陳 靜，張麗榮，童 武，葉 超，童光志，鄭 浩

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

偽狂犬病（pseudorabies，PR）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的急性、熱性傳染病。PRV能感染多種家畜和野生動物，如豬、牛、羊、犬、鼠等。豬是PRV的唯一自然宿主，對其他動物均引起致死性感染。感染能引起仔豬高死亡率，造成母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，公豬多表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮、種用性能降低等危害[1,2]，給養(yǎng)豬業(yè)可造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。通過接種基因缺失弱毒疫苗和相應(yīng)的鑒別診斷方法，我國一些豬場已控制或根除了偽狂犬病，但是大部分地區(qū)仍存在該病的流行，特別是2011年末以來PRV變異株在我國的爆發(fā)流行，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3-6]。

PRV在感染耐過豬中能形成潛伏感染。潛伏感染期間病毒基因組不復(fù)制，也不表達(dá)病毒蛋白，僅大量轉(zhuǎn)錄病毒潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（latency-associated transcripts，LATs）[7]。LATs由大的潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（large latency transcripts，LLT）分子剪接加工形成，尚未發(fā)現(xiàn)LATs存在編碼產(chǎn)物[8]。病毒基因組雖然在潛伏期間不復(fù)制，但是仍然保留其全部功能。潛伏感染再激活后，基因組重新復(fù)制并釋放病毒粒子感染其他動物[9,10]，這也是豬偽狂犬病難以根除的主要原因。

細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）是可以插入100～300 kb DNA片段的克隆載體。PRV感染性BAC克隆，是將PRV全基因組克隆至BAC載體，以質(zhì)粒的形式在大腸桿菌中穩(wěn)定的遺傳增殖[11]。提取BAC克隆載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能獲得感染性病毒。由于克隆中病毒序列較長，突變BAC克隆中的病毒序列，需要借助一些特定的篩選方法。galK（半乳糖激酶）正負(fù)篩選系統(tǒng)是操作BAC克隆的常用方法。galK與galK-宿主菌結(jié)合，置換下需要突變病毒序列。在含有半乳糖作為碳源的平板上選擇galK+的重組細(xì)菌，然后負(fù)篩選，以含有特定DNA突變的片段取代galK基因，在甘油作為碳源，含有2-脫氧-D-半乳糖（2-Deoxy-D-galactose，DOG）的平板上篩選。DOG能被galK磷酸化為有毒的不可代謝中間體2-脫氧-半乳糖-1-磷酸，從而抑制galK+細(xì)菌生長，在篩選平板上長出的菌落即為galk基因被目的片段置換的克隆菌[12]。

本實驗室已經(jīng)成功構(gòu)建PRV JS-2012株的BAC克隆，即pBAC-JS2012。將pBAC-JS2012電轉(zhuǎn)入大腸桿菌SW102菌株中獲得SW102-BAC，再結(jié)合galK正負(fù)篩選系統(tǒng)，成功構(gòu)建了PRV感染性細(xì)菌人工染色克隆體操作平臺[13]，可以操作PRV的任何基因。本研究利用已構(gòu)建的操作平臺，獲得缺失LLT啟動子LAP1并添加cHS4的BAC載體pBAC-JS-cHS4-△LAP1b。通過與質(zhì)粒pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，獲得不含BAC載體的突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b，分析突變病毒的體外生物學(xué)特性。通過RT-PCR探究突變病毒感染Vero細(xì)胞后LLT的表達(dá)特征，進(jìn)而研究該突變病毒對病毒復(fù)制、致病性及LLT調(diào)控的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞、載體和菌株P(guān)RV JS-2012由本實驗室分離鑒定并保存[14]；Vero細(xì)胞、pGalK質(zhì)粒、pBluescriptⅡSK（+）載體、含JS-2012株BAC克隆pBAC-JS2012的大腸桿菌菌株SW102-BAC均由本實驗室保存[13]。

1.2 工具酶和主要試劑限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司；Lipofectamine 3000 Transfection Kit購自Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自ThermoFisher公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、OPTI-MEM、0.25%Trypsin-EDTA（1×）和Penicillin Streptomycin購自Gibco公司；DMEM購自Sigma公司；膠回收試劑盒購自廣州東盛科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自Macherey-Nagal公司；PCR試劑購自TaKaRa公司；M63 Broth、D-Biotin、Chloramphenicol、D-Galactose和2-Deoxy-D-galactose購自生工生物（上海）有限工程公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、氨芐青霉素購自北京天根公司。

1.3 序列合成和引物設(shè)計含絕緣子cHS4序列的pUC57載體，由金唯智生物科技公司合成。根據(jù)已發(fā)表的偽狂犬病病毒JS-2012基因組序列（GeneBank登錄號：KP257591.1），設(shè)計缺失啟動子LAP1的左右同源臂L1和R2引物：LATL1F/LATL1R、LATR2F/LATR2R。結(jié)合載體pGalK序列，設(shè)計擴增含同源臂的galK引物：LatgalKF/LatgalKR；設(shè)計正篩選檢測galK是否成功插入SW102-BAC中的引物：LatDF/LgalKdown；設(shè)計檢測負(fù)篩選是否成功的引物：PL1F/PR2R。根據(jù)LLT的ORF1和ORF2序列設(shè)計RT-PCR的引物：LLTORF1-RT和LLT-ORF2-RT，檢測ORF1 cDNA的引物：651F/946R，以及檢測ORF2 cDNA的引物：393F/697R。以上引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本研究設(shè)計引物信息Table1 Primers used in this study

1.4 轉(zhuǎn)移載體pBluescript-L1-cHS4-R2的構(gòu)建以JS-2012為模板，使用LATL1F/LATL1R和LATR2F/LATR2R引物分別擴增同源臂左臂L1和右臂R2。用XhoⅠ和BamHⅠ酶切左臂L1，用BglⅡ和XbaⅠ酶切右臂R2，用XhoⅠ和XbaⅠ酶切pBluescriptⅡSK（+）載體，用XhoⅠ和BamHⅠ酶切載體pUC57-cHS4。T4切膠回收的pUC57-cHS4大片段和左臂L1用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取載體pUC57-L1-cHS4。用XhoⅠ和BglⅡ酶切pUC57-L1-cHS4載體，回收目的片段L1-cHS4。將酶切后的pBluescriptⅡSK（+）載體、右臂R2、L1-cHS4通過T4-DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluescript-L1-cHS4-R2，使用XhoⅠ和XbaⅠ進(jìn)行初步酶切鑒定。

1.5 galK正負(fù)篩選系統(tǒng)

1.5.1 擴增galK基因 以載體pGalK為模板，使用引物L(fēng)atgalkF/LatgalkR擴增galK基因片段并膠回收擴增產(chǎn)物。

1.5.2 galK正篩選 首先復(fù)蘇含有BAC載體的JS-2012菌液SW102-BAC，制作正篩選電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，將galK片段電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件：1800 V、200 Ω、20 μF、1 mm。用M9鹽溶液洗3遍后涂正篩選平板，32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；挑取單菌落于氯霉素培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min培養(yǎng)16 h；用引物L(fēng)atDF/Lgalkdown檢測菌液，選擇陽性菌液并涂麥康凱平板進(jìn)行篩選、純化，挑取麥康凱平板上的紅色單菌落于氯霉素平板上繼續(xù)純化；對純化后的菌液SW102-BAC-galK進(jìn)行鑒定和測序，測序成功的菌液保存于-80℃。

1.5.3 galK負(fù)篩選 以構(gòu)建的負(fù)篩選載體pBluescript-L1-cHS4-R2為模板，使用引物L(fēng)ATL1F/LATR2R擴增目的片段L1-cHS4-R2。復(fù)蘇正篩選獲得的含galK的陽性菌液SW102-BAC-galK，制作負(fù)篩選感受態(tài)細(xì)胞。將目的片段L1-cHS4-R2電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件：1800 V、200 Ω、20 μF、1 mm；用M9鹽溶液洗3遍后涂負(fù)篩選平板，32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；挑取單菌落于氯霉素培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min培養(yǎng)16 h；用引物PL1F/PR2R檢測菌液，選取陽性菌液涂氯霉素平板進(jìn)行純化；對純化后的菌液SW102-BAC-cHS4-△LAP1b進(jìn)行鑒定和測序，測序成功的菌液保存于-80℃。提取菌液SW102-BAC-cHS4-△LAP1b的BAC DNA：pBACJS-cHS4-△LAP1b，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病毒拯救

1.6.1 拯救病毒vJS-cHS4-△LAP1b-BAC 用Lipofectamine 3000 Transfection Kit將2 μg pBACJS-cHS4-△LAP1b轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中，待細(xì)胞80%病變時收取上清，獲得病毒vJS-cHS4-△LAP1b-BAC，保存于-80℃。

1.6.2 拯救病毒vJS-cHS4-△LAP1b 用Lipofectamine 3000 Transfection Kit將2 μg pBAC-JS-cHS4-△LAP1b和1 μg pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中，待細(xì)胞80%病變時收取上清，通過三輪空斑純化，獲得不含綠色熒光、刪除BAC載體的突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b，保存于-80℃。

1.7 病毒體外生物學(xué)特性分析

1.7.1 病毒一步生長曲線 將親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b按照MOI=1的接毒量稀釋，分別接種于長滿Vero細(xì)胞的T25細(xì)胞瓶中，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，用0% DMEM洗2遍，加入5 mL 2%FBS的DMEM置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接毒后第4、8、12、16、20、24、28、32 h收取上清病毒液500 μL，并補加500 μL 2% FBS的DMEM。將不同時間點的病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10-1稀釋至10-8，并接種于長滿Vero細(xì)胞的96孔板中，每個稀釋度接8個孔，并做兩個重復(fù)。接毒后的96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。4 d后記錄病變孔數(shù)，用Reed-Muench法計算每個病毒的TCID50，并通過GraphPad軟件繪制該病毒的一步生長曲線圖。

1.7.2 病毒空斑實驗 首先配制空斑實驗所需要的2%低熔點凝膠培養(yǎng)基：高壓滅菌后的低熔點凝膠與2×MEM按照1∶1比例混勻，并加入2%FBS，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱備用。親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b按照 MOI=1的接毒量稀釋后，分別接種于長滿Vero細(xì)胞的六孔板內(nèi)，于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h；棄去病毒液，用PBS洗兩遍，每孔加入2.5 mL配置好的2%低熔點瓊脂培養(yǎng)基，室溫凝固；倒置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，70 h后用龍膽紫染色，觀察空斑大小和形態(tài)。

1.8 vJS-cHS4-△LAP1b LLT表達(dá)特征的RT-PCR檢測按照MOI=0.5接毒量，將親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b分別接入長滿Vero細(xì)胞的六孔板中，待細(xì)胞病變打到80%，提取細(xì)胞的總RNA進(jìn)行DNaseⅠ處理。用反轉(zhuǎn)錄引物L(fēng)LT-ORF1-RT和LLT-ORF2-RT通過RT-PCR將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA用651F/946R引物檢測LLT ORF1，用393F/697R引物檢測LLT ORF2。

2 結(jié)果

2.1 pBluescript-L1-cHS4-R2載體的構(gòu)建及鑒定以JS-2012為模板，PCR獲得204 bp的左臂L1，以及269 bp的右臂R2。將酶切后的左臂L1和載體pUC57-cHS4連接構(gòu)建載體pUC57-L1-cHS4。酶切載體pUC57-L1-cHS4和pBluescriptⅡSK（+），膠回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的pBluescriptⅡSK（+）、R2和L1-cHS4連接成為載體pBluescript-L1-cHS4-R2。將酶切鑒定成功的質(zhì)粒送公司測序，測序結(jié)果正確的載體-20℃保存。

2.2 正篩選鑒定結(jié)果以pGalK序列為模板，擴增galK基因片段，大小為1336 bp。將galK片段電轉(zhuǎn)入SW102-BAC中。從正篩選平板上挑取單菌落20個，用引物L(fēng)atDF/Lgalkdown進(jìn)行菌液PCR鑒定。電泳結(jié)果顯示，有9個與預(yù)期大小一致的陽性克隆菌液SW102-BAC-galK（圖1）。將陽性克隆菌液涂麥康凱平板進(jìn)行篩選、純化，挑取麥康凱平板上的紅色單菌落涂氯霉素平板純化后送公司測序，最終測序結(jié)果與預(yù)期序列相符合。

2.3 負(fù)篩選鑒定結(jié)果L1-cHS4-R2片段電轉(zhuǎn)入SW102-BAC-galK菌后，將轉(zhuǎn)化菌液涂負(fù)篩選平板。從負(fù)篩選平板上挑取單菌落，用引物PL1F/PR2R進(jìn)行菌液PCR鑒定。電泳結(jié)果顯示，有13個與預(yù)期大小一致的陽性克隆SW102-BAC-cHS4-△LAP1b（圖2）。將陽性克隆的菌液涂氯霉素平板純化后送公司測序，最終測序結(jié)果與預(yù)期序列相符合。

圖1 galK正篩選鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of positive selection

圖2 負(fù)篩選鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of negative selection

2.4 突變病毒的篩選及純化將突變病毒pBAC-JS-cHS4-△LAP1b轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中，獲得病毒vJS-cHS4-△LAP1b-BAC，該突變病毒感染Vero細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光蛋白。將突變病毒pBAC-JS-cHS4-△LAP1b和pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后，經(jīng)過三輪空斑純化，最終獲得不含綠色熒光并完全刪除BAC載體的突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b（圖3）。

2.5 病毒一步生長曲線親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b接種Vero細(xì)胞后，根據(jù)不同時間點的病毒滴度繪制病毒一步生長曲線（圖4）。結(jié)果顯示，突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b的復(fù)制速度與親本病毒JS-2012基本一致。

2.6 病毒空斑大小及形態(tài)親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b接種Vero細(xì)胞后，用2%低熔點瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)70 h后進(jìn)行龍膽紫染色，觀察親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b空斑大小和形態(tài)（圖5）。結(jié)果顯示，突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b與親本病毒JS-2012相比，空斑大小和形態(tài)基本一致。

2.7 病毒LLT RT-PCR檢測結(jié)果親本病毒JS-2012和突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b分別感染Vero細(xì)胞后，提取細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對LLT的ORF1和ORF2 PCR檢測結(jié)果表明，親本病毒和突變病毒感染Vero細(xì)胞后LLT ORF1（大小為296 bp）和ORF2（大小為305 bp）均能表達(dá)（圖6）。

圖3 突變病毒篩選純化圖Fig.3 Screening and purification of mutant virus

圖4 親本病毒與突變病毒一步生長曲線Fig.4 Single-step growth curves of the parental virus and mutant virus

圖5 親本病毒和突變病毒空斑大小和形態(tài)Fig.5 Plaque size and morphology of the parental virus and mutant virus

圖6 親本病毒和突變病毒LLT的表達(dá)特征Fig.6 Expression feature of LLT of the parental virus andmutant virus

3 討論

PRV具有的潛伏感染及再激活的特性是其能夠在豬群中持續(xù)存在的重要原因之一[9]，但是具體調(diào)控機制尚不清楚。由于PRV基因組龐大，在構(gòu)建突變病毒時不易操作，很大程度上阻礙了PRV相關(guān)病原生物學(xué)特性和調(diào)控機制研究的進(jìn)展[15]。

本研究基于實驗室前期已經(jīng)成功構(gòu)建的pBACJS2012載體和galK正負(fù)篩選系統(tǒng)技術(shù)[13]，操作簡單、快速高效、準(zhǔn)確率高，不引入其他外源序列。通過將JS-2012基因組插入BAC載體，實現(xiàn)了在原核生物系統(tǒng)對PRV基因組進(jìn)行拷貝的擴增、提取和保存。同時進(jìn)一步利用galK系統(tǒng)，實現(xiàn)了在原核生物系統(tǒng)中對PRV基因組特定基因組件進(jìn)行替換、刪除和插入。本研究將PRV LLT的啟動子LAP1成功缺失，并且利用真核細(xì)胞系統(tǒng)的cre酶，獲得不含BAC載體的突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b，繼而可以研究該突變病毒感染Vero后，PRV LLT的表達(dá)特征。對該突變病毒添加絕緣子cHS4是為了抑制啟動子上游某些調(diào)控序列對下游啟動子活性的影響。

通過對突變病毒的體外生物學(xué)特性分析，我們發(fā)現(xiàn)突變病毒與親本病毒JS-2012空斑形態(tài)和大小基本一致。一步生長曲線也表明突變病毒的復(fù)制速度與親本病毒JS-2012基本一致。空斑實驗和一步生長曲線均表明，突變病毒與親本病毒JS-2012體外生物學(xué)特性基本一致。由此可知，將PRV病毒LLT啟動子LAP1缺失后，對于病毒在體外的復(fù)制和擴散能力沒有顯著影響。不過突變病毒在動物體內(nèi)的感染致病特性是否發(fā)生改變，還需要相應(yīng)的體內(nèi)實驗來進(jìn)行驗證。

為探究LAP1對LLT相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況的影響，本研究將突變病毒和親本病毒分別感染Vero細(xì)胞后，對潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本LLT的ORF1和ORF2表達(dá)情況進(jìn)行了RT-PCR檢測。結(jié)果表明，同親本病毒一樣，突變病毒依然能檢測到LLT的ORF1和ORF2?？梢?，在體外裂解性感染中，缺失LLT啟動子LAP1并不能關(guān)閉LLT的表達(dá)。但LAP1的缺失是否影響LLT的表達(dá)量？后續(xù)我們將進(jìn)行熒光定量分析，確定該突變病毒vJS-cHS4-△LAP1b與親本病毒JS-2012在LLT表達(dá)量上的差異，以及LLT上非編碼miRNA的表達(dá)情況，從而闡明啟動子LAP1對LLT轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特征的影響機制，以及對病毒潛伏感染能力的影響。