趙晉鋒，杜艷偉，王高鴻，李顏方，趙根有，王振華，成凱，王玉文，余愛麗

谷子NADP-ME的鑒定及其對逆境脅迫的響應(yīng)

趙晉鋒，杜艷偉，王高鴻，李顏方，趙根有，王振華，成凱，王玉文，余愛麗

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西長治 046011）

【】鑒定谷子NADP-ME家族成員，研究不同成員對非生物逆境脅迫的響應(yīng)，為揭示SiNADP-ME在谷子逆境應(yīng)答信號途徑中的作用奠定基礎(chǔ)。利用生物信息學(xué)方法鑒定谷子基因組中的NADP-ME家族成員。采用GSDS2.0、plantCARE、Clustalx、MEGA6.0等軟件及網(wǎng)站ExPASy對鑒定成員蛋白和基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用qRT-PCR方法檢測SiNADP-ME在苗期不同逆境、不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下的表達(dá)情況。谷子NADP-ME家族由7個(gè)成員組成，它們在谷子的第2、3、5、7染色體上呈不均勻分布。保守功能域分析顯示7個(gè)基因都含有NADP-ME特征保守功能域。序列比對發(fā)現(xiàn)谷子NADP-ME成員之間序列非常保守，相似性較高，7個(gè)谷子成員序列一致性為77.30%，而不同物種NADP-ME序列之間相似性為56.52%。序列分析顯示、、、序列較長，分別編碼576、639、652和636個(gè)氨基酸，而、、序列較短，分別編碼213、265和149個(gè)氨基酸?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示有2個(gè)可變剪切，有3個(gè)可變剪切，其他基因無可變剪切。、、、含內(nèi)含子較少，而、、含內(nèi)含子較多。蛋白參數(shù)預(yù)測顯示谷子NADP-ME成員間分子量跨度較大，在161.94—725.43 kD，等電點(diǎn)為5.32—8.05，不穩(wěn)定指數(shù)為23.01—45.01，脂肪系數(shù)介于89.19—107.77，平均疏水指數(shù)介于-0.218—0.004。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示SiNADP-ME成員主要被定位在葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。順式元件分析顯示SiNADP-ME成員啟動(dòng)子區(qū)域主要包括激素類應(yīng)答、逆境應(yīng)答、光應(yīng)答以及其他類生長調(diào)控相關(guān)的順式元件。聚類分析發(fā)現(xiàn)谷子SiNADP-ME基因在單、雙子葉植物分離之前就已存在。不同物種同源基因?qū)υ谶M(jìn)化樹中廣泛存在揭示它們在進(jìn)化上可能存在共同祖先，也暗示它們在某些信號通路中可能具有相似的功能。苗期逆境表達(dá)分析表明所有谷子SiNADP-ME家族基因表達(dá)量在本文應(yīng)用的4種逆境脅迫下都被明顯誘導(dǎo)。在ABA、低溫、NaCl處理后被誘導(dǎo)的最高相對表達(dá)量分別為對照的460.53、411.50和15.24倍；在ABA、低溫、PEG、NaCl處理后被誘導(dǎo)的最高相對表達(dá)量分別為對照的211.13、15.21、772.41和643.99倍。進(jìn)一步分析表明和在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)。從谷子基因組中鑒定了7個(gè)NADP-ME基因家族成員；7個(gè)成員間序列非常保守并且都含有NADP-ME基因典型特征結(jié)構(gòu)域；7個(gè)谷子NADP-ME家族基因參與了植物非生物逆境應(yīng)答，特別是和可能在ABA、鹽、干旱、低溫等逆境應(yīng)答信號途徑中起重要作用。

谷子；NADP依賴型蘋果酸酶；基因表達(dá)；非生物逆境

0 引言

【研究意義】谷子（）是C4禾本科作物，具有抗旱、耐瘠、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，是起源于中國的重要糧食作物和飼草作物，在全球一些溫帶、亞熱帶和熱帶的干旱和半干旱地區(qū)廣泛種植[1-3]。NADP-蘋果酸酶（NADP-malic enzyme，NADP-ME）是一類廣泛存在于植物界的氧化脫羧酶，在穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)pH和滲透勢方面起重要作用[4-5]，同時(shí)NADP-ME還參與多種脅迫響應(yīng)，在植物應(yīng)對干旱、高鹽和高滲透等逆境脅迫信號途徑中起重要作用[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物體內(nèi)NADP-ME分為光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME[7]。光合型NADP-ME常定位于Ｃ4植物維管束鞘細(xì)胞葉綠體中或CAM植物的細(xì)胞質(zhì)中，能催化蘋果酸進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)，提供CO2用于光合作用過程中Rubisco酶的碳同化固定[8-9]。非光合型NADP-ME常定位于植物質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，在木質(zhì)素、脂質(zhì)合成，維持穩(wěn)定細(xì)胞施滲透壓、細(xì)胞質(zhì)pH以及植物防御應(yīng)答方面起重要作用[10-14]。NADP-ME通過催化蘋果酸的代謝途徑來參與植物體內(nèi)多種生理反應(yīng)，近年來，NADP-ME參與干旱、鹽、低溫等多種逆境脅迫的研究相繼被報(bào)道，證明在逆境脅迫下植物體內(nèi)NADP-ME代謝發(fā)生變化，相應(yīng)酶活性提高，基因表達(dá)量增加，并在一定程度上提高了植物的耐逆能力[7]。在干旱脅迫條件下，水稻中3個(gè)表達(dá)量有不同程度的增加[15]，煙草進(jìn)行干旱脅迫后葉片中活性增加了3.9倍，定量PCR檢測顯示的mRNA表達(dá)量及酶活性均有所增加[16]。研究表明干旱會(huì)導(dǎo)致植物葉表皮保衛(wèi)細(xì)胞ABA濃度增加，進(jìn)而引起NADP-ME酶積累，蘋果酸代謝活躍含量下降，因此，推測可能通過ABA介導(dǎo)激活對干旱脅迫響應(yīng)的信號途徑[17]。研究表明水稻幼苗中的表達(dá)在氯化鈉和碳酸鹽處理下受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，酶活性也明顯增加，該基因在擬南芥中過表達(dá)后耐逆性明顯增強(qiáng)[18-19]。毛果楊中5個(gè)在氯化鈉脅迫下表達(dá)均受到不同程度地誘導(dǎo)[20]。NADP-ME是定位于膜上的親水性蛋白，低溫脅迫可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，在小麥和巴西橡膠樹中都得到了驗(yàn)證[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】谷子基因組測序已完成并公布[22-23]，但谷子NADP-ME家族基因的鑒定以及NADP-ME在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究鑒定谷子基因組中NADP-ME基因，明確家族基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與進(jìn)化特征，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因家族成員在苗期不同逆境、不同生育期下干旱脅迫和不同光照強(qiáng)度下的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征及差異，為進(jìn)一步研究NADP-ME基因在逆境應(yīng)答過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材與處理

試驗(yàn)于2018年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所進(jìn)行。所用試驗(yàn)材料為谷子品種豫谷1號。2018年5月在組培室和旱棚分別種植材料，待組培室幼苗長至三葉一心期時(shí)分別對其進(jìn)行20% PEG6000模擬干旱、鹽（250 mmol·L-1NaCl）、ABA（100 μmol·L-1）和低溫（4℃）脅迫處理，設(shè)立時(shí)間點(diǎn)0、1、3、6、12和24 h整株取樣[24]。另外在旱棚種植豫谷1號，對照生育期內(nèi)正常澆水，澆水時(shí)間點(diǎn)選擇具體措施為觀察旱棚對照小區(qū)內(nèi)土壤含水量呈明顯降低，植株葉片顏色呈現(xiàn)鮮綠逐漸喪失開始向灰綠轉(zhuǎn)變但葉片尚未卷曲時(shí)馬上澆透水。對照小區(qū)整個(gè)生育期內(nèi)共澆水9次；干旱處理小區(qū)只澆3次關(guān)鍵水，分別為拔節(jié)（6月20日）、抽穗（8月5日）和灌漿期（8月30日）澆透水，其他時(shí)間采用自然控水方式控水。對照小區(qū)和干旱處理小區(qū)施肥、中耕等其他農(nóng)田管理措施完全相同。干旱處理不同生育期（拔節(jié)、抽穗、灌漿）葉片樣本在對應(yīng)生育期澆水前與對照同時(shí)取樣。不同光照處理為當(dāng)植株出苗后用黑色遮陽網(wǎng)分別遮擋1層（中等光照Ⅰ，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測量光照強(qiáng)度分別為1.32×104、2.45×104和0.98×104lx）、2層（弱光照Ⅱ，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測量光照強(qiáng)度分別為0.31×104、0.57×104和0.35×104lx）至成熟收獲。使用標(biāo)智光強(qiáng)測定儀（GM1040）于晴天上午9：00—10：00點(diǎn)測量光照強(qiáng)度，測量10次數(shù)值，取平均值。旱棚材料分別在拔節(jié)、抽穗、灌漿期時(shí)取對照和處理旗葉葉片，所有樣品葉片取樣后立即在-80℃冰箱中速凍備用。

1.2 總RNA提取、cDNA合成及引物設(shè)計(jì)

使用生工TRIzol試劑盒提取植物總RNA；使用生工第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）合成cDNA，上述試驗(yàn)均按照試劑盒說明書進(jìn)行。用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

1.3 基因發(fā)掘和生物信息學(xué)分析

根據(jù)文獻(xiàn)獲得已知玉米NADP-ME蛋白序列[25]，將獲得的蛋白序列提交到谷子基因組數(shù)據(jù)庫（https://genome.jgi.doe.gov）搜索可能的NADP-ME同源基因，然后用InterProScan搜索候選谷子NADP-ME基因的結(jié)構(gòu)特征域，把同時(shí)含NADP依賴性蘋果酸酶（PLN03129）、蘋果酸酶（SfcA）、蘋果酸酶N端功能域（PF00390）和蘋果酸酶NAD結(jié)合功能域（PF03949）的谷子同源NADP-ME基因確定為谷子候選NADP-ME基因。通過谷子數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://genome.jgi.doe.gov）檢索基因序列號、基因組序列長度、CDS長度、氨基酸數(shù)目等參數(shù)；利用ExPASy網(wǎng)站（https://prosite.expasy.org）在線工具預(yù)測蛋白分子量（MW）和等電點(diǎn)（）。利用在線軟件plantCARE （http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子順式元件，采用GSDS軟件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖，用Psort在線工具預(yù)測亞細(xì)胞定位，使用Blast工具在NCBI上查找氨基酸同源性序列，用ClustalX1.83軟件進(jìn)行基因序列比對[26]；使用Mega6.0軟件鄰接法構(gòu)建不同物種N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹[27]。

1.4 Real-time PCR分析

所用引物由Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)，引物信息見表1。樣品cDNA均一化后作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板，以谷子（Seita. 7G294000）作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為10 μL 2×熒光染料混合液（BBI, Shanghai, China)、0.4 μL正向引物（10 μmol·L–1）、0.4 μL反向引物（10 μmol·L–1）、2 μL cDNA模板和7.2 μL無菌水。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化后，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 7 s，57℃ 10 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)，采用相對定量2–ΔΔCt方法計(jì)算基因在某種逆境處理下某個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對于對照的轉(zhuǎn)錄水平變化[28]。每個(gè)處理3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量，采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。苗期不同逆境下表達(dá)分析結(jié)果利用百邁克云平臺(tái)在線工具（https://international.biocloud.net/zh/software/tools/detail/small/305）聚類熱圖繪制（Pretty Heatmaps）進(jìn)行熱圖繪制，參數(shù)默認(rèn)。

表1 本試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 谷子NADP-ME基因家族成員的鑒定與生物信息學(xué)分析

2.1.1 谷子NADP-ME基因的鑒定 參考已知NADP- ME序列，在谷子全基因組中鑒定出7個(gè)SiNADP-ME候選基因成員（表2）。根據(jù)基因在基因組上的相應(yīng)位置分別命名為、、、、、和。7個(gè)基因不均分布在第2、3、5、7染色體上，其中第5染色體上有3個(gè)，第3染色體上有2個(gè)，第2和7染色體上各有1個(gè)基因。序列分析顯示SiNADP-ME成員之間基因組長度變化明顯，、、、基因組序列較長，分別含3 400、5 236、5 357和4 665個(gè)堿基；而、和基因組序列較短，分別含2 128、2 329和2 446個(gè)堿基。GSDS在線軟件基因結(jié)構(gòu)分析表明，、、和內(nèi)含子較少，分別為8、6、8和4個(gè)，而、和內(nèi)含子較多，分別為19、19和18個(gè)（圖1）。另外發(fā)現(xiàn)、、、和只有一種轉(zhuǎn)錄方式，而有2個(gè)可變剪切，有3個(gè)可變剪切，后續(xù)分析時(shí)將和同一基因位點(diǎn)出現(xiàn)的多個(gè)可變剪切體視為同一基因，僅以原始轉(zhuǎn)錄變異體（primary alternative transcript）對應(yīng)的序列作為該基因的代表。

2.1.2 SiNADP-ME蛋白特性分析 采用EXPASY網(wǎng)站在線工具對候選SiNADP-ME蛋白的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、平均疏水指數(shù)進(jìn)行預(yù)測（表2），基因組序列較長的、、和分別編碼576、639、652和636個(gè)氨基酸，而基因組序列較短的、和分別編碼213、265和149個(gè)氨基酸。參數(shù)預(yù)測結(jié)果顯示SiNADP-ME成員間分子量跨度較大，范圍在161.94—725.43 kD，蛋白等電點(diǎn)范圍為5.32—8.05，不穩(wěn)定指數(shù)范圍為23.01—45.01，脂肪系數(shù)范圍為89.19—107.77，平均疏水指數(shù)范圍為-0.218—0.004。

表2 預(yù)測谷子NADP-ME參數(shù)

圖1 SiNADP-ME成員的基因結(jié)構(gòu)

2.1.3 SiNADP-ME蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測和啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析 采用Psort在線工具對谷子SiNADP-ME家族成員的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，SiNADP-ME成員主要被定為在葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，另外也可能存在于細(xì)胞外、細(xì)胞核和過氧化物酶體中（表3）。利用plantCARE在線軟件對SiNADP-ME成員啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析（表4），SiNADP-ME成員啟動(dòng)子區(qū)域主要包括激素類應(yīng)答元件（脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素）、逆境應(yīng)答元件（干旱、低溫、防御和應(yīng)激反應(yīng)）、大量的光應(yīng)答元件以及其他類生長調(diào)控相關(guān)順式元件，包括缺氧特異性誘導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)必需、分生組織特異性表達(dá)、玉米蛋白代謝調(diào)控、種子特異性調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、晝夜節(jié)律元件等。

表3 SiNADP-ME蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

表4 SiNADP-ME啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測

2.1.4 NADP-ME序列比對及進(jìn)化分析 ClustalX1.83軟件比對谷子NADP-ME成員氨基酸序列發(fā)現(xiàn)成員之間序列非常保守，相似性較較高，所有SiNADP-ME序列一致性（Identity）為54.43%（圖2）。與SiNADP-ME1、SiNADP-ME4、SiNADP-ME5和SiNADP- ME6序列相比，SiNADP-ME2、SiNADP-ME3和SiNADP-ME7序列缺少一段N端序列，但是它們都含有NADP依賴性蘋果酸酶（PLN03129）、蘋果酸酶（SfcA）、蘋果酸酶N端功能域（PF00390）和蘋果酸酶NAD結(jié)合功能域（PF03949）等NADP基因典型功能域。序列比對發(fā)現(xiàn)SiNADP-ME1、SiNADP-ME4、SiNADP-ME5和SiNADP-ME6之間同源性較高，序列一致性為77.30%。為進(jìn)一步了解谷子SiNADP-ME進(jìn)化關(guān)系，推測其生物功能，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了不同物種NADP-ME基因，包括玉米、高粱、水稻、小麥、擬南芥以及北美云杉和小立碗蘚（玉米ZmNADP-ME1、ZmNADP-ME2高粱SbNADP-ME1、SbNADP-ME2，水稻OsNADP-ME1、OsNADP-ME2，小麥TaNADP-ME1、TaNADP-ME2，擬南芥AtNADP- M1、AtNADP-M2，北美云杉PtNADP-ME1、PtNADP- ME2，小立碗蘚PpNADP-ME1、PpNADP-ME2，對應(yīng)GenBank序列號分別為NP_001150965、XP_008656303，XP_002440734、XP_021312641，BAA03949、XP_ 015640686，ABW77317、CDM81737，NP_197960、NP_178093，AEX13395、AEX13397，PNR56966，XP_024371400）。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建了谷子和不同物種NADP-ME蛋白成員的Neighbor-Joining進(jìn)化樹（圖3）。從圖3可以看出，所有物種NADP-ME序列非常保守，其序列一致性為56.52%。谷子的4個(gè)基因、、和聚合在一起以基因簇的方式出現(xiàn)，揭示它們在進(jìn)化上可能由共同祖先復(fù)制而來，另一方面也暗示它們在某些功能上可能具有相似性。玉米、高粱、水稻、小麥、擬南芥NADP-ME成員與谷子NADP-ME成員相互嵌合在一起，表明植物NADP-ME基因在進(jìn)化過程中相對保守。另外發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)Γ绾?，、和，和，這些物種的NADP-ME聚在一起表明它們的親緣關(guān)系較近，推測這些NADP-ME對可能具有類似的生物功能。小立碗蘚的2個(gè)單獨(dú)聚在一起，表明與其他物種NADP-ME成員間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，揭示PtNADP-ME可能與其他物種NADP-ME成員之間的生物功能差異較大。

OsNADP-ME2：水稻Oryza sativa，XP_015640686；TaNADP-ME1：小麥Triticum aestivum，ABW77317；ZmNADP-ME2：玉米Zea mays，XP_008656303；SbNADP-ME1：高粱Sorghum bicolor，XP_002440734；ZmNADP-ME1：玉米Zea mays，NP_001150965；OsNADP-ME1：水稻Oryza sativa，BAA03949；TaNADP-ME2：小麥Triticum aestivum，CDM81737；AtNADP-M2：擬南芥Arabidopsis thaliana，NP_178093；AtNADP-M1：擬南芥Arabidopsis thaliana，NP_197960；SbNADP-ME2：高粱Sorghum bicolor，XP_021312641；PpNADP-ME1：小立碗蘚Physcomitrella patens，PNR56966；PpNADP-ME2：小立碗蘚Physcomitrella patens，XP_024371400；PtNADP-ME1：北美云杉Picea sitchensis，AEX13395；PtNADP-ME2：北美云杉Picea sitchensis，AEX13397。相同氨基酸殘基用黑色表示，相似氨基酸殘基用灰色表示（≥60% similarity）The amino acids with an entire homology are shown by a black background, and those shared non-identical conserved identity by a gray background (≥ 60% similarity)

圖3 不同物種NADP-ME蛋白的進(jìn)化關(guān)系

2.2 SiNADP-ME家族基因的表達(dá)分析

2.2.1 SiNADP-ME非生物逆境脅迫下表達(dá)分析 如圖4所示，谷子三葉一心期幼苗4種脅迫處理下7個(gè)SiNADP-ME基因在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平變化趨勢不完全相同。除了和在PEG脅迫處理下所有時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)外，所有基因表達(dá)量在4種脅迫處理過程中至少1個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有所上調(diào)。另外發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下，所有SiNADP-ME的相對表達(dá)量都在脅迫后24 h達(dá)到最高分別為對照的411.50、12.36、3.49、3.36、15.90、15.21和10.92倍。在ABA處理3 h、低溫處理24 h、NaCl處理12 h后，它們的相對表達(dá)量均達(dá)到最高，分別為對照的460.53、411.50和15.24倍；在ABA處理12 h、低溫處理24 h、PEG處理12 h、NaCl處理24 h后，它們的相對表達(dá)量均達(dá)到最高，分別為對照的211.13、15.21、772.41和643.99倍；除此之外其他基因在其他的逆境脅迫下的表達(dá)量上調(diào)范圍均在對照的1—5倍。

圖中淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅五色代表基因表達(dá)水平。綠色表示基因表達(dá)弱，紅色表示基因表達(dá)強(qiáng)

2.2.2 不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下表達(dá)分析 為進(jìn)一步了解NADP-ME在谷子不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況，選取和2個(gè)基因檢測了它們在谷子拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期3個(gè)關(guān)鍵生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下的表達(dá)情況（圖5），在正常抽穗期、灌漿期表達(dá)量與拔節(jié)期相比均有明顯提升，分別為拔節(jié)期的1.72和12.07倍；在干旱脅迫下的抽穗期、灌漿期表達(dá)量與拔節(jié)期相比均也有明顯提升，分別為拔節(jié)期的2.02和1.84倍。在正常與干旱條件下的灌漿期、抽穗期表達(dá)量與拔節(jié)期相比也均有明顯提升。結(jié)果表明，和在正常生長條件下隨著谷子生長發(fā)育其表達(dá)有所增強(qiáng)，在不同生育期干旱脅迫下其表達(dá)量都有明顯增加，表明2個(gè)基因都參與了對干旱脅迫下的響應(yīng)。如圖6所示，在拔節(jié)期和抽穗期干旱條件下表達(dá)量較對照均有明顯提高，但灌漿期卻有所下降，而在抽穗期和灌漿期干旱條件下表達(dá)量較對照有明顯提高，但拔節(jié)期卻有所下降。表明和在干旱條件下不同生育期表達(dá)特征有所不同。不同光照強(qiáng)度下，在拔節(jié)期弱光（光照Ⅱ）下表達(dá)量較高，為拔節(jié)期正常光照的3.50倍，而在拔節(jié)期中等光照（光照Ⅰ）及抽穗和灌漿期的中等光照和弱光照下表達(dá)量都比較低。在各個(gè)生育期拔節(jié)期中等光照下表達(dá)量都比較低，在拔節(jié)期和抽穗期的低光照強(qiáng)度下甚至檢測不到信號。結(jié)果表明，光照強(qiáng)度的強(qiáng)弱嚴(yán)重影響和的表達(dá)。

*表示在0.05水平上顯著，**表示在0.01水平上顯著。下同

圖6 光照和干旱條件下SiNADP-ME1和SiNADP-ME6的相對表達(dá)量

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)方法在谷子基因組中檢索得到7個(gè)NADP-ME基因，集中分布在谷子的4條染色體上（2、3、5、7）。其中和具有可變剪切，其他5個(gè)基因只有一種轉(zhuǎn)錄方式。7個(gè)基因中4個(gè)基因序列較長（、、和），3個(gè)基因由于缺失了N端部分序列而較短（、、），但是NCBI保守功能域分析顯示7個(gè)基因蛋白都含有NADP-ME保守特征功能域，因此推斷這7個(gè)基因是谷子NADP-ME家族成員。采用ClustalX1.83比較不同物種中NADP-ME蛋白序列，發(fā)現(xiàn)所有NADP-ME基因序列同源性較高，具有非常保守的序列和結(jié)構(gòu)（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明谷子NADP-ME與高粱、玉米、水稻、小麥NADP-ME緊密嵌合在一起，而與擬南芥、北美云杉和小立碗蘚相距較遠(yuǎn)（圖3），揭示了谷子與高粱、玉米、水稻親緣關(guān)系相對較近，而與擬南芥、北美云杉和小立碗蘚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與它們在植物分類上的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近是一致的（谷子、高粱、玉米同屬被子植物禾本科單子葉C4植物，水稻屬被子植物禾本科單子葉作物，擬南芥屬被子植物十字花科雙子葉植物，北美云杉屬裸子植物門松科植物，小立碗蘚屬苔蘚植物門葫蘆蘚科）。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中谷子NADP-ME分別和單子葉作物高粱、玉米、水稻、小麥以及雙子葉植物擬南芥相應(yīng)基因聚在一起說明谷子NADP-ME在單雙子葉植物分離之前就已存在。另外在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)一些不同物種構(gòu)成的同源基因?qū)?，揭示這些同源基因?qū)赡苡晒餐嫦冗M(jìn)化而來，另一方面也暗示它們在某些信號通路中可能具有相似的功能。此外對谷子7個(gè)SiNADP-ME基因生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測和分析，期望能夠發(fā)現(xiàn)功能研究有幫助信息。預(yù)測結(jié)果顯示SiNADP-ME很多性狀和參數(shù)非常接近類似，比如亞細(xì)胞定位分析SiNADP-ME成員主要被定為在細(xì)胞的葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，另外也可能存在于細(xì)胞外、細(xì)胞核和過氧化物酶體中，這些位置都是植物光合作用的關(guān)鍵位置，揭示了SiNADP-ME可能在植物光合作用信號途徑中起比較重要作用。這些結(jié)論不僅驗(yàn)證了它們同屬NADP-ME基因家族，而且預(yù)示不同NADP-ME可能共同參與或調(diào)控某些信號途徑。順式元件分析表明在SiNADP-MEs啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA、低溫、干旱和防御應(yīng)激反應(yīng)等順式元件。一般來講如果基因啟動(dòng)子區(qū)域存在某種順式元件則暗示該基因很可能參與相應(yīng)的信號途徑[29]。研究表明在非生物逆境，比如干旱、鹽、低溫、高溫以及傷害等脅迫下會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的ABA水平升高，而且眾所周知ABA是在非生物逆境應(yīng)答中起重要作用的激素[30-32]。因此推測谷子SiNADP-ME很可能參與了植物對非生物逆境脅迫的響應(yīng)。所以用Real-time PCR檢測SiNADP-ME在谷子幼苗期不同逆境脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明，7個(gè)谷子SiNADP-ME基因在4種處理下其表達(dá)量有顯著變化，但具體動(dòng)態(tài)表達(dá)模式不盡相同。如圖4所示，只有和在PEG脅迫處理下所有時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)，其他所有SiNADP-ME的表達(dá)量在不同脅迫處理過程中至少1個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)上調(diào)。另外7個(gè)SiNADP-ME在低溫脅迫處理下相對表達(dá)量都在24 h達(dá)到最高，分別為對照的411.50、12.36、3.49、3.36、15.90、15.21和10.92倍。試驗(yàn)結(jié)果表明谷子SiNADP-ME家族基因廣泛參與了植物非生物逆境脅迫應(yīng)答。本研究結(jié)果同已有關(guān)于NADP-ME在逆境應(yīng)答方面研究結(jié)果是相一致的。例如Fu等[33]發(fā)現(xiàn)在PEG、低溫（4℃）、黑暗、鹽（200 mmol·L-1Nacl）、脫落酸和水楊酸脅迫處理下，晉麥47中NADP-ME酶的活性有明顯提高，進(jìn)一步研究表明NADP-ME酶在小麥植株對各種逆境脅迫的反應(yīng)中起重要作用。Cushman等[34]發(fā)現(xiàn)鹽處理下，冰草NADP-ME的mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加8—10倍。蘆蕓經(jīng)鹽處理后，的轉(zhuǎn)錄水平在12 h被顯著誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄水平在24 h達(dá)到最大，NADP-ME酶活性一直持續(xù)增加到72 h[35]。Chi等[36]對水稻葉中4個(gè)NADP-ME基因的研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因（、和）在ABA（50 μmol·L-1）和25% PEG8000處理下表達(dá)量增加。值得注意的是和，它們在某些逆境脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)趨勢非常之大，比如在ABA處理3 h、低溫處理24 h后它們的相對表達(dá)量均達(dá)到最高分別為對照的460.53和411.50倍；在ABA處理12 h、PEG處理12 h、NaCl處理24 h后它們的相對表達(dá)量均達(dá)對照的211.13、772.41和643.99倍。因此推測和在可能逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步了解在不同關(guān)鍵生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況，檢測了和在不同生育期（拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期）干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度（中等光照強(qiáng)度Ⅰ和弱光照強(qiáng)度Ⅱ）下的表達(dá)情況下的表達(dá)情況。如圖5所示，結(jié)果表明，在正常條件下和隨著谷子生長發(fā)育營養(yǎng)生長和光合作用加強(qiáng)其表達(dá)顯著提高，在不同生育期干旱脅迫下其表達(dá)量都有明顯增加，說明2個(gè)基因在不同生育期都參與了對干旱脅迫下的響應(yīng)。不同光照強(qiáng)度下，除了在拔節(jié)期弱光下表達(dá)量較高外，2個(gè)基因在3個(gè)關(guān)鍵生育期的中等光照和弱光照下表達(dá)量都比較低，有的甚至檢測不到信號（圖6）。試驗(yàn)結(jié)果揭示和可能參與了谷子在拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱應(yīng)答，光照強(qiáng)度的強(qiáng)弱嚴(yán)重影響和在不同生育期的表達(dá)。這些試驗(yàn)結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證了順式元件分析結(jié)果，證明了SiNADP-ME在植物逆境應(yīng)答中起一定作用。順式元件分析還顯示在SiNADP-ME啟動(dòng)子區(qū)域存在茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素順式元件。研究表明病原體感染通常導(dǎo)致細(xì)胞中茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯等激素水平的增加[37]，因此，推斷SiNADP-ME可能在生物應(yīng)激反應(yīng)中起一些作用。此外還發(fā)現(xiàn)了缺氧特異性誘導(dǎo)（GC-motif）、分生組織表達(dá)（CAT-box）、厭氧誘導(dǎo)必需（ARE）、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控（O2-site）、種子特異性調(diào)控（RY-element）、細(xì)胞周期調(diào)控（MSA-like）、晝夜節(jié)律核心元件（circadian）、根特異性（motif I），這些順式元件的存在暗示SiNADP-ME可能參與相應(yīng)的生理生化過程。值得一提的是在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應(yīng)答元件，眾所周知谷子是光溫敏感性作物，預(yù)示SiNADP-ME可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答調(diào)控。盡管這些推測都需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)證明，但還是為今后的功能研究提供了一些線索。本文報(bào)道的谷子SiNADP-ME豐富和完善了植物NADP-ME家族成員，為進(jìn)一步闡明NADP-ME在谷子逆境應(yīng)答中的功能、機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

從谷子全基因組中鑒定出7個(gè)NADP-ME成員，集中分布在谷子第2、3、5、7染色體上。所有成員蛋白序列高度保守，都具有NADP-ME保守特征功能域。谷子NADP-ME家族基因成員主要存在于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)。SiNADP-ME廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答，尤其是和參與了谷子在拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱應(yīng)答，而光照強(qiáng)度的強(qiáng)弱會(huì)嚴(yán)重影響和在不同生育期的表達(dá)。

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Identification NADP-ME Gene of Foxtail Millet and Its Response to Stress

ZHAO JinFeng, DU YanWei, WANG GaoHong, LI YanFang, ZHAO GenYou, WANG ZhenHua, CHENG Kai, WANG YuWen, YU AiLi

(Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, Shanxi)

The objectives of this study are to identify the NADP-ME family genes () from foxtail millet () genome, study the response of different members to abiotic stress, and to lay a theoretical foundation for revealing the role ofgenes in stress signal pathway of foxtail millet.The members of NADP-ME family in the foxtail millet genome were identified by bioinformatics methods. The protein and gene sequence of identified members were analyzed using software such as GSDS2.0, plantCARE, Clustalx, MEGA6.0 and the website ExPASy. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression levels ofgenes under different stresses at seedling stage, under drought and different light intensities stress at different growth stages.The NADP-ME family of foxtail millet consists of seven members, which were unevenly distributed on chromosomes 2, 3, 5, and 7 of foxtail millet. Conservative functional domain analysis revealed that all seven genes contain the conserved characteristic domains of NADP-ME. Amino acid sequence alignment revealed that the sequences were very conserved and the similarity was very high among the members. The sequence identity of 7 SiNADP-ME members was 77.30%, while the identity of NADP-MEsin different species was 56.52%. Sequence analysis showed that the sequences ofandwere longer, encoding 576, 639, 652, and 636 amino acids residues respectively, while the sequences of, andwere shorter, encoding 213, 265 amino acids residues respectively. Gene structure analysis showed thathas two alternative transcript,has three alternative transcript, and other genes have no alternative transcript.andcontain fewer introns, whileandcontain more introns. The prediction of protein parameters showed that the molecular weight span among members is large, ranging from 161.94 to 725.43 kD, the isoelectric point from 5.32 to 8.05, the instability index from 23.01 to 45.01, the aliphatic index from 89.19 to 107.77, and the grand average of hydropathicity from -0.218 to 0.004. Subcellular localization predictions show that SiNADP-ME members are mainly localized in chloroplasts, mitochondrial and cytoplasmic. Cis-elements analysis revealed that hormonal, stress, light, and other growth-related cis-elements are present in the promoter region of the SiNADP-ME members. Cluster analysis revealed thatgenes were present before the isolation of monocotyledonous and dicotyledonous plants. The homologous pairs of different species present in the phylogenetic tree revealed that they may evolve from a common ancestor, suggesting that they may have similar functions in certain signaling pathways. Stress expression analysis of seedling stage showed that the expression levels of all the SiNADP-ME family genes were significantly induced under the four stresses applied in this paper. The highest relative expression levels ofunder ABA, low temperature and NaCl treatment were 460.53, 411.50 and 15.24 folds than that of the control respectively, while the highest relative expression levels ofunder ABA, low temperature, PEG and NaCl treatment were 211.13, 15.21, 772.41 and 643.99 folds than that of the control respectively. Further analysis showed that the expression levels ofandwere up-regulated under drought stress at jointing, heading and filling stage.Seven members of NADP-ME gene family were identified from foxtail millet genome. Allgenes contain the typical characteristic domains of the NADP-ME, and their sequences are very conserved. All of thegenes are involved in plant abiotic stress response, especiallyandmay play an important role in response to abiotic stress.

foxtail millet; NADP-ME; gene expression; abiotic stress

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.002

2019-07-03；

2019-09-22

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-13.5-A23）、山西省農(nóng)科院特色技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（YGG17021）、山西省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2019T05）、國家農(nóng)業(yè)環(huán)境數(shù)據(jù)中心觀測檢測任務(wù)（ZX03S0410）

趙晉鋒，Tel：0355-2204195；E-mail：zhaojfmail@126.com。通信作者余愛麗，Tel：0355-2204195；E-mail：yuailimail@126.com。王玉文，Tel：0355-2204195；E-mail：gzswyw@163.com

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