ 4.00 mL 乙醇、乙醚混合液，浸泡3 min，棄去上清液，浸洗3 次。沉淀于100℃水浴蒸干，加入72%硫酸3.00 mL，靜置16 h。加入10.00 mL 蒸餾水，100℃水浴5 min，冷卻。加入5.00 mL 蒸餾水和10%的氯化鋇溶液0.50 mL，離心15 min。沉淀用蒸餾水沖洗2 次，加入10%的硫酸10.00 mL 和0.025 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL，100℃水浴15 min，并攪拌。冷卻并進(jìn)行滴定，指示劑為5.00 mL 20%的碘化鉀溶液，滴定液為0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液變?yōu)樽丶t色時。滴定結(jié)束后，再加入1.00 mL 1%的淀粉溶液作為指示劑，滴定液仍為0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液從藍(lán)色變?yōu)榱辆G色時。同時以未加樣品，加入10%的硫酸10.00 mL 和0.025 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL 作為空白對照進(jìn)行空白滴定作為驗(yàn)證。根據(jù)公式（2）計(jì)算木質(zhì)素含量。每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。

式中，K為硫代硫酸鈉的濃度，mol·L-1；a為空白滴定所消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；b為溶液所消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；N為所取鋸末的質(zhì)量，g；48 為1 mol C6H10O5相當(dāng)于硫代硫酸鈉（一定濃度）的滴定度。

1.2.7 纖維素的測定 8 個組各稱取0.10 g 的樣品于試管中，加入5.00 mL 醋酸、硝酸混合液，100℃水浴30 min，轉(zhuǎn)移至離心管，加去離子水，冷卻并離心15 min，棄去上清液，離心3 次，烘干。取烘干樣加入0.50 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL 和濃硫酸8.00 mL，搖勻，100℃水浴15 min，冷卻并進(jìn)行滴定，指示劑為20%的碘化鉀溶液5.00 mL，滴定液為0.10 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液變?yōu)樗{(lán)色，且半分鐘內(nèi)不褪色，再以未加樣品作為空白對照進(jìn)行空白滴定。根據(jù)公式（3）計(jì)算纖維素含量。每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。

式中，K為硫代硫酸鈉濃度，mol·L-1；a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積，mL；b為溶液滴定所耗硫代硫酸鈉體積，mL；N為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.8 菌株培養(yǎng)

1.2.8.1 活化菌株 對低溫保存的菌株采用菌種活化培養(yǎng)基的方式進(jìn)行活化。把配制好的菌種活化培養(yǎng)基放入滅菌鍋內(nèi)，在121℃，0.10 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫，在無菌條件下，將菌株接入培養(yǎng)基，置于人工智能氣候箱，28℃避光培養(yǎng)15 d，于-4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8.2 液體一級培養(yǎng) 分別將配制好的100.00 mL 液體一級培養(yǎng)基放入250.00 mL 的錐形瓶中，分別添加8 個組的猴樟水提物各40.00 mg，在121℃，0.1 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫；在無菌條件下接入活化好的菌種，轉(zhuǎn)接量為每瓶2 粒（2×1 cm2），并封口。置于搖床（120 r·min-1，28℃）震蕩培養(yǎng)4d，促進(jìn)菌絲體的生長。每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.8.3 液體二級培養(yǎng) 分別將配制好的100.00 mL 液體二級培養(yǎng)基放入250.00 mL 的錐形瓶中，并在二級培養(yǎng)基中分別添加8 個組的猴樟水提物各40.00 mg，在121℃，0.10 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫；在無菌條件下接入培養(yǎng)4 天后的一級培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接量為二級培養(yǎng)基的10%，置于搖床（120 r·min-1，28℃）震蕩培養(yǎng)4 d，進(jìn)行菌絲體的擴(kuò)大培養(yǎng)。每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.9 生物量的測定 取二級液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵液，用3 層200 目的尼龍網(wǎng)過濾，得到菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體3 次后，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后，研磨成粉，分別測定樟芝菌絲體粉末的干重，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 總?cè)坪繙y定 取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基與對照組培養(yǎng)基上生長并過濾冷凍干燥后的樟芝菌絲體，研磨成粉，測定總?cè)频暮?。參照陸震鳴等[22]的方法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸顯色法測定。測定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～ 700 nm 波長處進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在550 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長設(shè)定為550 nm。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱取齊墩果酸10.00 mg，置于50.00 mL 容量瓶，加二氯甲烷定容至刻度，配制成濃度為0.20 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確量取濃度為0.20 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00，0.10，0.20，0.50，1.00，1.50 mL，分別放入具塞磨口試管中，加熱去除溶劑，然后各加入0.30 mL 的5%香草醛—冰醋酸溶液和1.00 mL 高氯酸，加塞。于60℃恒溫水浴20 min，取出后立即用冰水冷卻，再分別加入5.00 mL 冰醋酸，在漩渦混合器混合均勻，在550 nm 處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液及總?cè)茰y定：取樟芝菌絲體粉末0.10 g 于10.00 mL 的蒸餾水中，于100℃水浴回流2 h，冷卻后以1:4 的比例加入無水乙醇，置于4℃沉淀過夜，抽濾，取其濾液各1.00 mL，置于3 個磨口試管中，加熱蒸干溶劑，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值，計(jì)算不同培養(yǎng)基樟芝菌絲體中總?cè)坪?。根?jù)下式計(jì)算總?cè)频寐剩?/p>

式中，X為樣品中總?cè)祁惡浚琯·100g-1；M1為樣品的質(zhì)量，g；M2為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的測定用樣液三萜類含量，mg；V1為待測液定容的體積，mL；V2為待測用的樣液體積，mL。

1.2.11 多糖含量測定 取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基與對照組培養(yǎng)基上生長并過濾冷凍干燥后的樟芝菌絲體，研磨成粉，測定多糖含量。參照《中國藥典》的多糖測定方法[23]，以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚—硫酸法測定。測定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～ 800 nm 波長處進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在620 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長設(shè)定為620 nm 。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg 定容于1 000.00 mL，配制成濃度為0.10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確吸取0.10%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL，分別放入具塞磨口試管中，分別加水至1.00 mL，各加5.00 mL 蒽酮試劑，震蕩混勻，水浴20 min，取出冷卻至室溫，在620 nm 處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液及胞內(nèi)多糖測定：取樟芝菌絲體粉末0.20 g 于20.00 mL 的蒸餾水中，80℃水浴加熱2 h，冷卻，然后加入1:4 體積的無水乙醇混勻，置于4℃沉淀過夜，離心分離沉淀、過濾，除去濾渣，得樟芝粗多糖樣品溶液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值，計(jì)算多糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，DPS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 為差異顯著，以P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同維壓時間猴樟組織結(jié)構(gòu)的研究

汽爆預(yù)處理可以有效的改變猴樟木質(zhì)纖維的天然結(jié)構(gòu)，隨著汽爆時間的延長，反應(yīng)的激烈程度不斷增加，導(dǎo)致猴樟的顏色由原來的褐色逐漸過渡到黑色，外形也由原來的塊狀過渡到纖維狀。根據(jù)文獻(xiàn)記載[24]，纖維素完全降解的溫度約360℃，木質(zhì)素的降解溫度在280～500℃。雖然本實(shí)驗(yàn)汽爆過程的蒸汽溫度在 150～ 180℃之間，并沒有到讓纖維素和木質(zhì)素可以完全降解的程度，但不同的維壓時間也會讓纖維素、木質(zhì)素發(fā)生不同程度的降解。

圖1 為不同汽爆時間猴樟組織結(jié)構(gòu)在掃描電鏡下的圖片（×1 000 倍）。從圖1 中可以看出不同汽爆時間預(yù)處理過的猴樟有明顯的不同。圖1（A）為未汽爆過的樣品，標(biāo)明粗糙，纖維束結(jié)合緊密；圖1（B）為汽爆120 s，組織變得松散，纖維表面開始出現(xiàn)裂紋；圖1（C）為汽爆180 s 后，組織的空腔開始增大，纖維表面出現(xiàn)更多的裂紋和裂片；圖1（D）為汽爆240 s 后，纖維束間發(fā)生分離，表面的孔增多；圖1（E）汽爆300 s 后，可以明顯看到纖維的斷裂；圖1（F）汽爆360 s 后、（G）為汽爆420 s 后，樣品表面出現(xiàn)微孔；圖1（H）汽爆480 s 后，結(jié)合在纖維束周圍的細(xì)小纖維消失，表面出現(xiàn)更多微孔。文獻(xiàn)顯示對植物的提取過程中傳質(zhì)過程是關(guān)鍵的限速步驟。汽爆預(yù)處理后，猴樟樹枝破碎成更小的碎塊，且表面造成很多微孔，可以增加提取效率[20]。

圖1 不同汽爆時間猴樟的掃描電鏡圖Figure 1 Pictures by scanning electron microscope of C.bodinieri after different duration of steam explosion

2.2 不同維壓時間對猴樟纖維素、木質(zhì)素含量的影響

一般植物纖維素占40%～ 50%，木質(zhì)素占20%～ 30%，均是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素是一種不溶于水及一般有機(jī)溶劑的大分子多糖，被木質(zhì)素包裹，占植物界碳含量的50%以上；木質(zhì)素是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維素等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì)，具有某些側(cè)鏈的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，很難分解。因此，纖維素、木質(zhì)素阻礙了植物的提取。汽爆是依靠一定壓力的飽和蒸汽對汽爆缸里的物料進(jìn)行加熱和滲透，再突然將物料置于一定的大氣壓力下，從而完成纖維素和木質(zhì)素有選擇性的分離，所以汽爆的維壓時間對其處理的效果起到?jīng)Q定性的作用。圖2 是蒸汽壓力在2.00 MPa 時，不同的維壓時間對纖維素和木質(zhì)素的影響，從圖2 可見由于維壓時間越長汽爆的強(qiáng)度就越大，對猴樟的纖維素和木質(zhì)素的破壞力就越大。

纖維素在120 s 的時候與未汽爆呈現(xiàn)的是下降的趨勢，這可能是一下汽爆之后，壓力和溫度的同時作用，造成纖維性的降解，在120～180 s 的時候纖維素含量開始增加，維壓時間在240 s 時，纖維素含量基本維持不變，在300～480 s 時間段內(nèi)，纖維素含量持續(xù)呈上升趨勢，最高在480 s 時達(dá)到58.20 %。而隨著維壓時間的增加，猴樟中的木質(zhì)素含量持續(xù)呈上升趨勢。造成這一現(xiàn)象的原因估計(jì)是猴樟本身的特殊性，猴樟是慢生樹種，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、紋理細(xì)密，木質(zhì)素含量較高，且木質(zhì)素的降解溫度在280～ 500℃，短時間的維壓時間，不能有效的破壞木質(zhì)素。對猴樟進(jìn)行汽爆預(yù)處理有效提高了纖維素的有效含量，同時也有效破壞了猴樟的木質(zhì)天然結(jié)構(gòu)，增加了猴樟作為提取物料的比表面積，以利于后續(xù)的提取。

圖2 不同維壓時間對猴樟纖維素和木質(zhì)素的影響Figure 2 Effect of different duration of steam explosion on cellulose and lignin of C.bodinieri

2.3 不同維壓時間對猴樟碳、氮含量的影響

表1 是在不同維壓時間內(nèi)碳、氮含量以及碳氮比。從表1 中可以看出隨著維壓時間的增加，碳、氮含量總體趨勢是呈上升的，這也和圖2 中纖維素和木質(zhì)素含量的情況一致，汽爆預(yù)處理破壞了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，且維壓時間越長破壞的程度就越大，更減少木質(zhì)素對纖維素的包裹作用。

碳源、氮源在生物的生長過程中起著非常重要的作用，研究表明，過高或過低的碳氮比均不利于細(xì)胞的生長，濃度過高，不利于產(chǎn)物的積累。在未汽爆前，猴樟樹枝的碳氮比為89，汽爆后由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，引起細(xì)胞內(nèi)含物的溢出，氮含量隨之上升，使得碳氮比持續(xù)下降，在300 s 時下降到真菌培養(yǎng)基的理想水平25，而到480 s 時已降到16，因此，后續(xù)可用汽爆預(yù)處理后的猴樟樹枝作為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)樟芝。

表1 不同維壓時間對猴樟碳、氮含量以及碳氮比的影響Table 1 Effect of different duration of steam explosion on carbon,nitrogen content and carbon-nitrogen ratio of C.bodinieri

2.4 不同維壓時間的猴樟水提物對樟芝液體培養(yǎng)總?cè)啤⒖偠嗵呛康挠绊?/h3>

從圖3 中可見，與對照猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體相比，在液體培養(yǎng)基中添加汽爆預(yù)處理的猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體，均呈現(xiàn)出不同程度促進(jìn)總?cè)坪康淖饔?，其中維壓時間在120～ 300 s，菌絲體總?cè)坪砍掷m(xù)上升，并在300 s 達(dá)到最高值2.90%，比對照組提高了16.80%，而維壓時間在360～ 480 s，總?cè)坪砍掷m(xù)下降，到480 s 時比300 s 的總?cè)坪肯陆盗?.50%，但仍比對照組提高了13.90%。從圖4 可見，與對照猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體相比，在液體培養(yǎng)基中添加汽爆預(yù)處理的猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體，總多糖含量持續(xù)上升。480 s 維壓時間時總多糖含量到最高值2.80%，比對照組提高25.00%。由此可見，汽爆預(yù)處理對猴樟的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞，有效提高了猴樟的水提效果，間接促進(jìn)了樟芝液體培養(yǎng)菌絲體的總?cè)?、總多糖的含量。雖然目前測定的總?cè)?、總多糖是液體培養(yǎng)樟芝菌絲體的粗提物，但也可以間接反映出汽爆后的猴樟水提物有效促進(jìn)了樟芝液體培養(yǎng)時分泌一些活性成分。

圖3 不同維壓時間的猴樟水提物對樟芝液體培養(yǎng)菌絲體總?cè)坪康挠绊慒igure 3 Effect of water extract from C.bodinieri treated by different explosion duration on total triterpene content of mycelium in liquid culture of G.camphoratum

圖4 不同維壓時間的猴樟水提物對樟芝液體培養(yǎng)菌絲體總多糖含量的影響Figure 4 Effects of water extract from C.bodinieri treated by different explosion duration on total polysaccharide content of mycelium in liquid culture of G.camphoratum

3 結(jié)論與討論

高效、清潔預(yù)處理是給培養(yǎng)基添加促進(jìn)因子的首要步驟，現(xiàn)在常用的化學(xué)法存在化學(xué)品消耗、環(huán)境污染和有毒害等的壓力，與其相比，汽爆具有處理時間短、污染少和無毒害等的優(yōu)點(diǎn)，具有研究和發(fā)展的前景。

汽爆前后猴樟的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，顏色也明顯變深，推測是由于纖維降解產(chǎn)生的糖類與猴樟樹枝中的某些物質(zhì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)。隨著維壓時間的增加，汽爆后猴樟樹枝的細(xì)小碎塊量明顯增加，掃描電鏡圖中可以看出大的碎塊斷裂成小的纖維束，這是由于一些物理化學(xué)變化加速了纖維等的降解。且汽爆預(yù)處理的強(qiáng)大機(jī)械力一定程度上破壞了猴樟的細(xì)胞壁，更加便于之后的浸潤，提取。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出汽爆預(yù)處理是一種有效方法，經(jīng)過蒸汽爆破處理后各組分含量顯著變化，破壞猴樟的木質(zhì)天然結(jié)構(gòu)，提高纖維素、木質(zhì)素、碳和氮含量，降低碳氮比，且添加汽爆預(yù)處理之后的猴樟水提物到樟芝液體培養(yǎng)基中，7 個組均可以有效提高菌絲體的總?cè)坪涂偠嗵呛?，最高值比對照組分別提高了16.80%和25.00%。當(dāng)維壓時間在300 s 時，總?cè)频暮孔畲?，隨著維壓時間的增加而略微有點(diǎn)下降，排除實(shí)驗(yàn)誤差的可能性，本實(shí)驗(yàn)采用2.00 MPa 的蒸汽壓力對應(yīng)的蒸汽溫度為150～ 180℃，而纖維素、木質(zhì)素的完全降解溫度都在280℃之上，推測蒸汽壓力不夠?qū)е聦w維素和木質(zhì)素的破壞不夠，這就證實(shí)了維壓時間只是破壞猴樟細(xì)胞壁提高活性物質(zhì)提取率的主要因素之一。近年來的研究表明降低蒸汽壓力而延長維壓時間的提取效果更好，故本實(shí)驗(yàn)僅采用單因素即只考慮汽爆不同的維壓時間對猴樟樹枝水提物的影響，造成這個現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橹捌瑧?yīng)用在秸稈等木質(zhì)素含量低的植物為主，對木質(zhì)素含量較高的植物來說，質(zhì)地更為堅(jiān)硬，延長維壓時間不能有效的軟化物料，效果不如提高蒸汽壓力，今后需要將二者整合為強(qiáng)度系數(shù)來作為汽爆預(yù)處理的綜合指標(biāo)，便于后續(xù)最佳的工藝參數(shù)確定。