陳 競(jìng)，許 汪，宋利娜，郝鵬飛，姜宇航，付婷婷，金 鑫，金寧一，李 昌

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122）

干擾素根據(jù)其作用受體不同分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型干擾素包括IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ等，Ⅱ型干擾素包括IFNγ，Ⅲ型干擾素包括IFN-λs。在干擾素細(xì)胞因子家族中，IFN-λs是一類主要作用于上皮細(xì)胞的干擾素[1-4]。人用IFN-λ研究較廣，且已進(jìn)入臨床應(yīng)用[5]。獸用IFN-λ的研究起步較晚，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不多。研究表明，豬的Ⅲ型干擾素（porcine interferon λ，pIFNλ）主要由 IFN-λ1、IFN-λ3兩種亞型構(gòu)成。pIFN-λ1基因的ORF為576個(gè)堿基，編碼192個(gè)氨基酸，其中第1～19個(gè)氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，第20～192個(gè)氨基酸為成熟蛋白；pIFN-λ3 基因的ORF為588個(gè)堿基，編碼195個(gè)氨基酸，其中第1～23個(gè)氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，第24～195個(gè)氨基酸為成熟蛋白。pIFN-λ1和pIFN-λ3氨基酸同源性僅為52.4%，且抗病毒活性存在差異[6-8]。pIFN-λ4未見相關(guān)研究報(bào)道。前期的豬源Ⅲ型干擾素研究主要圍繞豬IFN-λ1進(jìn)行。研究表明其對(duì)豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）等均有不同程度的抗病毒活性[8,9]。本實(shí)驗(yàn)室前期也進(jìn)行了豬IFN-λ1的克隆、表達(dá)與抗病毒活性研究[10]。為了探究豬源IFN-λ3是否也同樣具有抗病毒活性，本研究克隆了豬IFN-λ3基因，利用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，并分析其在不同來源細(xì)胞如PK15、MDCK中對(duì)表達(dá)綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein，VSVG）活性的抑制，以期為深入研究豬IFN-λ3的抗病毒活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料CRL2845細(xì)胞、PK15細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、VSVG病毒、pcDNA3.1(+)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；Bioflux凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州博日科技

有限公司；UNIQ-10柱式Triziol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；pEASYBlunt Simple載體、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PEIpro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Polyplus- transfection公司；青-鏈霉素溶液購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）(BI)、DMEM購(gòu)自Hyclone公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Anti-Flag抗體為中杉金橋產(chǎn)品；HRP-山羊抗鼠IgG 購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成參考GenBank中登錄的豬IFN-λ3基因序列（登錄號(hào)：GQ996936.1），設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。在擴(kuò)增引物的兩端分別添加EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)（斜體、加粗、下劃線表示）。為方便蛋白表達(dá)檢測(cè)，在上游引物添加Flag基因序列（加粗、下劃線表示）。上游引物pIFN-λ3-EcoR I-UP：5'-GATTACAAGGATGACG ACGATAAGATGGCCCTGGGTGGCTCGCT-3'；下游引物pIFN-λ3-XhoI-DOWN：5'AAGCTTATGGGTACCtcagacacacaggtctccac-3'。

1.3 pIFN-λ3基因的克隆及序列分析Trizol法提取豬肺巨噬細(xì)胞CRL2845總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增pIFN-λ3基因。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后分離回收目的片段，克隆至pEASY-Blunt Simple載體，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、單菌落篩選、質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定等常規(guī)方法獲得重組質(zhì)粒pEASY-pIFN-λ3，并進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定測(cè)序正確的pIFN-λ3基因片段經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，分離回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1，經(jīng)常規(guī)分子克隆方法獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-pIFN-λ3。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將293細(xì)胞接種于6孔板中，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前棄掉原培養(yǎng)基，更換為Opti-MEM，分別將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-pIFN-λ3及其對(duì)照載體pcDNA3.1與PEI pro轉(zhuǎn)染試劑按1∶1混合均勻，室溫靜置20 min，均勻滴加到6孔板中，37℃培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞蛋白，同時(shí)收集培養(yǎng)上清。

1.6 Western blot分析pIFN-λ3表達(dá)將制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后通過半干法轉(zhuǎn)印至NC膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂乳室溫封閉1 h，以Anti-Flag Tag為一抗室溫孵育2 h，山羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h，每個(gè)步驟之間均需要TBST洗膜3次，每次10 min。最后與化學(xué)發(fā)光液ECL反應(yīng)，曝光顯影。

1.7 pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性分析通過結(jié)晶紫染色、熒光觀察和流式細(xì)胞術(shù)3種方法分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性。

1.7.1 結(jié)晶紫染色法 將PK15、MDCK細(xì)胞接種于12孔板，106cells/well，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將12孔板中原有培養(yǎng)基棄掉，并使用PBS清洗1次。用雙無DMEM分別稀釋含pIFN-λ3的細(xì)胞培養(yǎng)上清和轉(zhuǎn)染的空載體上清（稀釋倍數(shù)為102），并加至相應(yīng)的孔中（500 μL/well），37℃、5%CO2孵育12 h；棄掉培養(yǎng)基，并用PBS清洗細(xì)胞1次，接種VSVG至12孔板中（PK15為0.1MOI，MDCK為0.001MOI），并設(shè)置陰性對(duì)照，孵育1 h后，棄掉病毒液，PBS清洗2次，添加雙無培養(yǎng)基（500 μL/well），繼續(xù)培養(yǎng)。待空載組細(xì)胞幾乎全部死亡時(shí)，進(jìn)行結(jié)晶紫染色（500 μL/well），室溫孵育15 min，PBS清洗至無色。

1.7.2 熒光觀察法 將PK15、MDCK細(xì)胞接種于6孔板（2×106cells/well），待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用雙無DMEM分別稀釋含pIFN-λ3的上清和轉(zhuǎn)染的空載體上清后，分別加入相應(yīng)的孔中（1 mL/well），37℃、5%CO2孵育12 h；接種VSVG至16孔板中（PK15 0.1 MOI，MDCK 0.001 MOI），孵育1 h后棄掉病毒液，并用PBS清洗2次，加1 mL雙無培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后棄掉上清并用PBS清洗細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察熒光。

1.7.3 流式細(xì)胞術(shù) 熒光顯微鏡觀察后，用胰酶消化細(xì)胞，吹勻，2176×g離心5 min，棄去上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)算表達(dá)綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 pIFN-λ3基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定分析提取豬肺巨噬細(xì)胞CRL2845的RNA，RT-PCR擴(kuò)增pIFN-λ3基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見約600 bp的條帶（圖1），回收后構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-pIFN-λ3。雙酶切鑒定（圖2）及DNA序列測(cè)定顯示與GenBank中登錄的豬IFN-λ3基因參考序列（GQ996936.1）完全一致，表明豬肺巨噬細(xì)胞CRL2845中存在pIFN-λ3基因的轉(zhuǎn)錄本。將其編碼的氨基酸序列經(jīng)BLAST在線比對(duì)后，選取部分物種的IFN-λ3基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)豬IFN-λ3與人源IFN-λ3的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，而與駱駝、羊駝的IFN-λ3同處于一個(gè)大的分支，進(jìn)化距離較近，表明他們的親緣關(guān)系較近（圖3）。豬源IFN-λ3與駱駝、羊駝IFN-λ3的序列同源性比對(duì)結(jié)果也顯示其親緣關(guān)系較近（圖4）。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定用EcoR I 和XhoI 酶切載體pcDNA3.1和重組克隆質(zhì)粒pEASY -pIFN-λ3（37℃、1.5 h），膠回收目的片段后以T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1--pIFN-λ3，并轉(zhuǎn)化至trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽性菌落，37℃震蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoR I 和XhoI雙酶切鑒定（圖5）。

2.3 pcDNA3.1- pIFN-λ3的表達(dá)鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-pIFN-λ3轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48 h 時(shí)，通過Western blot分析重組蛋白pIFN-λ3瞬時(shí)表達(dá)情況，結(jié)果顯示在22～25 kDa之間有單一特異性條帶（圖6），表明該蛋白成功獲得表達(dá)。

2.4 結(jié)晶紫染色法分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性對(duì)表達(dá)pIFN-λ3的上清進(jìn)行102倍稀釋后，分別作用于PK15、MDCK細(xì)胞，通過VSVG感染分析其抗病毒活性，結(jié)晶紫染色法結(jié)果如圖7所示，未接種病毒的細(xì)胞組（Mock）全部被染成紫色，表明細(xì)胞沒有死亡；接種病毒且未使用含pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞組（Vector）幾乎全部死亡脫落，而經(jīng)過pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞對(duì)VSVG感染表現(xiàn)出抑制作用，表明pIFN-λ3能夠在體外抑制VSVG對(duì)PK15、MDCK細(xì)胞的感染。

圖1 pIFN-λ3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of pIFN-λ3 gene

圖2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEASY -pIFN-λ3Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pEASY-pIFN-λ3

圖3 pIFN-λ3基因的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of pIFN-λ3 gene

圖4 豬源pIFN-λ3與羊駝、駱駝IFN-λ3的同源性分析Fig.4 Homology of porcine pIFN-λ3 with alpaca and camel IFN-λ3

圖5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-pIFN-λ3的雙酶切鑒定Fig.5 Double restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pcDNA3.1-pIFN-λ3

圖6 重組蛋白pIFN-λ3的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant protein pIFN-λ3

2.5 熒光觀察法分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性熒光觀察結(jié)果顯示，未接種病毒的細(xì)胞組（Mock）無熒光且細(xì)胞狀態(tài)良好；接種病毒但未使用含pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞組（Vector）熒光強(qiáng)度最高且細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變；經(jīng)過pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與密度、細(xì)胞病變程度均低于不含pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞（圖8），證實(shí)pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上對(duì)VSVG感染具有抑制作用。

圖7 結(jié)晶紫染色法分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性Fig.7 Analysis of antiviral activity of pIFN-λ3 on PK15 and MDCK cells by crystal violet staining

圖8 熒光觀察法分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性（100×）Fig.8 Fluorescence observation analysis of antiviral activity of pIFN-λ3 on PK15 and MDCK cells (100×)

2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，未接種病毒的PK15、MDCK細(xì)胞組（Mock）熒光率分別為1.5%、1.5%；接種病毒但未使用含pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的PK15、MDCK細(xì)胞組（Vector）熒光率分別為74.27%、99.30%；經(jīng)過pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的PK15、MDCK細(xì)胞熒光率分別為60.94%、77.35%（圖9）。經(jīng)過pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的熒光百分比均低于未使用pIFN-λ3培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞，說明pIFN-λ3能夠在PK15、MDCK細(xì)胞上抑制VSVG的感染。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)分析pIFN-λ3在PK15、MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性Fig.9 Flow cytometry analysis of antiviral activity of pIFN-λ3 on PK15, MDCK cells

3 討論

Ⅲ型干擾素（iterferon lambda，IFN-λ）是2003年首次被報(bào)道的一類不同于I型干擾素和II型干擾素的新干擾素家族，包括IFN-λ1、IFN-λ3、IFN-λ2、IFN-λ4。IFN-λ與其受體結(jié)合可刺激與I型干擾素相類似的下游通路，如Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK通路，最終誘導(dǎo)干擾素刺激基因ISGs的表達(dá)，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[11]。目前，pIFN-λ3的相關(guān)研究已表明，豬IFN-λ3能夠在體外對(duì)豬源細(xì)胞實(shí)現(xiàn)一定的抗病毒效果，并且當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，pIFN-λ3的表達(dá)水平也會(huì)出現(xiàn)明顯的上調(diào)。郭珊珊[12]等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞上表達(dá)重組pIFN-λ3并進(jìn)行了抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的研究，結(jié)果表明rPoIFN-L3可呈劑量依賴性抑制PEDV復(fù)制，并且上調(diào)相關(guān)干擾素-刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表達(dá)。劉偉[13]等利用PRRSV強(qiáng)毒與弱毒株感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage，PAM），通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSV感染PAM細(xì)胞后在mRNA水平上誘導(dǎo)IFN-λ1和IFN-λ3表達(dá)上調(diào)，且IFN-λ3比IFN-λ1上調(diào)更明顯。劉勇仕等[14]在重組植物乳桿菌表面錨定表達(dá)豬IFN-λ3，利用重組菌刺激細(xì)胞后，通過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該重組菌能夠顯著抑制PEDV在IPEC-J2中的復(fù)制，并能誘導(dǎo)細(xì)胞中ISGs的高轉(zhuǎn)錄水平。

研究表明，在腸上皮屏障限制病毒感染的過程中，與pIFN-λ1相比，pIFN-λ3具有更高效的抑制豬腸道冠狀病毒感染的作用，說明pIFN-λ3抗病毒活性優(yōu)于pIFN-λ1[6,15]，這為后續(xù)豬源III型干擾素的研究提供了一個(gè)新的方向和思路。因此，本研究克隆了豬源IFN-λ3基因，利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其蛋白，收集轉(zhuǎn)染后上清并在PK15、MDCK細(xì)胞上進(jìn)行抗病毒活性實(shí)驗(yàn)，利用結(jié)晶紫染色法、熒光觀察法和流式細(xì)胞術(shù)三種方法分析結(jié)果。結(jié)果表明，表達(dá)pIFN-λ3的上清能夠在體外抑制VSV對(duì)細(xì)胞的感染能力，且在不同來源的細(xì)胞上存在程度不同的抗病毒活性，為后續(xù)深入研究pIFN-λ3對(duì)于其他病毒的抗病毒活性提供了參考。