尹 坤 ，馬子鵬 ，李伊銘 ，孫雨茗 ，王 昊 ，烏東高娃 ，孫 娜 ，程世鵬 ，王鳳雪 ,，溫永俊 ,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018）

狂犬?。╮abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的致死性人獸共患傳染病[1]?？袢』颊弑憩F(xiàn)嚴重的神經(jīng)癥狀，如驚厥、沉郁、恐水、恐聲、麻痹，同時伴有意識障礙和昏迷。由于對RABV致病機制缺乏明確的認識，造成臨床上尚無有效的治療手段，研究RABV導(dǎo)致神經(jīng)功能異常的機制可為狂犬病臨床治療提供理論依據(jù)。

由于病毒基因結(jié)構(gòu)中糖蛋白（G蛋白）的不同，經(jīng)馴化適應(yīng)非神經(jīng)細胞的RABV弱化毒株與強毒株在神經(jīng)侵嗜性程度上明顯不同，從外周感染部位侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的能力不同，組織弱化毒株從外周侵犯CNS的能力喪失或能力有限，而強毒株具有高神經(jīng)侵嗜性[2]。Etessami等[3]研究表明缺失G基因的重組RABV可以感染神經(jīng)元，但是不能傳播到下一級神經(jīng)元，說明RABV的G蛋白在從突觸前穿行到突觸后這一過程中起到重要作用。研究表明在RABV感染模型中，神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿[4,5]、五羥色胺[6]、γ氨基丁酸的表達量存在異常?？袢“l(fā)病臨床癥狀非常明顯，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中僅表現(xiàn)出輕微的病理變化，炎癥反應(yīng)輕，幾乎沒有神經(jīng)元變性，據(jù)此推測狂犬病的致病性主要是由神經(jīng)功能異常所致。神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙是由SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor）復(fù)合體的形成介導(dǎo)的。SNARE復(fù)合物是突觸囊泡胞吐過程中的核心成分，參與幾乎所有分泌細胞的胞吐過程，syntaxin與SNAP 25是位于突觸前膜的t-SNARE（target-SNARE），VAMP2是位于突觸囊泡膜上的v-SNARE（vesicle-SNARE）[7,8]。本研究利用不同毒力的RABV感染原代神經(jīng)元細胞，建立了RABV感染原代神經(jīng)元細胞模型，確定了兩種不同毒力病毒的最佳感染條件。在最佳感染條件下，檢測了突觸循環(huán)相關(guān)核心蛋白SNARE主要復(fù)合物（synaptobrevin/VAMP、syntaxin及SNAP 25）的蛋白表達情況，為進一步了解RABV致神經(jīng)性癥狀提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞系與實驗動物RABV弱毒株SAD、固定毒株CVS 11由本實驗室保存；m NA細胞由內(nèi)蒙古大學(xué)楊洋副教授惠贈；懷孕16～18 d的BALB/c 母鼠購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑FITC標記的狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體購自瑞典FUJIREBIO公司；狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體由本實驗室保存；鼠抗MAP2單克隆抗體購自美國BD公司；兔抗syntaxin1A多克隆抗體、兔抗SNAP25多克隆抗體、兔抗VAMP2多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記兔抗鼠IgG購自Abacm公司；DMEM、1640、Neurobasal-A無血清培養(yǎng)基、B-27Supplement、谷氨酰胺、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自Gibico公司；N蛋白單克隆抗體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙凌教授惠贈；鼠抗β-Actin單克隆抗體購自Proteintech公司；FITC標記的兔抗鼠IgG購自北京碧云天公司；種植培養(yǎng)基：由90%DMEM高糖培養(yǎng)基、10% 胎牛血清配置而成；維持培養(yǎng)基：由97%的Neurobasal-A無血清培養(yǎng)基和2%的B27無血清培養(yǎng)基，1%L-谷氨酰胺、0.5%青鏈霉素混合液配置而成。

1.3 原代神經(jīng)元細胞的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察取懷孕16～18 d的BALB/c母鼠，斷頸處死，置于75%乙醇中消毒。將胎鼠置于冰冷的高糖DMEM中，取出腦組織，使用解剖剪盡量剖離腦被膜與血管膜，置于預(yù)冷的高糖DMEM中，切碎腦組織，加入0.25%胰酶與DNA酶，37℃靜置消化20 min后，加入胎牛血清終止消化。棄掉上清，加入新鮮的DMEM與DNA酶吹打，經(jīng)70μm細胞篩網(wǎng)過濾之后，4℃、1000/min離心，棄上清，加入種植培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液。經(jīng)臺盼藍染色法活細胞計數(shù)后，以1×105個/孔的細胞濃度鋪于多聚賴氨酸附著的24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后輕輕搖晃培養(yǎng)板并棄去種板培養(yǎng)基，加入新鮮的生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。d3進行全換液，并加入終濃度為10 ng/mL的阿糖胞苷，以后每3 d進行1/3換液，在培養(yǎng)的d1、3、7觀察細胞狀態(tài)與形態(tài)。

1.4 原代神經(jīng)元細胞純度鑒定利用間接免疫熒光試驗（indirect immunoinfluscent assay，IFA）進行原代神經(jīng)元細胞純度鑒定。首先棄去24孔細胞板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛，4℃條件下固定1 h；棄去多聚甲醛，PBS洗滌3次，加入神經(jīng)元細胞特異性抗體MAP2（1∶100）作為一抗過夜孵育；然后以FITC標記兔抗鼠IgG室溫孵育1 h；最后加入DAPI，觀察熒光出現(xiàn)情況。

1.5 CVS 11、SAD在原代神經(jīng)元細胞的感染特性測定使用細胞傳代的SAD與鼠腦傳代的CVS 11，以MOI為0.01的劑量去感染原代神經(jīng)元細胞，感染后d1、2、3分別用80%的冷丙酮室溫固定20 min，加入FITC標記的RABV N蛋白抗體（1∶50）室溫孵育45 min，染核后采用直接免疫熒光檢測（direct immunoinfluscent assay，DFA）RABV感染細胞特性。

1.6 CVS 11、SAD在神經(jīng)元細胞的生長特性將SAD，CVS 11以MOI=0.01劑量感染原代神經(jīng)元細胞，收集感染后1、2、3、4 d細胞上清，在mNA細胞上在不同時間段進行兩種病毒毒價的滴定，觀測病毒在原代神經(jīng)元細胞上生長特性。

1.7 RABV感染神經(jīng)元細胞SNARE主要核心復(fù)合物、G蛋白與N蛋白表達水平的Western blot分析使用RIPA裂解液提取CVS11、SAD分別感染的原代神經(jīng)元細胞總蛋白，煮沸處理后，SDS-PAGE檢測。分別以兔抗VAMP2多克隆抗體（1∶2000）、兔抗syntaxin1A（1∶1000）多克隆抗體、兔抗SNAP25多克隆抗體（1∶1000）、鼠抗β-Actin單克隆抗體（1∶2000）、鼠抗G蛋白單克隆抗體與N蛋白單克隆抗體作為一抗，分別以HRP標記山羊抗兔或兔抗鼠IgG作為二抗，通過ECL顯色進行Western blot，分析SNARE主要核心復(fù)合物、G蛋白與N蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)觀察將胎鼠腦部分離獲得的神經(jīng)元細胞進行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、3、7 d后，進行形態(tài)學(xué)觀察。培養(yǎng)1 d后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到細胞折光性良好，有已經(jīng)分化小突起的神經(jīng)細胞（圖1A）；培養(yǎng)3 d后，可見細胞長出1～2個突起，隨著培養(yǎng)時間延長，突起長度逐漸變長（圖1B）；培養(yǎng)7 d后，細胞胞體較大，折光率增強，神經(jīng)細胞軸突樹突之間相互交錯，能形成典型的神經(jīng)細胞網(wǎng)絡(luò)（圖1C）。

圖1 原代神經(jīng)元細胞的分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of primary neuronal cells

2.2 原代神經(jīng)元細胞純度鑒定結(jié)果對獲得的原代神經(jīng)元細胞進行IFA檢測，用神經(jīng)元細胞特異性抗體MAP2檢測細胞的的純度，MAP2標記的陽性細胞為綠色，即為原代神經(jīng)元細胞（圖2A、B與C）。隨機觀察不同視野，對陽性細胞進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，98%的細胞為陽性細胞（圖2D），表明分離獲得的原代神經(jīng)元細胞純度高，可用于后續(xù)研究。

圖2 原代神經(jīng)元的間接免疫熒光檢測Fig.2 Identification of primary neuronal cells indirect immunoinfluscent assay(IFA)

2.3 CVS 11、SAD在原代神經(jīng)元細胞的感染特性檢測將CVS 11、SAD以MOI=0.01劑量感染原代神經(jīng)元細胞，在不同時間段采用DFA統(tǒng)計兩種病毒在原代神經(jīng)元細胞的感染速率，確定兩種病毒感染神經(jīng)元細胞的最佳時間（圖3）。結(jié)果表明固定毒株CVS 11感染神經(jīng)元細胞速率略高于弱毒株SAD。感染后d2，CVS 11感染率要高于SAD在神經(jīng)元的感染率，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；感染后d3，原代神經(jīng)元細胞被兩種病毒全部感染（圖4），且神經(jīng)元細胞依然保持完整。結(jié)果表明以MOI=0.01的感染劑量感染原代神經(jīng)元細胞，3 d為最佳感染時間，且固定毒株CVS 11對神經(jīng)元細胞噬性較強。

圖3 CVS 11、SAD感染原代神經(jīng)元細胞后N蛋白表達的直接免疫熒光檢測Fig.3 Expression of N protein in primary neuronal cells infected with CV11 and SAD virus by DFA

圖4 CVS 11、SAD在原代神經(jīng)元細胞上的感染率檢測Fig.4 Infection rate of CVS 11 and SAD in primary neuronal cells

2.4 CVS 11、SAD在神經(jīng)元細胞中的生長特性為了研究CVS 11、SAD兩種病毒在細胞中的生長特性，以MOI=0.01劑量分別感染原代神經(jīng)元細胞，繪制多步生長曲線（圖5）。結(jié)果顯示CVS 11與SAD在原代神經(jīng)元細胞內(nèi)的增殖趨勢大致相同，兩種病毒感染細胞后3 d達到病毒滴度的峰值。SAD的最高病毒滴度能達到108.5，而CVS11的最高滴度為108，兩者差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 CVS 11、SAD在原代神經(jīng)元細胞中的生長曲線Fig.5 Growth curve of CVS-11 and SAD strains in primary neuronal cells

2.5 RABV感染神經(jīng)元細胞后SNARE三個核心蛋白復(fù)合物、G蛋白與N蛋白表達水平檢測兩種病毒分別感染后，采用Western blot檢測原代神經(jīng)元細胞中控制囊泡釋放的SNARE三個核心蛋白復(fù)合物（Synaptobrevin/VAMP、syntaxin 1A、SNAP 25）、G蛋白、N蛋白的表達。結(jié)果顯示兩種病毒的G蛋白與N蛋白在原代神經(jīng)元細胞內(nèi)表達量幾乎相同，但固定毒株CVS 11的G蛋白較弱毒株SAD的G蛋白的蛋白分子量小，可能是由于固定毒株CVS 11 G蛋白糖基化位點少于弱毒株SAD[9]。病毒感染組中SNARE三個核心蛋白復(fù)合物相對于對照組中SNAP25蛋白與SyntaxinlA蛋白表達量幾乎沒有變化，但固定毒株CVS 11感染組的突觸囊泡膜上VAMP2表達量比弱毒株SAD感染組與對照組中VAMP2表達量少，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6），提示可能與RABV感染神經(jīng)系統(tǒng)的致病性有關(guān)。

3 討論

盡管RABV誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的原因還不是很清楚，但人類很早就意識到狂犬病對人腦部只有輕微的損傷，沒有或者只有很少的神經(jīng)元死亡。前期研究表明，RABV強毒株感染可使Synexin、α-SNAP、TRIM-9等多個神經(jīng)遞質(zhì)囊泡和突觸前細胞膜相關(guān)蛋白的表達受抑制，神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集在突觸前神經(jīng)元細胞內(nèi)[10]。然而，這些研究僅停留在蛋白表達量的改變和組織觀察的基礎(chǔ)上，不是RABV對神經(jīng)元突觸循環(huán)阻斷的直接證據(jù)，不足以確定RABV病毒對神經(jīng)突觸循環(huán)的干擾。本研究利用實驗室成熟的胎鼠腦原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)技術(shù)，建立了固定毒株CVS 11與弱毒株SAD在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細胞上的感染模型，為后續(xù)研究RABV致神經(jīng)系統(tǒng)異常奠定了基礎(chǔ)。

Schoch等[11]構(gòu)建了VAMP2 蛋白缺失小鼠，研究了腦神經(jīng)元的突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在自發(fā)性的突觸釋放或鈣離子誘導(dǎo)的突觸釋放過程中，突觸小泡的胞吐被很大程度減少。Sun等[12]采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了RABV街毒感染小鼠海馬突觸蛋白變化，結(jié)果表明相對于對照組，突觸囊泡膜上VAMP2蛋白在野毒株感染神經(jīng)元細胞中表達量減少。本研究利用Western blot技術(shù)對VAMP2、SNAP25、SyntaxinlA蛋白表達量進行檢測，結(jié)果表明，與對照組和SAD感染組相比較，固定毒株CVS11感染組中VAMP2蛋白表達量明顯減少，而其他兩個核心蛋白復(fù)合物表達量幾乎沒有變化。本研究結(jié)果可為RABV強毒株感染易感動物導(dǎo)致神經(jīng)癥狀研究提供一定的依據(jù)，具體致神經(jīng)癥狀機制以及分子機理還需進一步的研究。

圖6 狂犬病病毒感染原代神經(jīng)元細胞后糖蛋白、核蛋白與SNARE三個核心蛋白復(fù)合物的表達Fig.6 Expression of glycoprotein, nuclear protein and three core proteins of SNARE complex in primary neuronal cells after Rabies virus infection