龐琳琳，趙秋華，王 欣，張俊杰，郭 爽，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，馬志永，王 建，魏建超

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109；3.上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是一種位于上呼吸道的革蘭氏陰性桿菌，易感染2～6周齡斷奶后仔豬和保育豬，出現(xiàn)發(fā)熱、食欲不振、呼吸困難、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹、站立困難甚至癱瘓等臨床癥狀[1]，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴重時死亡率高達50%[2,3]。剖檢時常見漿膜炎、腦膜炎、支氣管肺炎、關(guān)節(jié)炎等病理變化。

副豬嗜血桿菌不易分離，有部分至今未被分離出。根據(jù)血清定型檢測，將副豬嗜血桿菌劃分為15個血清型。其中血清型1、5、10、12、13和14是強毒株，腹腔接種SPF豬4 d內(nèi)即可引起豬死亡或瀕臨死亡[4]。近年來，國內(nèi)的主要流行株為4、5、12、13、15型[5-7]，強毒株13型給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌感染雖可以用藥物進行防治，但易產(chǎn)生耐藥性，且影響食品安全，因此使用疫苗是比較經(jīng)濟有效的預(yù)防方法[8]。

目前，副豬嗜血桿菌疫苗的研制主要應(yīng)用平板培養(yǎng)、滅活制備的傳統(tǒng)方法，成本較高，產(chǎn)量較低[9]，而液體培養(yǎng)可以很好彌補這些缺陷[10]。本研究通過16S rDNA測序及PCR血清分型技術(shù)確定分離菌株為13型副豬嗜血桿菌，采用動物回歸試驗確定分離菌毒力的強弱。通過優(yōu)化不同新生牛血清濃度、影響因子（NAD）濃度的生長條件，探討13型副豬嗜血桿菌最適的液體培養(yǎng)條件，觀察生長曲線，并確定其生長對數(shù)期的OD600值范圍及活菌數(shù)的變化趨勢，從而為13型副豬嗜血桿菌的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種將患病仔豬的心包積液、關(guān)節(jié)液均勻畫線接種于含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的TSA培養(yǎng)平板上進行培養(yǎng)，分離純化后凍干保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA 培養(yǎng)基）和胰胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基）均購自英國的OXOID公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）；酸度計購自德國Sartorius公司；Agarose購自YESEN公司；2×TaqPCR Master Mix 購自天根生物有限公司。

1.3 菌種PCR鑒定根據(jù)GenBank菌類的16S rDNA序列設(shè)計引物（27F和1492R）進行PCR；1%瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收并純化目的條帶，獲得的目的基因送至上海桑尼生物有限公司測序，與GenBank中副豬嗜血桿菌參考菌株16S rDNA序列比對分析進行菌種鑒定；參考文獻[11]設(shè)計引物，應(yīng)用PCR對分離菌株進行血清型分型。

1.4 動物回歸試驗選12頭30日齡的仔豬，隨機分為4組，每組3頭；其中3組為實驗組，另外1組為對照組；實驗組每頭仔豬腹腔注射2 mL副豬嗜血桿菌，濃度分別為1×105、1×106、1×107CFU/mL；對照組每頭仔豬腹腔注射2 mL PBS。觀察各組仔豬體溫、呼吸及精神狀況、死亡率等。對于瀕死豬進行安樂死，解剖觀察其內(nèi)臟組織病變并對菌株進行分離。

1.5 生化實驗取少量分離菌株分別滴加到氧化酶拭紙以及過氧化氫酶生化鑒定管，觀察實驗結(jié)果。將少量的液體副豬嗜血桿菌在無菌條件下分別滴加到葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、蛋白胨水、β-半乳糖苷、尿素新型微生物微量生化鑒定管中，37℃反應(yīng)30 h左右，觀察結(jié)果。

1.6 不同濃度的新生牛血清對分離菌株生長的影響在 NAD濃度為2.5 μg/mL的TSB液體培養(yǎng)基中加入新生牛血清，使其血清濃度分別為1%、5%、10%、20%。分別取4 mL不同濃度的新生牛血清培養(yǎng)菌放入試管中，設(shè)置3個重復(fù)。37℃，220 r/min條件下培養(yǎng)6、12、24 h，分別測定不同牛血清濃度及不同培養(yǎng)時間的OD600值，比較在不同血清濃度中分離菌的生長情況。

1.7 不同濃度的NAD對分離菌株生長的影響在新生牛血清濃度為5%的TSB中加入NAD，使其終濃度分別為0.2、1、2.5、10、25 μg/mL，將分離菌接種到TSB培養(yǎng)基中，置于37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12、16、22 h，分別測定不同NAD濃度及不同培養(yǎng)時間的OD600值。每個NAD濃度進行3次重復(fù)試驗，比較在不同NAD濃度中分離菌的生長情況。

1.8 分離菌在最適培養(yǎng)基中的生長曲線將增殖好的分離菌按1:100的比例接種到TSB培養(yǎng)基中（5%新生牛血清，10 μg/mL NAD），置于37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間從第4 h開始每2 h取1次樣，測定OD600值和pH，從而確定13型副豬嗜血桿菌在最適培養(yǎng)條件下的生長情況。測定OD600值的同時，進行活菌計數(shù)，繪制活菌數(shù)與OD600值的關(guān)系圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR鑒定結(jié)果將16S rDNA測序結(jié)果在NCBI中進行比對，確定分離菌株為副豬嗜血桿菌（圖1）。通過PCR對分離菌株進行血清學(xué)鑒定，確定為血清13型（圖2）。

圖1 分離菌株16S rDNA鑒定結(jié)果Fig.1 PCR result of 16S rDNA of isolates

圖2 副株嗜血桿菌的血清分型結(jié)果Fig.2 Serotyping results of Haemophilus parasuis

2.2 動物回歸試驗結(jié)果實驗組仔豬腹腔注射13型副豬嗜血桿菌，對照組仔豬注射PBS。攻毒組仔豬在12 h內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難，體溫增高，流鼻涕，精神不振等臨床癥狀；1×107CFU/mL組的臨床癥狀更加明顯，在攻毒24 h內(nèi)高濃度組開始出現(xiàn)死亡；其他兩組實驗組臨床癥狀在12～24 h內(nèi)逐漸加重。實驗組仔豬在感染后4 d內(nèi)全部死亡。解剖瀕死豬均發(fā)現(xiàn)心包積液、關(guān)節(jié)積液，肺部有明顯的病變。對病變部位的細菌進行分離純化，經(jīng)PCR血清學(xué)鑒定后，確定為13型副豬嗜血桿菌。

2.3 13型副豬嗜血桿菌的生化實驗結(jié)果生化反應(yīng)結(jié)果顯示，13型副豬嗜血桿菌可導(dǎo)致氧化酶、過氧化氫酶陽性，且能夠分解葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖，但不能夠與蛋白胨水、β- 半乳糖苷、尿素發(fā)生反應(yīng)（表1）。

2.4 不同濃度的血清對13型副豬嗜血桿菌生長的影響檢測不同濃度血清在不同培養(yǎng)時間的菌液OD600值，結(jié)果表明，20%的新生牛血清濃度對13型副豬嗜血桿菌的生長有抑制作用。當血清濃度為5%、10%時與濃度為1%、20%相比較分別，差異性具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01)。5%的濃度與10%的濃度新生牛血清相比差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。因此，從13型副豬嗜血桿菌的生長情況及經(jīng)濟效益來考慮，應(yīng)選擇終濃度為5%的新生牛血清濃度作為其液體培養(yǎng)條件。

2.5 不同濃度的NAD對13型副豬嗜血桿菌生長情況的影響副豬嗜血桿菌對培養(yǎng)條件的要求十分苛刻，需要血清和特殊的生長因子NAD。通過檢測不同培養(yǎng)時間不同濃度NAD的菌液OD600值，結(jié)果顯示，當NAD濃度過低時，13型副豬嗜血桿菌生長趨勢不明顯；NAD濃度為2.5 μg/mL時副豬嗜血桿菌生長依然緩慢；NAD濃度為10 μg/mL與25 μg/mL，相比差異性不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3），而NAD濃度為10 μg/mL與0.25、1、2.5 μg/mL相比，差異均具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.05）。從13型副豬嗜血桿菌的生長情況及經(jīng)濟效益情況來考慮，應(yīng)選擇終濃度為10μg/mL的NAD作為培養(yǎng)13型副豬嗜血桿菌的最適濃度。

2.5 13型副豬嗜血桿菌在最適培養(yǎng)基中的生長曲線將13型副豬嗜血桿菌按1∶100的比例接種到100 mL TSB培養(yǎng)基中（10 μg/mL NAD、5%新生牛血清），生長曲線見圖3，接菌4 h后OD600值開始上升，菌體開始生長，在培養(yǎng)22 h時OD600值達到最大。隨著培養(yǎng)時間的增加，OD600值開始下降?；罹鷮?shù)值在培養(yǎng)14 h時達到最高，隨后開始下降，在24 h時活菌數(shù)又有上升趨勢（圖4）?？梢钥闯?3型副豬嗜血桿菌的OD600值在0.2～0.6時為其對數(shù)生長期。

活菌數(shù)和OD600值之間的關(guān)系如圖5所示。當OD600值小于0.4時，活菌數(shù)與OD600值之間有很好的線性關(guān)系；當OD600值大于0.4時，活菌數(shù)與OD600之間的偏差越來越大。

表1 分離菌株生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Biochemical reaction results of isolated strain

表2 13型副豬嗜血桿菌在不同新生牛血清濃度中不同培養(yǎng)時間的OD600值Table 2 OD600 values of Haemophilus parasuis in different concentrations of newborn calf serum at different times

表3 13型副豬嗜血桿菌在不同NAD濃度中不同培養(yǎng)時間的OD600值Table 3 OD values of Haemophilus parasuis in different NAD concentrations at different times

在TSB中培養(yǎng)副豬嗜血桿菌，溶液pH值下降極快，培養(yǎng)24 h后，pH值下降至6.2。pH值對副豬嗜血桿菌的菌體濃度有一定影響[15]。13型副豬嗜血桿菌在液體培養(yǎng)基中存活時間較短，這一現(xiàn)象可能與其繁殖過程中產(chǎn)生大量酸有關(guān)。因此，在大規(guī)模培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的過程中應(yīng)注意pH值的范圍。

臨床上副豬嗜血桿菌常引起呼吸道疾病，發(fā)病率和死亡率相對較高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌血清類型很多，各血清之間的交叉免疫保護具有可變性[12]。目前防控副豬嗜血桿菌感染主要采用疫苗和藥物。應(yīng)用藥物進行預(yù)防和治療，效果雖佳，但易產(chǎn)生耐藥性[13,14]。雖然在各血清型之間疫苗的交叉免疫保護現(xiàn)象很弱，但根據(jù)當?shù)馗必i嗜血桿菌流行特點所研制的疫苗還是具有一定的良好效果。使用商業(yè)疫苗或滅活苗可以很好的防控副豬嗜血桿菌病[16]。臨床上感染13型副豬嗜血桿菌的仔豬發(fā)病率和死亡率均較高，但針對強毒株13型副豬嗜血桿菌的商業(yè)疫苗研究較少。

本研究通過16S rDNA測序及PCR測定其血清型，確定此株為13型副豬嗜血桿菌。從動物的回歸試驗可以判定分離株為強毒株。同時，進一步研究了13型副豬嗜血桿菌的最佳的液體培養(yǎng)條件，為其疫苗的研制提供了參考。

圖3 13型副豬嗜血桿菌在最適培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curve of Haemophilus parasuis 13 in the optimal medium

圖4 13型副豬嗜血桿菌在最適培養(yǎng)基中的活菌對數(shù)值Fig.4 Viable counts of Haemophilus parasuis 13 in the optimal medium

圖5 13型副豬嗜血桿菌的活菌數(shù)與OD600值的關(guān)系Fig.5 Relationship between viable count and OD600 value of Haemophilus parasuis 13

圖6 13型副豬嗜血桿菌在最適培養(yǎng)基中的pH值Fig.6 pH values of Haemophilus parasuis 13 in the optimum medium