周芳，王曉尉，傅龍龍，2，谷翊群,2，梁小薇，許蓬，張愛萍，溫子娜，王瑞雪，盧文紅*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，WHO人類生殖合作研究中心，國家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點實驗室，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3.沈陽東方菁華醫(yī)院，沈陽 110005；4.蘭州大學第一醫(yī)院生殖醫(yī)學專科醫(yī)院，蘭州 730000；5. 成都西囡婦科醫(yī)院，成都 610000；6.吉林大學第一醫(yī)院，長春 130021)

精液分析是評價男性生育力和檢測男性不育癥的重要手段。目前，各實驗室精液分析檢測方法標準化的程度不盡相同，內(nèi)部質量控制和外部質量控制制度尚不完善，使得各個實驗室之間檢測結果的可比性較差[1]。精液分析在實驗室內(nèi)部應遵循標準化程序進行，同時必須進行外部質控，保證精液分析實驗室質控制度的充分建立，確保男科診斷技術的可持續(xù)發(fā)展。雖然精液分析標準化實施起來非常困難，但精液分析質量控制是保證分析結果準確的必要條件[2]。精液分析的質量控制越來越受到行業(yè)專家和學者的重視，部分地區(qū)的實驗室也在開展精液分析質量控制，但取得的效果并不明顯，精液分析的質量控制需要進一步加強[3-6]。在鼓勵和幫助各單位進行內(nèi)部質控的同時，逐步開展和完善精液分析的外部質控。

自2011年起，國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所組織《WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊(第5版)》(以下簡稱WHO-5)精液分析標準化培訓[7]，2017年我們在北京、四川、遼寧、甘肅和吉林共五個省市開展了精液分析標準化培訓，共200多名男科、生殖中心和精子庫實驗室技術人員接受了理論與手把手教授實驗操作相結合的培訓。因此，本研究在WHO-5標準化培訓和內(nèi)部質量控制的基礎上，在全國四省一市的精液分析實驗室，采取集中發(fā)放標準品和集中分析的方式，根據(jù)WHO-5精液分析標準化方法，建立精子濃度、精子存活率、精子活動力和精子濃度分析的外部質量控制網(wǎng)絡，更好地在各個精液分析實驗室中每年進行常規(guī)的外部質量控制監(jiān)測，實現(xiàn)各實驗室之間的可比性，完善男科診斷技術室的規(guī)范化和標準化分析與建立。

資料與方法

一、研究對象

2017年在遼寧省沈陽市沈陽菁華醫(yī)院、甘肅省蘭州市蘭州大學第一醫(yī)院、四川省成都市西囡婦科醫(yī)院、吉林省長春市吉林大學第一醫(yī)院和北京市國家衛(wèi)生健康委科研所精子庫，開展精液分析的實驗室，包括各省市三甲醫(yī)院的男科實驗室、生殖中心實驗室、精子庫實驗室和臨床檢驗實驗室，共106家單位。采用集中發(fā)放質控品和現(xiàn)場評估的形式。根據(jù)WHO-5推薦的標準化方法，對參加外部質控的所有實驗室技術人員進行培訓。這些技術人員均為長期從事精液分析的熟練操作人員。外部質控的內(nèi)容包括精子濃度、活動力、存活率和精子形態(tài)學分析，其中精子濃度、活動力和存活率的精液質控品分為樣本A和樣本B，樣本A為高濃度、高活動力和高存活率的樣本；樣本B為低濃度、低活動力和低活動率的樣本。

二、精液分析所用的儀器和試劑

伊紅-苯胺黑試劑(深圳華康生物)，巴氏染色主要染液(深圳華康生物)，稀釋固定液按照WHO-5手冊配制，多人共攬顯微鏡(Nikon，日本)，普通相差顯微鏡(Nikon，日本)，改良Neubauer血細胞計數(shù)板(普蘭德，上海)。

三、外部質量控制實驗方法

1. 精子濃度的質控和分析：制備精子濃度分析質控品。在國家衛(wèi)生健康委科研所北京人類精子庫的實驗室中，將至少兩個志愿者的新鮮精液(粘稠度正常、充分液化、無精子凝集)混合。500 μl精液分裝至1.5 ml Ep管中，每管加入10%甲醛溶液(10 μl/100 μl)混勻，于4℃保存。使用之前平衡至室溫，再次使用前充分混勻。

采用WHO-5手冊推薦的改良Neubauer計數(shù)板的方法對預先制備好的質控品抽樣進行精子濃度的評估，每個實驗人員，同一樣本取樣兩次，每次至少評估200個精子。

2. 精子活動力的質控和分析：根據(jù)WHO-5推薦的方法制備活動力濕片，用精子全自動分析儀錄制標本視頻錄像，分別錄制相當于若干個顯微鏡下視野的圖像。每次至少評估200個精子，保證錄像的放大倍數(shù)與實際標本分析時顯微鏡下一致。

3.精子存活率的質控和分析：根據(jù)WHO-5手冊推薦的方法，制備精子存活率的質控品。分別取充分液化并混勻的高低存活率的兩份精液各50 μl，與等體積的伊紅苯胺黑溶液充分混勻后，制備精液涂片，封片備用。計數(shù)活精子的百分率。用100倍油鏡觀察，每個存活率分析精液質控品取樣兩次，每次至少評估200個精子。

4.正常形態(tài)精子百分率的質控和分析：根據(jù)WHO-5手冊推薦的方法，取充分液化的精液并混勻，用拉片制備精液涂片，待其完全干燥后，進行巴氏染色，封片備用。每張涂片計數(shù)2次，每次至少評估200個精子。用多人共攬顯微鏡(Bridge Microscope)100倍油鏡觀察，分別計數(shù)出正常形態(tài)精子百分率。

5. 質控項目：每個單位參加質控的項目分別為：精子濃度、精子活動力、精子存活率和精子形態(tài)學評估。n代表每個地區(qū)參加外部質控的單位數(shù)量，有些項目有單位尚未開展，故n在每個項目中不完全相同。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。n代表單位數(shù)量。分別用均數(shù)和變異系數(shù)(CV)(%)值表示各實驗室之間結果的變異。采用Youden圖評估各實驗室的外部質控結果[7]。

結 果

一、精子濃度外部質量控制結果

1.精子濃度評估結果：僅有吉林省的各實驗室之間樣本A和B的CV值在15%以下；北京市樣本B精子的CV值最高，為54.26%；而四川省樣本A和B的CV值均大于30%(表1)。

2.Youden圖評估各實驗室結果：分別計算樣本A和B的95%可信區(qū)間(95%CI)，并將每個地區(qū)的質控結果制作Youden圖(圖1)。在四省一市中分別有23.53%(8/34)、25.00%(2/8)、36.84%(7/19)、10.00%(1/10)和18.18%(2/11)實驗室的兩個質控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而10.00%(1/10)、50.00%(4/8)、57.89%(11/19)、40.00%(4/10)和54.54%(6/11)實驗室的其中一個質控品結果在95%CI內(nèi)，另一個結果不在；其余的兩次結果均不在95%CI內(nèi)。

二、精子活動力外部質量控制結果

1.精子活動力評估結果：四省一個直轄市的精子活動力評估結果顯示，遼寧省的樣本A和B的CV值均在10%以下；四川省樣本A的CV最大，為21.78%(表2)。

表1 精子濃度評估[(-±s)，%]

A：北京市；B：四川省；C遼寧省；D甘肅??；E：吉林省圖1 四省一市精子濃度外部質量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=32)四川省(n=8)遼寧省(n=18)甘肅省(n=8)吉林省(n=10)樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B均值(×106/ml)30±668±650±1138±668±670±754±639±651±643±9CV(%)19.698.7321.7814.638.369.9610.8816.3911.4620.26

2.Youden圖評估各實驗室精子活動力結果：分別計算樣本A和B的95%CI，并將每個地區(qū)的質控結果制作Youden圖(圖2)。五家單位分別有9.38%(3/32)、25.00%(2/8)、44.44%(8/18)、12.50%(1/8)和30.00%(3/10)的兩個質控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而50.00%(16/32)、62.50%(5/8)、38.89%(7/18)、25.00%(4/8)和40.00%(4/10)其中一個樣本結果在95%CI內(nèi)，另一個樣本結果不在；其余的兩次結果均不在95%CI內(nèi)。

三、精子存活率外部質量評估

1.精子存活率評估結果：四省一市的精子存活率的CV均在15%以下。其中遼寧省、甘肅省和吉林省的存活率均在10%以下；四川省樣本B的CV最大，為13.89%(表3)。

A：北京市；B：四川省；C遼寧省；D甘肅?。籈：吉林省圖2 四省一市精子活動力外部質量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=48)四川省(n=8)遼寧省(n=19)甘肅省(n=10)吉林省(n=10)樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B樣本A樣本B均值(×106/ml)68±565±767±266±964±668±685±470±465±268±6CV(%)7.9610.762.5813.899.189.134.496.503.199.89

2.Youden圖評估各實驗室精子存活率結果：分別計算樣本A和B的95%CI，并將每個地區(qū)的質控結果制作Youden圖(圖3)。五家單位分別有8.33%(4/48)、37.50%(3/8)、47.37%(9/19)、10.00%(1/10)和20.00%(2/10)的兩個質控品均在中間的靶窗口中，即均在95%CI內(nèi)；而45.83%(22/48)、50.00%(4/8)、36.84%(7/19)、70.00%(7/10)和60.00%(6/10)其中一個質控品的結果在95%CI內(nèi)，另一個結果不在；其余兩次結果均不在95%CI內(nèi)。

四、正常形態(tài)精子百分率的評估結果

四省一市精子正常形態(tài)百分率的CV均在20%以上；其中吉林省的CV最高，為63.06%(表4)，提示精子形態(tài)較難質控。

A：北京市；B：四川??；C遼寧??；D甘肅??；E：吉林省圖3 四省一市精子活動力外部質量控制Youden圖

參 數(shù)北京市(n=48)四川省(n=10)遼寧省(n=18)甘肅省(n=10)吉林省(n=9)均值(×106/ml)33±1115±913±316±614±9CV(%)34.7159.7721.5839.4563.06

討 論

本研究采用WHO-5手冊標準化方法，首次在全國四省一市進行精液分析，包括精子濃度、活動力、存活率及正常形態(tài)百分率評估的外部質控。首次嘗試在精子形態(tài)學評估時嘗試多人共攬顯微鏡的方式進行外部質控，結果顯示了該方式的優(yōu)越性。

Gandini等[8]在對7個樣品進行的精子濃度外部質控中，CV介于29.67%和52.08%之間。Filimberti等[9]報告了15年的精子濃度分析的外部質控中，有46.65%的受試者的CV占59.03%，最高達75.14%。而本研究中精子濃度評估的結果，只有吉林省兩個質控樣本的CV在10%以下，其他的CV介于13.94%和54.26%之間。本研究中精子濃度評估的CV值優(yōu)于上述兩個實驗室。而其中一個樣本的CV高可能與參加外部質控的實驗室數(shù)量多有關。精子濃度的CV比精子活動力和存活率的高，原因在于計數(shù)精子濃度的同時，精子在快速運動，因此精子的濃度越高，活動力越好，計數(shù)的準確度越低。而且，本研究所用的精子濃度質控標本由新鮮精液樣本混合制備而成，充分混勻，并檢查排除有精子聚集者。

有研究表明，精子前向運動(PR)的百分率與妊娠率呈正相關[10-11]。PR精子評估的準確性直接影響受精能力的預測。本研究中，PR精子的CV在8.36%和21.78%之間，其中有六個樣本的CV小于15%。Filimberti等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，三次實驗中均觀察到PR精子的CV高達60%，而我們的結果最高CV達到21.78%，明顯優(yōu)于Filimberti等[9]的研究結果。我們在進行PR精子的評估時，采用WHO-5推薦的制作視頻的方式。如果有條件的話，也可以采用多人共攬顯微鏡，在同一視野下同時評估同一個樣本的活動力，效果會更好。計算機輔助活動力分析，雖然WHO-5手冊中介紹的內(nèi)容不多，但其在評估精子活動力中有優(yōu)勢，可以獲得多種參數(shù)，如平均路徑速度(vap)、直線速度(vsl)、曲線速度(vcl)和頭部橫向位移振幅(alh)。這些參數(shù)的平均值或中間值，可以監(jiān)測某些治療或遺傳干擾所導致的精子活動力變化，甚至可分辨出超活化的精子[12]。但是也有研究表明，在進行人工與計算機輔助精子分析(CASA)的精液分析質控時，除了非前向運動精子活動力之外的其他參數(shù)與人工分析的質量控制還是有顯著差異的[13]。

2003年Bj?rndahl等[14]對1 235份精液樣本進行伊紅苯胺黑染色法首次評估了精子活動力，得到了與在相差顯微鏡下評估的同等效果。而WHO-5手冊中使用伊紅苯胺黑評估精子的存活率。伊紅苯胺黑法可以增加精子與背景的對比度，而且被染的精子不隨時間延長變化而加深，封片之后可以長期保存。本研究中精子存活率外部質控結果的CV均在15%以下，在精液分析的幾個項目中是最優(yōu)的，提示其是最容易質控的項目之一。

正常形態(tài)精子百分率與精子功能異常、體外受精率及宮腔內(nèi)人工授精(IUI)和常規(guī)IVF的成功率相關[15]。對男性生育潛力具有很高的預測價值，對于選擇輔助生殖技術治療方法至關重要[16-17]。精子形態(tài)學評估主觀性強，是最難分析的指標之一[18]，與實驗人員的理論標準掌握情況及評估的熟練程度密切相關。Filimberti等[9]的研究中正常形態(tài)率結果的CV在15%～90%之間，而且高CV值與染色方法和染色程序無關，他采用的三種染色方法的CV都非常高，在88.6%～105.6%之間。Punjabi等[18]的研究中，巴氏染色后的CV在44%～65%之間。他們的研究表明，這種高的CV系數(shù)可以通過不斷的培訓、教學和訓練而逐漸改善。

本研究中，精子形態(tài)學分析的CV介于21.58%～63.06%之間，優(yōu)于之前的研究結果。WHO-5手冊培訓之后，使用多人共攬顯微鏡的方式，得到了比用形態(tài)照片和單個顯微鏡評估更好的結果。精子形態(tài)學評估的主觀性較強，評估標準的難掌握，不易穩(wěn)定。再加上WHO-5手冊的正常參考值下限為4%，使得臨床上對精子形態(tài)學評估報告的可信度降低[15]。而且根據(jù)本研究小組在之前的調(diào)查中顯示，目前精子形態(tài)學評估的染色方法超過5種，在臨床中最常用的方法是Diff-Quik方法，這種方法可以快速染色和出報告，但缺點是對精子缺陷的細節(jié)染色較差；如果形態(tài)學評估的技術人員不固定，對于一些已經(jīng)掌握了某種染色和評估方法的技術人員培訓的效果不佳；實施形態(tài)學評估內(nèi)部質量控制的實驗室很少，這與法國一實驗室進行的調(diào)查結果一致[19]。

Youden圖顯示兩個樣本的結果均在中間的靶窗口中，說明兩個樣本均在95%CI內(nèi)；而如果其中一個樣本結果在95%CI內(nèi)，另一個樣本結果不在95%CI內(nèi)，提示可能由于實驗過程中的隨機誤差而造成結果差異；兩個樣本的結果均高出或均低于95%CI，提示可能由于系統(tǒng)誤差造成的結果差異。Youden圖顯示，遼寧省的精子濃度、活動力和存活率的結果中，兩個結果均在95%CI的概率高于其他地區(qū)。精子濃度中五個省市的大部分實驗室中一個樣本在控。采用進口牛鮑式計數(shù)板的精子濃度質控方法優(yōu)于其他方法。

本研究在全國四省一直轄市，進行了精液分析外部質量控制方法，是可行的，其結果是可靠的。本研究依賴于WHO-5手冊精液分析標準化操作培訓班，初步在全國范圍內(nèi)建立精液分析外部質量控制網(wǎng)絡的方法，但精液分析外部質量控制網(wǎng)絡的建立尚處于起步和探索階段，急需進一步提高。精液分析外部質量控制需要長期堅持，任重而道遠。我們期望，在WHO-5手冊的標準化操作方法基礎上；在本研究團隊長期以來的精液分析標準化理論與操作培訓的基礎上；也需要從事精液分析的技術人員的共同努力，必然將在全國范圍內(nèi)建立精液分析外部質量控制網(wǎng)絡。本研究團隊會在實踐中不斷探索適合當前實際情況的外部質量控制的方法。以期逐步推動和實現(xiàn)全國精液分析外部質控網(wǎng)絡的建立。