李東輝 龍琴 王靜怡 陳晨

近視是指在調(diào)節(jié)放松狀態(tài)下，平行光線經(jīng)眼球屈光系統(tǒng)聚焦在視網(wǎng)膜之前的一種視覺形式，是世界范圍內(nèi)最常見的屈光不正，并且呈逐年上升的趨勢，已成為導(dǎo)致視力受損和盲的全球性公共衛(wèi)生健康問題，然而，到目前為止，其確切的發(fā)病機制仍需探索和完善[1-2]。鞏膜，尤其是后部鞏膜，作為近視相關(guān)機制作用下的最終靶組織，始終是近視領(lǐng)域的研究重點[3-4]。前期研究和近期報道提示，近視的發(fā)生與全身或眼部炎癥具有顯著相關(guān)性[5-7]，然而，炎癥對于近視發(fā)生發(fā)展是因還是果？炎癥通過何種通路促進近視發(fā)生和發(fā)展呢？目前尚需進一步研究及探討。巨噬細胞是機體重要的免疫炎癥相關(guān)細胞，是研究創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥調(diào)控和分子免疫的重要對象[8-9]，然而，目前對于巨噬細胞和近視的相關(guān)性研究不足。本研究擬通過流式細胞技術(shù)檢測近視誘導(dǎo)小鼠后部鞏膜通用型巨噬細胞標記物F4/80和M2型巨噬細胞標記物CD206的表達，分析F4/80+巨噬細胞和F4/80+/CD206+巨噬細胞的表達以及與小鼠近視發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物4周齡C57BL/6雄性健康小鼠24只48眼(北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心提供)，在自然照明環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝入食水，實驗動物的飼養(yǎng)和處理經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

1.1.2 主要試劑與儀器本研究所采用的抗體均購自美國BioLegend公司，具體包括：大鼠抗小鼠F4/80熒光標記抗體(FITC，Cat 123108)及同型對照(FITC標記大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗體)；大鼠抗小鼠CD206熒光標記抗體(PE，Cat 141706)及同型對照(PE標記大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗體)；流式細胞儀(美國BD LSR II)；200目尼龍網(wǎng)(上海晶安生物科技有限公司，約70 μm孔徑)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠形覺剝奪性近視模型的建立C57BL/6小鼠按隨機數(shù)字表法分別接受形覺剝奪處理和無處理(各12只)，研究分為3組：形覺剝奪組(單眼遮蓋，n=12)，自身對照組(對側(cè)眼無遮蓋，n=12)，正常對照組(n=12)。形覺剝奪組取右眼為形覺剝奪眼，采用圓形不透光塑料眼罩，直徑10 mm，粘貼于小鼠眼球周圍(避免膠水流入眼內(nèi))，頸部套塑料項圈防止小鼠將眼罩剝離。每天巡視小鼠一次，若眼罩或塑料項圈剝離，及時更換。對側(cè)眼為自身對照眼。正常對照組小鼠不作任何處理(取右眼參與統(tǒng)計分析)。

1.2.2 小鼠屈光度和眼軸檢測小鼠實驗前(實驗0 d)、實驗14 d和實驗28 d時用5 g·L-1托吡卡胺滴眼液滴眼，每10 min滴眼一次，每次20 μL，共4次。在睫狀肌麻痹狀態(tài)下由有經(jīng)驗的驗光師進行帶狀光檢影驗光，獲得等效球鏡屈光度數(shù)(球鏡屈光度加1/2散光度)。實驗14 d和28 d，屈光度檢測后采用頸椎脫臼法分別處死6只小鼠分離眼球，清除球周組織，用千分尺測量眼軸長度3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞頸椎脫臼法處死小鼠，迅速分離眼球，清除鞏膜外組織，沿鋸齒緣將鞏膜分為前、后兩部，保留后部鞏膜組織置于培養(yǎng)皿中，加入消化液，覆蓋組織，放入37 ℃恒溫箱作用30 min；用一次性注射器針頭將組織劃碎，用200目尼龍網(wǎng)過濾細胞2次；1000 r·min-1離心5 min棄上清，再用PBS洗滌細胞一次，重懸后計數(shù)調(diào)節(jié)細胞濃度；取106個細胞約100 μL細胞懸液到流式樣品管中，加入最佳濃度F4/80 FITC和CD206 PE熒光標記抗體，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min；加入PBS清洗2次，混勻后1000 r·min-1離心5 min棄上清；加入500 μL PBS重懸后采用流式細胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件和GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)±標準差表示，用Kolmogorov-Smirnov Test進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布檢驗，采用單因素干預(yù)隨機分組設(shè)計，3組各指標的總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，實驗14 d和實驗28 d指標間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形覺剝奪性近視小鼠模型的誘導(dǎo)情況實驗0 d，形覺剝奪組、自身對照組和正常對照組的屈光度分別為(4.94±0.68)D、(5.10±0.51)D和(5.02±0.74)D，3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗14 d，3組屈光度和眼軸差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。實驗28 d，3組屈光度和眼軸差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；實驗28 d，形覺剝奪組比自身對照組明顯向近視偏移(-3.50±1.18)D，屈光度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，并伴有眼軸的顯著延長(P=0.02)；形覺剝奪組比正常對照組向近視偏移(-3.45±1.11)D，屈光度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；并伴有眼軸的顯著延長(P=0.03)；自身對照組和正常對照組的屈光度和眼軸差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。形覺剝奪28 d比形覺剝奪14 d產(chǎn)生顯著的近視偏移(-5.67±0.79)D(t=11.36，P<0.001)，伴眼軸增長(0.16±0.08)mm(t=4.39，P=0.001)，見表1。

組別n屈光度/D實驗14 d實驗28 d眼軸長度/mm實驗14 d實驗28 d形覺剝奪組63.92±1.03-1.75±0.65?#△3.15±0.073.31±0.05?#△自身對照組64.13±0.611.75±0.823.12±0.173.21±0.05正常對照組64.08±1.041.67±0.563.16±0.113.23±0.07F值0.0950.680.154.45P值0.920.0010.860.03

注：與各自的自身對照組比較，*P<0.05 (單因素方差分析，LSD檢驗)；與各自正常對照組比較，#P<0.05(單因素方差分析，LSD檢驗)；與形覺剝奪組實驗14 d比較，△P<0.05 (獨立樣本t檢驗)

2.2 各組小鼠后部鞏膜組織中F4/80和CD206的表達情況實驗14 d、28 d，形覺剝奪組、自身對照組和正常對照組相比，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80陽性(F4/80+)巨噬細胞百分比均顯著高于自身對照組和正常對照組(均為P<0.05)。實驗14 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80和CD206陽性(F4/80+/CD206+)巨噬細胞百分比均顯著高于自身對照組和正常對照組(均為P<0.05)。實驗28 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比均顯著高于自身對照組和正常對照組(均為P<0.05)。自身對照組和正常對照組F4/80+和F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比在實驗14 d、28 d時相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。實驗28 d，形覺剝奪組小鼠后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比較實驗14 d時升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.68，P=0.02)。實驗28 d，形覺剝奪組小鼠后部鞏膜F4/80+巨噬細胞百分比和實驗14 d時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.86，P=0.09)，見表2。

組別nF4/80+巨噬細胞/%實驗14 d實驗28 dF4/80+/CD206+巨噬細胞/%實驗14 d實驗28 d形覺剝奪組60.91±0.311.19±0.210.45±0.330.87±0.19#自身對照組60.48±0.10?0.85±0.23?0.12±0.06?0.50±0.27?正常對照組60.45±0.21?0.79±0.23?0.21±0.160.51±0.28?F值8.245.793.904.23P值0.0040.010.040.03

注：與相應(yīng)時間點的形覺剝奪組比較，*P<0.05 (單因素方差分析，LSD檢驗)；與形覺剝奪組實驗14 d比較，#P<0.05 (獨立樣本t檢驗)

2.3 形覺剝奪組小鼠后部鞏膜組織中F4/80+、F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比和屈光度、眼軸的相關(guān)性實驗28 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比和屈光度呈顯著負相關(guān)(r=-0.89，P=0.02；圖1)，和眼軸呈顯著正相關(guān)(r=0.98，P=0.001；圖2)。實驗28 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細胞百分比和屈光度及眼軸均無顯著相關(guān)性(均為P>0.05)。

圖1 實驗28 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比和屈光度的相關(guān)性

圖2 實驗28 d，形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比和眼軸的相關(guān)性

3 討論

本研究探討了近視發(fā)生發(fā)展過程中是否存在后部鞏膜巨噬細胞的參與，結(jié)果表明，C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視的形成伴隨后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞的增加和動態(tài)變化，F(xiàn)4/80+/CD206+巨噬細胞的數(shù)量和屈光度存在顯著負相關(guān)，同時和眼軸呈顯著正相關(guān)，提示F4/80+/CD206+巨噬細胞參與C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視的發(fā)生和發(fā)展過程。

大量研究顯示，后部鞏膜起到對眼球形狀和大小的塑形作用，在此過程中，以基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)過度活化為代表的基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)功能失衡起到重要的促進作用，上調(diào)MMP-2導(dǎo)致膠原纖維降解是近視發(fā)生發(fā)展過程中后部鞏膜重塑和眼軸延長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。有研究表明，巨噬細胞具有調(diào)控MMP-2的功能，從而影響疾病的進程[12-13]。因此，后部鞏膜巨噬細胞的功能將對近視形成具有潛在影響，對此目前國內(nèi)外相關(guān)研究尚少。

最常見的分類將巨噬細胞分為經(jīng)典活化型(M1)和替代活化型(M2)，不同種類的巨噬細胞在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中發(fā)揮不同的功能[14]，其中M1型巨噬細胞具備很強的抗原提呈能力，發(fā)揮促進炎癥和自身免疫的作用；而M2型巨噬細胞則起到抑制炎癥的作用[15-16]，此外，研究表明，M2型巨噬細胞通過上調(diào)MMP-2的表達，從而促進膠原降解[17]。目前的研究認為，F(xiàn)4/80是巨噬細胞的經(jīng)典通用標志物，既識別M1型又識別M2型巨噬細胞，被廣泛用于標記總巨噬細胞[18]。由于M2型巨噬細胞表達CD206，即甘露糖受體[19]，因此，CD206被認為是高度可信的M2型巨噬細胞的常用標志物，F(xiàn)4/80+/CD206+則可代表M2型巨噬細胞[20]。

本研究結(jié)果顯示，形覺剝奪28 d導(dǎo)致小鼠近視形成，同時伴隨形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞的表達升高，這一趨勢在小鼠形覺剝奪性近視形成之前(實驗14 d)已經(jīng)存在。因此，小鼠后部鞏膜M2型巨噬細胞的增加和動態(tài)變化早于近視形成。此外，實驗28 d形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比和屈光度呈顯著負相關(guān)性，和眼軸呈顯著正相關(guān)性，進一步提示M2型巨噬細胞增加對近視發(fā)生的促進作用。

如前所述，F(xiàn)4/80+代表總巨噬細胞，本研究發(fā)現(xiàn)，實驗14 d和28 d形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細胞百分比均高于自身對照組和正常對照組，然而，未發(fā)現(xiàn)實驗28 d形覺剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細胞百分比和屈光度及眼軸的相關(guān)性，因此提示，在巨噬細胞參與的小鼠形覺剝奪性近視的發(fā)生發(fā)展中，M2型巨噬細胞極化類型，而非總巨噬細胞，可能是促進近視形成的關(guān)鍵因素。

雖然本研究初步證實了巨噬細胞，主要是M2型巨噬細胞參與C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視形成的假設(shè)，然而，本研究存在以下不足：首先，由于小鼠后部鞏膜巨噬細胞數(shù)量較少，雖然經(jīng)過多次預(yù)實驗和方法改良，細胞活性的保持仍有待進一步完善，同時本研究例數(shù)不足，給數(shù)據(jù)分析造成一定偏差，可能是本研究未發(fā)現(xiàn)實驗14 d形覺剝奪組和正常對照組F4/80+/CD206+巨噬細胞百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義的原因之一；其次，本研究單純探討了巨噬細胞的動態(tài)變化，尚未包含MMP-2等近視相關(guān)蛋白及生長因子，如堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等的檢測以及和巨噬細胞變化的相關(guān)性研究。因此，M2型巨噬細胞和近視發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系及作用機制尚需進一步研究加以證實，從而為近視的防控提供新的思路和治療靶點。