趙 俊，田會(huì)玲，李昱頡，羅 彤，艾麗雅，房毓敏，趙江豪，賽音朝克圖，李志剛△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065)

抑郁癥(depression)，在臨床屬于精神類疾病。由生物學(xué)因素、個(gè)體性格因素和社會(huì)心理因素綜合作用的結(jié)果，正是由于復(fù)雜的病因，使得抑郁癥的治療變得非常棘手。多數(shù)患者主要表現(xiàn)為持續(xù)的心情低落、喜歡獨(dú)處、焦慮和認(rèn)知能力下降、自殺率高等，給患者和家庭帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[1]。目前，全球約有3.5億人患有抑郁癥[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測到2030年抑郁癥將會(huì)成為全球疾病的頭號(hào)殺手[3]，嚴(yán)重威脅人類的身心健康。

上個(gè)世紀(jì)50年代，有人提出了抑郁癥的“單胺代謝異常假說”，認(rèn)為抑郁癥的病因可能是神經(jīng)突觸間的單胺遞質(zhì)濃度不足所致，進(jìn)一步認(rèn)為增加突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的含量是臨床治療抑郁癥的快速有效途徑之一。目前臨床治療的相關(guān)藥物大多基于單胺類假說設(shè)計(jì)，并且已觀察到抑郁癥患者大腦內(nèi)的5-HT含量明顯低于正常人[4]。

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中[5]。其可通過與靶基因mRNA3′非翻譯區(qū)(3′- untranslated region，UTR)結(jié)合，引起mRNA的降解，或者影響翻譯抑制，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)一些miRNA特異性的在大腦中表達(dá)[6-7]，在神經(jīng)元可塑性特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮著特殊作用。miRNA-16等作為5-HT系統(tǒng)上游的miRNA，成為潛在的抗抑郁靶點(diǎn)。

此外，Baudry[8]首次揭示了miRNA-16在氟西汀發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)中的關(guān)鍵角色 ：通過上調(diào) miRNA-16，進(jìn)而抑制5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)表達(dá)，改善抑郁樣大鼠行為。

基于此，本課題主要研究電針對CUMS抑郁模型大鼠海馬、中縫核miRNA-16表達(dá)的影響，并探討其5-HT系統(tǒng)尤其是對SERT的調(diào)控機(jī)制。現(xiàn)將研究結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為(180±20)g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，合格證編號(hào) ：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室自然光照，通風(fēng)良好，溫度(22±2)℃，相對濕度RH(35±2)%，條件相對較為穩(wěn)定。飼養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 鹽酸氟西汀膠囊(批號(hào) ：J20170022，禮來蘇州制藥有限公司);miRNA提取試劑盒(QIAGEN公司,批號(hào) ：148013644)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司,批號(hào) ：1405269)；蛋白質(zhì)分子量Marker(美國Bio-rad，批號(hào) ：310007919);SYBR mix試劑盒(羅氏公司,批號(hào) ：39088900);PVDF膜(德國Millipore，批號(hào) ：K1EA1531FK);感光膠片(美國柯達(dá)，批號(hào) ：020901701)；SERT一抗(美國abcam公司，貨號(hào) ：ab130130);GAPDH一抗(美國abcam公司，貨號(hào) ：ab8245);辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào) ：127917)。

1.1.3 主要儀器 根據(jù)Weaver[9]的實(shí)驗(yàn)方法，強(qiáng)迫游泳桶(高為50 cm，直徑為25 cm的圓柱形)。針具 ：選用0.25 mm×25 mm型中研太和牌一次性針灸針；韓氏電針儀(LH202，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司)；Real-Time PCR儀(美國ABI 7500)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國Bio-Rad)；垂直電泳槽(美國Bio-Rad)；紫外分光光度計(jì)(德國Eppendorf)。

1.2 分組、造模及干預(yù)方法

40只實(shí)驗(yàn)大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、氟西汀組、電針組，共4組，每組10只。

除正常對照組大鼠群養(yǎng)以外，其余各組須單籠孤養(yǎng)，并結(jié)合慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方法[10]制備抑郁大鼠模型,即每天隨機(jī)安排1種應(yīng)激方式，刺激順序隨機(jī)抽簽產(chǎn)生，同一刺激不能連續(xù)應(yīng)用，持續(xù)28天。分別為 ：禁食24 h；禁水24 h；4 ℃冷水游泳5 min；晝夜顛倒24 h；夾尾3 min；潮濕環(huán)境24 h；束縛3 h。

所有干預(yù)均于每日上午10點(diǎn)進(jìn)行，具體操作為 ：正常組正常飼養(yǎng)，自然飲水食，不接受刺激;模型組每日接受隨機(jī)慢性應(yīng)激造模刺激處理;氟西汀組每日應(yīng)激刺激后1 h，用生理鹽水配制1 mg/mL的氟西汀，按照2 mg/kg灌胃給藥;電針組應(yīng)激刺激1 h后，固定于自制鼠套中，參照張露芬[11]主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取相當(dāng)于人體解剖部位的“百會(huì)”穴和“印堂”穴，局部消毒后，選用0.25 mm×25 mm一次性針灸針刺激，針刺深度為5～10 mm，“印堂”向鼻部方向刺入，“百會(huì)”穴向后頭部刺入，小幅度輕捻轉(zhuǎn)后，針柄接韓氏電針儀，選用連續(xù)波，頻率設(shè)為2 Hz，電流強(qiáng)度1 mA，以引起大鼠頭部肌肉輕微顫動(dòng)而不嘶叫為宜，留針20 min，每天1次，連續(xù)28天。

1.3 檢測方法

1.3.1 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 通過記錄大鼠在水中被動(dòng)漂浮時(shí)間，評(píng)價(jià)大鼠的絕望水平。適應(yīng)性訓(xùn)練1天后 ：將大鼠放入強(qiáng)迫游泳桶中(直徑25 cm，高50 cm)強(qiáng)迫游泳6 min。于第2天的同一時(shí)間，將大鼠再次放入同一游泳桶中，為避免主觀因素干擾，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)保持安靜，采用盲法，將大鼠頭部面向桶壁緩慢放入桶內(nèi)，通過攝像機(jī)拍攝測試視頻并記算大鼠強(qiáng)迫游泳6 min，后4 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間(即被動(dòng)漂浮，受試大鼠僅有尾巴和前爪小幅度輕微運(yùn)動(dòng))的時(shí)間。每只大鼠測試后，須更換清水再進(jìn)行下一只大鼠的試驗(yàn)。于應(yīng)激前1天、應(yīng)激后1天進(jìn)行2次強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 RT-PCR技術(shù) 實(shí)驗(yàn)第29天，大鼠稱重后予10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速斷頭，在冰浴狀態(tài)下祛除顱骨，暴露腦組織，取出海馬、中縫核，分裝在編號(hào)的凍存管中，迅速放入-80℃冰箱中凍存。按照相應(yīng)試劑盒說明，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行指標(biāo)檢測。

miRNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取海馬、中縫核總RNA，用nanodrop(美國thermo scientific 公司)測定其濃度及純度；取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用于下一步的實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 預(yù)變性 94℃ 10 min；PCR反應(yīng):94℃ 15 s，60℃ 60 s，循環(huán)45次。用2-ΔΔCT公式計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)變化，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得每個(gè)樣本的miRNA-16含量，所得數(shù)據(jù)用對應(yīng)的U6進(jìn)行校正。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.3 Western blot法測定 將海馬、中縫核組織從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中進(jìn)行快速研磨，然后將粉末裝入預(yù)冷的EP管中，每管加入細(xì)胞裂解液50 uL，冰上放置20 min。然后4℃，10 000 r/min離心10 min，將上清移至另一預(yù)冷的EP管中，沉淀?xiàng)壷珺CA法測定蛋白含量后，將剩余蛋白樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min。再進(jìn)行制膠和上樣、電泳、蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移和膜封閉；封閉結(jié)束后，用TBS-T漂洗液洗膜10 min×3次，將膜移入雜交袋中，加入用適當(dāng)漂洗液稀釋的抗體(SERT為1∶1 000；GAPDH為1∶5 000)，封口，4℃孵育過夜；再用大量TBS-T漂洗液洗膜10 min×3次，然后將PVDF膜移入另一新的雜交袋，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(SERT為1∶2 000；GAPDH為1∶10 000)，37℃振蕩60 min，大量TBS-T漂洗液洗膜10 min×3次；滴加ECL發(fā)光液，于凝膠成像儀上采集分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)情況

實(shí)驗(yàn)應(yīng)激前1天，各組間大鼠強(qiáng)迫游泳后4 min不動(dòng)時(shí)間均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)激結(jié)束后1天，與正常對照組比較，模型組后4 min不動(dòng)時(shí)間延長(P<0.01)，大鼠提前表現(xiàn)絕望；與模型組比較，氟西汀組和電針組不動(dòng)漂浮時(shí)間減短(P<0.05)，大鼠延遲放棄掙扎，表現(xiàn)較活躍。見表2。

表2 各組大鼠應(yīng)激前后強(qiáng)迫游泳后4 min不動(dòng)時(shí)間比較

注:與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與氟西汀組比較，△P<0.05。

2.2 RT-PCR結(jié)果

與正常對照組比較，模型組大鼠中縫核miRNA-16含量升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，氟西汀組和電針組miRNA-16含量降低(P<0.05)；與氟西汀組相比較，電針組miRNA-16含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注 ：與正常對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05;與氟西汀組比較，△P<0.05。圖1 各組大鼠中縫核miRNA-16的相對表達(dá)量

與正常對照組比較，模型組大鼠海馬miRNA-16含量升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，氟西汀組miRNA-16含量降低(P<0.05)，電針組miRNA-16含量也降低(P<0.05)；與氟西汀組相比較，電針組miRNA-16含量降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2。

注 ：與正常對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠海馬miRNA-16的相對表達(dá)量

2.3 Western blot結(jié)果

與正常對照組比較，模型組大鼠中縫核SERT蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，電針組SERT含量有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組與氟西汀組相比較，表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖3、圖4。

注 ：與正常對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05。圖3 各組大鼠中縫核SERT蛋白的相對表達(dá)量

圖4 各組大鼠中縫核SERT蛋白表達(dá)含量比較

與正常對照組比較，模型組大鼠海馬SERT蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，電針組SERT含量有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組與氟西汀組相比較，表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖5、圖6。

注 ：與正常對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05。圖5 各組大鼠海馬SERT蛋白的相對表達(dá)量

圖6 各組大鼠海馬SERT蛋白表達(dá)含量比較

3 討論

關(guān)于抑郁癥，普遍認(rèn)為是一種涉及多系統(tǒng)、多通路的疾病?！端貑枴ち龤獯笳摗氛J(rèn)為土郁、木郁、金郁、火郁、水郁皆可致郁，并提出“郁極而發(fā)，待時(shí)而作”?！端貑枴け静≌摗吩?：“人憂愁思慮即傷心”。金元時(shí)期，朱震亨提出“六郁”之說，氣、血、痰、濕、火、食的六郁理論。直至明代《醫(yī)學(xué)正傳·郁證》才首提“郁病”病名，認(rèn)為郁病是包括情志、外邪、飲食等因素所致的廣義的郁。故情志之郁，在中醫(yī)中屬于狹義的“郁病”范疇。

病位初起脾胃，后及心腦、肝膽，終及于腎。病因多為思慮不遂，憂思傷脾，日久導(dǎo)致氣機(jī)郁滯、氣血生化乏源、陰陽失調(diào)，其核心病機(jī)為心血不足。中醫(yī)辨治抑郁癥，可涉及心、肝、脾、腎、腦，而腦屬腎，屬水。督脈，中也，起源于胞中，行于脊背正中，上達(dá)到巔頂穴，是陽脈之總綱，與腦的關(guān)系密切。百會(huì)和印堂為督脈的要穴，百會(huì)為一身之宗，百神之會(huì)也，且是足太陽膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，并因太陽膀胱經(jīng)上的背俞穴(如心俞、肝俞、脾俞、腎俞；神堂、魂門、意舍)而與五臟六腑關(guān)系密切，故能調(diào)和五臟神志，協(xié)調(diào)陰陽，通調(diào)髓海，大有百脈朝宗之效。而印堂穴具有安神醒腦、益智定驚之功。正所謂“經(jīng)脈所過，主治所及”，因此選取督脈上的大穴對與腦有關(guān)的神志疾病有一定的治療作用，符合中醫(yī)治病必求于本之說[12]。

雖然抑郁癥發(fā)病機(jī)制不明確，但病理因素與中樞神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究表明電針印堂穴后，神經(jīng)沖動(dòng)可直接入腦，引起單胺類等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[13]，從而產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)；電針百會(huì)穴能興奮上行激活系統(tǒng)[14]，進(jìn)而解除腦細(xì)胞的抑制狀態(tài)。神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的化學(xué)介導(dǎo)物質(zhì)，主要包含單胺類，如五羥色胺(5-HT)等參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理反應(yīng)[15]。SERT是一種對5-HT有高親和力的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在于大腦邊緣系統(tǒng)、肥大細(xì)胞、胃腸道嗜鉻細(xì)胞膜和5-HT能神經(jīng)元的突觸上[16]，神經(jīng)末梢突觸前膜分布較為廣泛。它從神經(jīng)末梢突觸間隙中重新再攝取5-HT進(jìn)入突觸前神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)輸，直接影響著突觸間隙5-HT的濃度及作用時(shí)間，從而有效終止了5-HT的信號(hào)傳遞[17]。5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)氟西汀是臨床治療抑郁癥的重要藥物。已有研究發(fā)現(xiàn)[18]，經(jīng)過長期氟西汀治療后，抑郁模型大鼠中縫核的miRNA-16表達(dá)水平有所升高，而SERT蛋白水平卻降低了；而將氟西汀注入中縫核區(qū)，與注射前比較，該區(qū)miRNA-16的水平亦升高。另外，向大鼠中縫核注入miRNA-16，可觀察到抑郁模型小鼠抑郁樣行為的改善現(xiàn)象[8]。宋明芬等[19]建立大鼠抑郁模型，測定中縫核SERT水平，將其與對照組進(jìn)行比較，結(jié)果表明，中縫核SERT高于對照組。

綜上，可以假設(shè)miRNA-16調(diào)節(jié)SERT表達(dá)的重要部位是中縫核，或者說中縫核在參與miRNA-16調(diào)節(jié)SERT的過程中發(fā)揮重要作用，miRNA-16可能通過影響中縫核SERT功能發(fā)揮其在抗抑郁藥療效以及抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的作用。但張逸等[20]在母愛剝奪模型組大鼠海馬中發(fā)現(xiàn)miRNA-16的相對表達(dá)量明顯高于對照組。另有一項(xiàng)研究中[21]，經(jīng)過長期治療，氟西汀能降低小鼠海馬miRNA-16。朱維煜等[22]在討論miRNA-16對5-HT再攝取的研究中，發(fā)現(xiàn)模型組海馬miRNA-16低于正常組，而經(jīng)氟西汀治療后，大鼠海馬內(nèi)miRNA-16有所升高。基于不同模型不同部位miRNA-16表達(dá)的結(jié)果不同，Launay等[23]鑒定出作用于中縫核5-HT能神經(jīng)元的氟西汀可降低海馬中miRNA-16的表達(dá)水平，且氟西汀的作用與海馬中miRNA-16的變化相當(dāng)。

因此，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究，以氟西汀為藥物對照組，對比電針組治療后調(diào)控不同腦區(qū)miRNA-16表達(dá)水平與SERT的關(guān)系，以此來參照判定電針治療抑郁癥的可能機(jī)制及治療效果。

研究結(jié)果顯示，模型組大鼠中縫核、海馬SERT含量升高，表現(xiàn)抑郁樣行為。而電針組一方面可明顯改善抑郁大鼠的行為學(xué)，另一方面降低了大腦SERT含量。這可能是電針抗抑郁癥的作用途徑之一，即電針能抑制腦區(qū)SERT的表達(dá)，進(jìn)而減弱對突觸間隙5-HT的重?cái)z取，細(xì)胞外的5-HT濃度回升表現(xiàn)出抗抑郁作用。但模型組miRNA-16在中縫核和海馬區(qū)均升高，經(jīng)過氟西汀和電針干預(yù)后，miRNA-16的表達(dá)水平下降。

分析本研究的結(jié)果 ：①未探索抑郁模型大鼠海馬和中縫核miRNA-16水平改變的可能原因 ：在機(jī)體反饋機(jī)制作用下，電針從基因水平上下調(diào)中縫核miRNA-16，使SERT表達(dá)逐漸降低，對5-HT重?cái)z取減弱，海馬細(xì)胞外5-HT增多，繼而海馬miRNA-16也下調(diào)，降低海馬SERT的表達(dá)；②未比較抑郁模型大鼠不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)海馬和中縫核miRNA-16水平差異，miRNA-16可能作為輔助確診抑郁癥的指標(biāo)之一，但miRNA-16的變化是否是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，而經(jīng)過長時(shí)間的干預(yù)后，應(yīng)激狀態(tài)下的miRNA-16達(dá)到峰值;③miRNA-16的靶基因不確切，是否還經(jīng)過其他通路調(diào)控SERT。

此外，張艷華等[24]通過對抑郁癥患者尸腦和抑郁動(dòng)物模型的研究表明，miRNA對突觸可塑性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵性元件的基因表達(dá)調(diào)控有重要影響。而miRNA-16除能影響5-HT系統(tǒng)SERT蛋白基因的表達(dá)水平外，與抑郁癥的神經(jīng)可塑性是否有關(guān)聯(lián)。國內(nèi)尚沒有從神經(jīng)可塑性的角度研究miRNA-16表達(dá)與抑郁癥的關(guān)系，因此，擬從miRNA-16與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性出發(fā)，為揭示針刺治療抑郁癥的新機(jī)制作一嘗試值得深入研究。