王海燕，菅 端，范桂枝，張李香

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種帶有臭雞蛋味的氣體，是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后發(fā)現(xiàn)的第3 種氣體信號分子[1]。H2S 在動物方面的研究較為深入，而在植物中的研究才剛剛起步。在植物中H2S 的主要合成酶為半胱氨酸脫巰基酶，在L-或D-半胱氨酸脫巰基酶（磷酸吡哆鹽依賴性酶）的作用下催化半胱氨酸降解成H2S、丙酮酸鹽和NH4[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，H2S 可以促進種子的萌發(fā)，根器官的發(fā)生，光合作用的增強，調(diào)節(jié)花的衰老過程和氣孔運動過程[3-6]；H2S 提高了植物處于非生物脅迫下的耐性[7]，植物在干旱、高鹽與重金屬脅迫下的響應(yīng)都受到H2S 的調(diào)節(jié)[8-11]。由此可見，H2S 在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及植物抵御環(huán)境脅迫方面的研究取得了一定進展。

H2S 是硫代謝的中間產(chǎn)物之一，植物在硫素充足的狀態(tài)下可以釋放H2S。H2S 還可以調(diào)控硫代謝相關(guān)物質(zhì)的含量，如H2S 供體（NaHS）處理上調(diào)了半胱氨酸，谷胱甘肽和內(nèi)源H2S 水平，同時上調(diào)了O-乙酰-絲氨酸巰基裂合酶與L-半胱氨酸脫巰基酶活性[12]。H2S 與NO 在許多生理過程中都有著相互作用，Wang 等的研究表明，外源施加H2S 促進種子萌發(fā)的現(xiàn)象與產(chǎn)生的NO 相關(guān)[13]，H2S 是否也與氮代謝相關(guān)還有待考證。

本研究將不同濃度的外源H2S 供體NaHS 添加到白樺Betula platyphylla懸浮培養(yǎng)體系中，分析不同濃度的H2S 供體對白樺懸浮細胞體系的pH 值、電導(dǎo)率、丙二醛含量、超氧陰離子含量、硫代謝和氮代謝的影響，為揭示外源H2S 對植物細胞生理代謝的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白樺懸浮細胞系的培養(yǎng)

產(chǎn)白樺酯醇的白樺懸浮細胞系由東北林業(yè)森林生物工程研究室選育。懸浮細胞的培養(yǎng)基為B5 附加0.1 mg·L-16-benzyladenine（6-BA）和0.01 mg·L-1thidiazuron（TDZ）以及20 g·L-1蔗糖，滅菌前調(diào)pH 至5.5～ 6.0。100 mL 搖瓶中盛50 mL 培養(yǎng)液，每瓶接種6 g 愈傷組織，培養(yǎng)溫度為25～ 27℃，光照強度為2 000 lx，光照16 h·d-1，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。實驗中所用的白樺懸浮細胞已經(jīng)過50～ 60 次繼代培養(yǎng)，具有穩(wěn)定的形態(tài)特征和生長速率。

1.2 外源H2S 供體的添加

將0 mmol·L-1（CK，無菌水），0.5 mmol·L-1，1 mmol·L-1，5 mmol·L-1無菌的NaHS（分析純）溶液添加到培養(yǎng)8 d 的白樺懸浮培養(yǎng)體系中，在處理后0～ 5 d 取樣分別測定白樺懸浮細胞培養(yǎng)液pH 值、電導(dǎo)率，白樺懸浮細胞中丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子含量，ATP 硫酸化酶（ATPS）活性及谷胱甘肽(GSH)含量等硫代謝相關(guān)指標(biāo)，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量及硝酸還原酶（NR）與谷氨酸合成酶（GS）的活性等氮代謝相關(guān)指標(biāo)。對照加入等體積的無菌水，每種處理重復(fù)3 次。添加的NaHS 溶液采用無菌的0.45 μm 微孔濾膜進行過濾除菌。

1.3 測定方法

使用pH 計與電導(dǎo)儀（昆明市雷茲電導(dǎo)率儀廠）測定pH 值與電導(dǎo)率。MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[14]。超氧陰離子測定采用羥胺氧化法[15]。硫代謝相關(guān)生理指標(biāo)測定參照高吉霞[16]的方法，谷胱甘肽使用南京建成試劑盒測定。氮代謝相關(guān)生理指標(biāo)測定參照王媛媛[17]的方法，銨態(tài)氮測定方法使用水楊酸-次氯酸鹽分光光度法[18]。

測定ATPS 使用磷酸根做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.089 1x+0.001 4，R2=0.997 8。

硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=7.987 9x+0.061 6，R2=0.999 9。

銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.157 1x+0.012 7，R2=0.997 8。

NR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.013 5x+0.002 8，R2=0.999 3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復(fù)3 次，應(yīng)用Excel 和SPSS 軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHS 處理對白樺懸浮細胞培養(yǎng)液pH 值和電導(dǎo)率的影響

NaHS 處理對白樺懸浮培養(yǎng)液pH 值和電導(dǎo)率的影響如圖1 所示，1 mmol·L-1NaHS 處理第2 天、5 mmol·L-1NaHS 處理第1 天、第4 天和第5 天的pH 值顯著高于CK（P＜0.05）；5 mmol·L-1NaHS 處理第1 天、第2 天、第4 天和第5 天時的電導(dǎo)率值顯著高于CK（P＜0.05）。另外，5 mmol·L-1NaHS 處理第3 天時pH 值和電導(dǎo)率雖均高于CK，但與CK 的差異均未達到顯著水平。由此可見，pH 值和電導(dǎo)率對NaHS 處理的響應(yīng)存在濃度和時間效應(yīng)。

圖1 NaHS 處理對白樺懸浮細胞培養(yǎng)液pH 值和電導(dǎo)率的影響Figure 1 Effect of NaHS on pH and electrical conductivity in cell suspension culture of B.platyphylla

2.2 NaHS 處理對白樺懸浮細胞MDA 和超氧陰離子含量的影響

如圖2A 所示，與同期CK 相比，1 mmol·L-1和5 mmol·L-1NaHS 均對MDA 含量產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05），其中5 mmol·L-1NaHS 處理后，MDA 含量呈上升的趨勢，而0.5 mmol·L-1NaHS 處理，僅在處理的4～ 5 d 時差異達顯著水平（P＜0.05），呈降低趨勢；細胞內(nèi)的超氧陰離子對NaHS 處理的響應(yīng)趨勢為，處理0～ 2 d 時差異未達到顯著水平，處理3～ 5 d 差異均達到顯著水平（P＜0.05），且一直呈上升趨勢（圖2B）。

圖2 NaHS 處理對白樺懸浮細胞中MDA 和超氧陰離子含量的影響Figure 2 Effect of NaHS on MDA and O2-in cell suspension culture of B.platyphylla

2.3 NaHS 處理對白樺懸浮細胞中ATPS 活性與GSH 的影響

如圖3 所示，ATPS 的活性總體呈現(xiàn)下降的趨勢。處理組的ATPS 活性總體高于CK，在處理處理濃度為0.5 mmol·L-1與1 mmol·L-1時，ATPS 的活性出現(xiàn)了先上升后下降的結(jié)果，在0.5 mmol·L-1與1 mmol·L-1NaHS 處理后2 d，ATPS 的活性達到極值，分別比CK 顯著增高了24%與22%（圖3A）。除第5 天外，隨著NaHS 處理濃度的增高，GSH 含量也呈增加趨勢。其中5 mmol·L-1NaHS 處理后0 d 達到了峰值，比CK 顯著增高117.87%（圖3B）。

圖3 NaHS 對白樺懸浮細胞內(nèi)ATPS 活性與GSH 含量的影響Figure 3 Effect of NaHS on the activity of ATPS and the content of GSH in cell suspension culture of B.platyphylla

2.4 H2S 處理對白樺懸浮細胞硝銨態(tài)氮、NR 與GS 的影響

如圖4A 所示，不同濃度的NaHS 處理后第0 天，第1 天和第5 天均增加了硝態(tài)氮含量，而在第2 天至第4天變化趨勢不同。其中5 mmol·L-1NaHS 處理第4 天時 達到最高值，比對照顯著增加了32.1%；圖4B 所示，不同濃度NaHS 處理0～ 5 d 均顯著增加了銨態(tài)氮含量，其中5 mmol·L-1NaHS 處理第5 天達到峰值，比CK 顯著增加了801.9%；圖4C 所示，0.5 mmol·L-1NaHS 處理0～ 5 d 均未對NR 活性產(chǎn)生顯著影響，而1 和5 mmol·L-1NaHS 處理增加了NR 活性（除第4 天外）。其中1 mmol·L-1NaHS 處理第2 天達到峰值，比CK 顯著增加了53.0%；圖4D 所示，除第0 d 外，1 和5 mmol·L-1NaHS 處理未對GS 活性產(chǎn)生顯著影響，雖然1 mmol·L-1NaHS 第5 天達到最高值，但與對照相比未達到顯著差異水平。

圖4 NaHS 對白樺懸浮細胞內(nèi)硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及對NR、GS 活性的影響Figure 4 Effect of NaHS on the content of nitrate nitrogen and ammonium nitrogen,the activity of NR and GS in cell suspension culture of B.platyphylla

3 結(jié)論與討論

無機態(tài)的硫素進入植物后的第一步反應(yīng)就是在ATPS 的激活作用下生成磷酸腺苷（APS），ATPS 是無機硫素進入植物體后的第一個硫代謝相關(guān)酶。而在硫代謝中H2S 是半胱氨酸合成中重要的中間產(chǎn)物，H2S 進一步被還原為半胱氨酸，半胱氨酸進一步合成GSH 或蛋白[19]。王紫晴等的研究表明，H2S 處理提高了白樺懸浮細胞中多胺和次生代謝物含量，H2S 與多胺共同處理可進一步促進次生代謝物的累積[20]。Miginiac-Maslow 等發(fā)現(xiàn)最適濃度H2S 處理后，菠菜的GSH 含量增加[21]。同時發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的乙烯與NO 參與下調(diào)H2S 水平[22]，H2S 誘導(dǎo)的氣孔開閉過程中，有NO 的積累[23]。H2S 對硫代謝和氮代謝的影響還未見詳細報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率、MDA 含量與超氧陰離子等對NaHS 處理的響應(yīng)存在濃度和時間效應(yīng)，0.5 mmol·L-1NaHS 處理未對白樺懸浮細胞產(chǎn)生顯著響應(yīng)，隨著處理濃度的增加呈增加趨勢?？梢姡?.5～1.0 mmol·L-1低濃度NaHS 未對白樺懸浮細胞造成傷害，濃度大于1 mmol·L-1將對白樺懸浮細胞產(chǎn)生不同程度的傷害，表現(xiàn)為超氧陰離子濃度增加，有機物外滲等。相同處理下，不同濃度的NaHS 處理增加了ATPS 活性、GSH 含量、硝態(tài)氮含量、氨態(tài)氮含量以及NR 與GS 活性。由此可見，NaHS 處理可以改變白樺懸浮細胞中的硫代謝和氮代謝。

綜上還可知，H2S 不僅可以促進白樺懸浮細胞的硫、氮代謝，并且在0.5 mmol·L-1NaHS 處理下對硫氮代謝的促進作用最強。同時發(fā)現(xiàn)，NaHS 促進了下游的GSH 與半胱氨酸的形成，中間產(chǎn)物的減少又促進了硫素的還原。另外，H2S 對白樺懸浮細胞的硫、氮代謝的影響趨勢基本相同，二者可能存在正相關(guān)關(guān)系。同時推測H2S與NO 的相互關(guān)系影響了氮代謝水平，但還需要進一步實驗驗證。