葉生梅,嚴(yán) 航，程其國(guó)

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

世界衛(wèi)生組織發(fā)表文章呼吁應(yīng)對(duì)全球耐藥感染問(wèn)題，并援引英國(guó)經(jīng)濟(jì)學(xué)家吉姆·奧尼爾(JimOnell)爵士發(fā)表的《全球抗菌素耐藥回顧》報(bào)告及建議指出，到2050年，抗菌素耐藥每年會(huì)導(dǎo)致1 000萬(wàn)人死亡。如果任其發(fā)展，可累計(jì)造成100萬(wàn)億美元的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。尋找和開(kāi)發(fā)無(wú)毒、無(wú)副作用的新型抗菌物質(zhì)是解決致病菌抗藥性問(wèn)題的一條有效途徑[1-4]，而芽孢桿菌，特別是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌是一種在土壤和環(huán)境中常見(jiàn)的細(xì)菌，營(yíng)養(yǎng)要求低，繁殖力強(qiáng)，能形成芽孢，抗逆性強(qiáng)；它們能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物微生態(tài)平衡、促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)、降低病原菌的數(shù)量,從而增加動(dòng)物機(jī)體的抗病力和提高機(jī)體的免疫功能[5-6]。研究表明，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白酶、淀粉酶、抗菌蛋白、抗菌多肽類物質(zhì)和一些小分子活性物質(zhì)等,因此芽孢桿菌成為人們高度重視和研究的一類微生物[7-10]。

實(shí)驗(yàn)室篩選到一株芽孢桿菌BLy，其對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用。對(duì)菌株BLy進(jìn)行鑒定，并研究抑菌物質(zhì)的抗菌譜和有關(guān)性質(zhì)，為進(jìn)一步研究其抑菌物質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)及抑菌機(jī)理等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌株：芽孢桿菌BLy(BacillusBLy)，安徽工程大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

抗菌活性測(cè)定指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、紅酵母(Rhodotorulasp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、根霉菌(Rhizopussp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)等，均由安徽工程大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑及儀器

試劑：酵母膏和蛋白胨(Oxoid公司)；TaqDNA聚合酶、dNTP(TaKaRa公司)；胰蛋白酶1∶250(豬胰)(滬試)；枯草桿菌蛋白酶10萬(wàn) U/g(MACKLIN)；蛋白酶K 20 mg/mL Solution(SANGON.COM)；葡聚糖凝膠G75(Sephadex G-75)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：S1000PCR儀(BIO-RAD);GDS-8000 System凝膠成像系統(tǒng)(UVP Biolmaging systems);H-1850型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；DYY-6D型電泳儀(北京六一儀器廠)；BM1000生物顯微鏡(江南永新光學(xué))。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15～20 g(BL液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，用于細(xì)菌的保藏和培養(yǎng)。

菌株BLy產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)[11]方法配置，用于真菌的保藏和培養(yǎng)。

1.4 菌株BLy的鑒定

(1)BLy的形態(tài)、生理生化特性測(cè)定。按照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)(菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色)及生理生化試驗(yàn)(接觸酶試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、蛋白質(zhì)及碳源利用實(shí)驗(yàn)等)。

(2)菌株BLy的16SrDNA基因測(cè)序及分析。BLy基因組DNA的提取采用文獻(xiàn)[11]方法，挑取BLy菌株的一個(gè)單菌落放入裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中于37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12～18 h)。培養(yǎng)液用于基因組DNA提取。16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增引物為通用引(F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG;R:TAGGGTTACCTTGTTACGACTT)(上海生工合成)，反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μL；4種dNTP混合物(10 mmol/L)0.5 μL；上游引物(-F)(10 pmol/L)1.0 μL；下游引物(-R)(10 pmol/L)1.0 μL；模板DNA 0.8 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；無(wú)菌去離子水補(bǔ)加18.7 μL至反應(yīng)體積25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性50s→52 ℃退火50s→72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)為72 ℃延伸10 min。取5 μL反應(yīng)液1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序得到的堿基序列在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，找出數(shù)據(jù)庫(kù)中與該菌株同源性較高的模式菌株。然后利用MEGA 5.1軟件對(duì)BLy菌株和其同源性菌株進(jìn)行16SrDNA序列比對(duì),并將比對(duì)結(jié)果用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 方法

(1)菌株BLy的種子培養(yǎng)和發(fā)酵?；罨腂Ly斜面菌種一環(huán)接種于裝有液體LB的三角燒瓶，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12～18 h獲得菌株BLy種子液。吸取1 mL種子液轉(zhuǎn)接于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，得發(fā)酵液。

(2)菌株Bly產(chǎn)抑菌物質(zhì)的無(wú)菌發(fā)酵液的制備。取發(fā)酵液于10 000 r/min下，離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾，得到無(wú)菌發(fā)酵液。

(3)抗菌活性測(cè)定指示菌的種子制備。取活化的各細(xì)菌菌種一環(huán)接種于裝有液體LB的三角燒瓶，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～18 h獲得各細(xì)菌的種子液。霉菌的種子是孢子數(shù)1×105個(gè)/mL的孢子懸液。

(4)抗菌活性的測(cè)定。采取抑菌圈法[13],取0.1 mL指示菌的種子液于裝有20 mL滅菌的冷卻到約45 ℃的LB培養(yǎng)基，搖勻后倒入培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，待凝固后利用無(wú)菌打孔器在培養(yǎng)基上打孔(直徑為5 mm)。吸取BLy的無(wú)菌發(fā)酵液于平板孔內(nèi)，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)試樣三平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑的大小。用PDA培養(yǎng)基同樣方法測(cè)定抗真菌活性。

1.6 菌株BLy產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程

每隔2 h取一次BLy發(fā)酵液，以600 nm吸光度(OD600 nm)測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線。按1.5(2)方法制備無(wú)菌發(fā)酵液。以金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.5(4)抑菌圈法測(cè)定抑菌活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。

1.7 菌株BLy的抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)

(1)溫度對(duì)BLy抑菌物質(zhì)活性的影響。將培養(yǎng)12 h的無(wú)菌上清液分裝于無(wú)菌試管中，分別置入50 ℃、80 ℃、100 ℃水浴鍋中保溫30 min，以不做任何處理無(wú)菌上清液為對(duì)照。處理后冷卻至室溫，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)量各樣液的抑菌活性。

(2)pH對(duì)BLy抑菌物質(zhì)活性的影響。分別用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液將發(fā)酵液pH分別調(diào)為3.0～12.0，將樣液室溫保存過(guò)夜后用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液分別將各樣液pH值調(diào)回至7.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)量各無(wú)菌樣液的抑菌圈。

(3)水解酶對(duì)BLy抑菌物質(zhì)活性影響。分別配制胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K，再將各酶液加入到裝有無(wú)菌上清液的試管中，使酶的終濃度分別是胰蛋白酶250 U/mL，枯草桿菌蛋白酶60 U/mL，蛋白酶K 60 U/mL，置于37 ℃下保溫1 h。以未處理的無(wú)菌發(fā)酵液作為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)量各樣液的抑菌圈。

1.8 拮抗物質(zhì)的分離純化

(2)提取蛋白的色譜柱層析進(jìn)一步分離。將葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)裝柱完成后，連接層析系統(tǒng)，用0.9% NaCl溶液作為洗脫液。洗脫液的流速為0.5 mL/min。分部收集洗脫流出液，5 min/管。核酸蛋白檢測(cè)儀調(diào)節(jié)為波長(zhǎng)280 nm，記錄儀走紙速度設(shè)為2 mm/min。通過(guò)2～3 BV的洗脫液使柱床平衡。待層析柱平衡以后，將鹽析分離的混合蛋白質(zhì)溶液緩慢地加入層析柱上端中央后立即用0.9%的NaCl溶液洗脫，觀察記錄儀的出峰情況。將出峰相應(yīng)段的鄰試管中的液體合并。將不同峰段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液取出編號(hào)，適度的濃縮后，經(jīng)過(guò)0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾到無(wú)菌管內(nèi)，吸取20 μL無(wú)菌處理液加入同一個(gè)接有金黃色葡萄球菌的平皿中做抑菌實(shí)驗(yàn)，37 ℃下保溫24 h,測(cè)量各組分液的抑菌圈大小，對(duì)其抑菌活性進(jìn)行評(píng)估，從而得出具有抑菌活性的物質(zhì)位于哪個(gè)組分。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BLy的鑒定

(1)形態(tài)和生理生化鑒定。菌株BLy菌落形態(tài)及染色觀察如圖1所示。由圖1a可知，菌株BLy菌落表面粗糙，乳白色,不透明，中間略有隆起，菌落邊緣向外擴(kuò)展，不整齊，呈鋸齒狀。由圖1b可知，其液體震蕩培養(yǎng)呈渾濁分散狀態(tài)。該菌株革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，菌體單個(gè)或成對(duì)排列。由圖1c可知，芽孢桿狀，近中生，芽孢囊稍膨大。對(duì)菌株BLy進(jìn)行生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

從菌落形態(tài)、個(gè)體染色觀察和生理生化特性判斷，此菌株與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)中的地衣芽孢桿菌比較接近，初步確定菌株BLy為地衣芽孢桿菌。

圖1 菌株BLy菌落形態(tài)及染色觀察

表1 菌株Bly形態(tài)學(xué)及生理生化特性

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)

(2)菌株BLy 16SrDNA克隆及序列分析。用高滲法制備BLy菌株總DNA后，用制備的BLy菌株總DNA進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度在1 500 bp左右。

將BLy菌株的16SrDNA序列在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，BLy菌株與地衣芽孢桿菌具有99%的同源性。利用MEGA 5.1軟件對(duì)所測(cè)定的BLy菌株與和它同源性最高的菌種的16SrDNA全序列進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，并根據(jù)遺傳距離得到了該菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，鑒定菌株BLy屬于地衣芽孢桿菌。

圖2 BLy菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 菌株BLy產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵過(guò)程

測(cè)定不同時(shí)間的BLy菌發(fā)酵液的OD600 nm，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每孔中加入15 μL BLy無(wú)菌發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)24 h的抑菌圈，得到了BLy菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵過(guò)程曲線如圖3所示。從圖3分析可知，以LB培養(yǎng)基發(fā)酵，BLy菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性隨發(fā)酵時(shí)間而變化，在菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期抑菌物質(zhì)積累最快，8～12 h抑菌物質(zhì)增加緩慢，12 h抑菌活性達(dá)到最大，隨后下降。以LB為培養(yǎng)基，其產(chǎn)抑菌物質(zhì)的合適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為10～12 h，可見(jiàn)BLy產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵周期與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的24 h以及文獻(xiàn)[14]的48 h相比，發(fā)酵時(shí)間短，更易于生產(chǎn)和節(jié)約成本。15 μL BLy發(fā)酵10 h的無(wú)菌液與15 μL 10 U/mL青霉素對(duì)S.aureus的抑菌效果如圖4所示。由圖4可知，BLy對(duì)S.aureus抑制作用強(qiáng)，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

圖3 菌株Bly生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程

圖4 BLy 10 h發(fā)酵液與10 U/mL青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.3 菌株BLy抑菌譜

通過(guò)抑菌圈法測(cè)定20 μL BLy菌株的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等的抑制作用。BLy的抗菌譜如表2所示。從表2中可以看出，BLy菌株的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌有微弱的抑制作用，在試驗(yàn)條件下對(duì)供試的其他菌株沒(méi)有抑制作用。由此可見(jiàn)，菌株BLy產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是窄譜抗菌的，與文獻(xiàn)[15-16]中的廣譜抑菌報(bào)道的不同，說(shuō)明其抑菌活性物質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)有不同特性，有待進(jìn)一步研究。

表2 BLy的抗菌譜

菌種抑菌圈/mm金黃色葡萄球菌21.5枯草芽孢桿菌8.0大腸桿菌-啤酒酵母-紅酵母-

注：“-”表示沒(méi)有抑制作用

2.4 BLy產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)

(1)溫度對(duì)抑菌活性的影響。將BLy培養(yǎng)12 h的菌液上清液除菌后60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴保溫30 min，冷卻到室溫取20 μL測(cè)定對(duì)S.aureus的抑菌活性。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

(2)pH對(duì)抑菌活性的影響。研究中用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH分別至3.0～12.0放置4 ℃過(guò)夜，再用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCL將pH調(diào)至7.0，0.22 μm過(guò)濾除菌，取20 μL除菌液測(cè)定對(duì)S.aureus的抑菌圈。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 溫度和pH對(duì)Bly發(fā)酵液抑菌作用的影響

(3)水解酶對(duì)抑菌活性的影響。發(fā)酵上清液中酶的終濃度分別是胰蛋白酶250 U/mL，枯草桿菌蛋白酶60 U/mL，蛋白酶K 60 U/mL，37 ℃反應(yīng)1.0 h。用0.22 μm過(guò)濾除菌，取20 μL除菌液測(cè)定對(duì)S.aureus的抑菌圈。測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 水解酶對(duì)Bly發(fā)酵液抑菌活性的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BLy產(chǎn)生的抗菌活性成分能耐環(huán)境pH的變化，說(shuō)明活性物質(zhì)是具有酸堿兩性的電解質(zhì)，具有一定的緩沖能力；而耐熱和抗水解酶等的作用說(shuō)明抗菌活性成分不是大分子蛋白質(zhì)類，綜合分析菌株BLy產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)可能是抗菌多肽(AMP)類。

2.5 Bly產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的分離純化結(jié)果

菌株BLy發(fā)酵液中的拮抗物質(zhì)經(jīng)除菌體，硫酸銨鹽析，葡聚糖凝膠柱層析步驟分離后，拮抗物質(zhì)的混合蛋白液葡聚糖凝膠G75(SephadexG-75)色譜層析結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，從發(fā)酵液中提取的混合蛋白經(jīng)Sephadex G-75層析分離以后，可粗略地分離為兩個(gè)組分(命名為δ1和δ2)，將兩個(gè)組分分別收集后做抑菌實(shí)驗(yàn)，組分δ1沒(méi)有抑菌圈(為陰性“-”)，而組分δ2有抑菌圈(為陽(yáng)性“+”)，說(shuō)明具有抗菌活性的組分存在于分子量相對(duì)較小的δ2組分當(dāng)中。

圖5 混合蛋白液色譜層析結(jié)果

3 討論

研究表明，菌株BLy在分類上屬于地衣芽孢桿菌，能產(chǎn)生對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)的抑制作用的活性物質(zhì)；菌株利用LB培養(yǎng)基產(chǎn)抑菌物質(zhì)，在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約10～12 h達(dá)到最大抑菌活性，比In-CheolYe[1]報(bào)道的24 h以及Nithyalakshmy Rajarajanbao[14]報(bào)道的48 h短；對(duì)BLy的抗菌譜測(cè)定表明其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用效果比革蘭氏陰性菌好，且對(duì)供試真菌沒(méi)有抑菌作用。與高兆建[15]和李清[16]報(bào)道的廣譜抗菌不同，地衣芽孢桿菌BLy抗菌肽具有窄的抗菌譜,說(shuō)明它的代謝產(chǎn)物有較好的選擇抗性,具有成為篩選具有選擇抗性的活性化合物的菌種資源的潛力；菌株BLy產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐熱性能，100 ℃保溫30 min仍保持48.19%的抑菌性能，與In-Cheol Ye[1]報(bào)道的地衣芽孢桿菌100 ℃處理后失去抑菌活性不同。且耐環(huán)境pH、抗蛋白酶等水解酶的水解作用，說(shuō)明具有抗菌活性成分，是分子量相對(duì)較小的組分，初步確定菌株BLy產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)為抗菌肽(AMP)。

隨著致病菌對(duì)抗生素耐藥性的不斷出現(xiàn),研發(fā)新型抗菌藥物已迫在眉睫。抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)具備多生物活性的小分子多肽,是機(jī)體天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制使細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，從而倍受人們關(guān)注。從動(dòng)、植物體內(nèi)直接提取抗菌肽的難度大、工藝要求高，難以應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)，并且對(duì)于某些高等生物或人類源而言抗菌肽難以實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有bacitracin，polymyxinE，gramicidinS和nisin等4種類型，革蘭陰性菌或陽(yáng)性菌均可分泌[3,17-18]。而細(xì)菌具有生長(zhǎng)快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短、短期內(nèi)可獲得大量的代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。研究中的地衣芽孢桿菌BLy為具有益生作用的菌種，環(huán)境友好、易于培養(yǎng)、金黃色葡萄球菌在醫(yī)學(xué)臨床上是對(duì)青霉素等抗生素產(chǎn)生耐藥性的微生物。菌株BLy的抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有特異性抑制，有一定研究?jī)r(jià)值。有關(guān)BLy產(chǎn)生的抗菌肽的進(jìn)一步分離純化，抗菌活性物質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)及抗菌機(jī)理等有待進(jìn)一步研究。