白輝，宋振君，王永芳，全建章，馬繼芳，劉磊，李志勇，董志平

谷子抗銹病反應(yīng)相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與表達(dá)

白輝1，宋振君2，王永芳1，全建章1，馬繼芳1，劉磊1，李志勇1，董志平1

（1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所/國(guó)家谷子改良中心/河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050035；2上海電子信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院通信與信息工程學(xué)院，上海 201411）

【】谷子銹病是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。鑒定谷子抗銹病相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，為谷子抗銹病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)9個(gè)SiMYBs轉(zhuǎn)錄因子基因在（1）谷子孕穗期根、莖、葉和穗4個(gè)部位的表達(dá)情況，（2）在谷子抗（resistance，R）、感（susceptibility，S）銹病反應(yīng)120 h內(nèi)的表達(dá)豐度差異，（3）在植株外接水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）后24 h內(nèi)的表達(dá)變化；比較SiMYBs基因在谷子R、S、SA與MeJA 4種反應(yīng)中的表達(dá)模式；選擇抗病相關(guān)SiMYBs基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)和亞細(xì)胞定位。在葉部表達(dá)量最高，其余8個(gè)基因均在根部表達(dá)量最高，最顯著。5個(gè)基因的表達(dá)與抗病相關(guān)：和受銹菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)，抗病反應(yīng)早期的表達(dá)量明顯高于感病反應(yīng)；和在抗病反應(yīng)早期下調(diào)表達(dá)，后期上升至接種前，而感病反應(yīng)中保持低水平表達(dá)；在接種后的48 h內(nèi)，抗病、感病反應(yīng)表達(dá)模式相反。在響應(yīng)外源激素SA和MeJA反應(yīng)中，SiMYBs基因的表達(dá)量均發(fā)生不同程度的變化。4個(gè)基因（、、和）在R、SA與MeJA反應(yīng)中的表達(dá)模式一致，不同于S反應(yīng)。5個(gè)抗病相關(guān)SiMYBs基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其編碼蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中。鑒定到、、、和5個(gè)基因的表達(dá)與谷子抗銹病相關(guān)；與在谷子生長(zhǎng)發(fā)育和抗病過程中都發(fā)揮一定的功能；、、和4個(gè)基因可能通過SA和JA信號(hào)途徑參與谷子的早期抗病反應(yīng)。

谷子；MYB轉(zhuǎn)錄因子；銹??；real-time PCR；抗病反應(yīng)

0 引言

【研究意義】谷子（）抗旱耐瘠且營(yíng)養(yǎng)豐富，是北方旱區(qū)重要的農(nóng)作物之一。由粟單孢銹菌（Yoshino）侵染引起的谷子銹病屬于爆發(fā)流行性病害，一旦發(fā)生會(huì)給谷子生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。明確SiMYBs基因在谷子的不同發(fā)育階段、谷銹菌生物脅迫、激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平，了解它們的轉(zhuǎn)錄激活活性與亞細(xì)胞定位等轉(zhuǎn)錄因子特征，為谷子抗銹病機(jī)理研究和抗病分子育種提供優(yōu)異基因資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MYB是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物的次生代謝、細(xì)胞形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)等多種生命活動(dòng)[2-3]。在擬南芥（）[4]、水稻（）[2]、葡萄（）[5]、棉花（spp.）[6]和谷子[7]中已經(jīng)鑒定到大量MYB轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥和棉花中分別鑒定到超過198個(gè)和200個(gè)MYB基因[8]。WER（R2R3-MYB）和CPC（R3-MYB）共同參與根毛生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳調(diào)控[9-12]；擬南芥中參與莖的發(fā)育與葉片形狀的形態(tài)建成[13]；、、、、和等基因調(diào)控?cái)M南芥花藥的發(fā)育[14]。擬南芥中在抗病反應(yīng)中被特異、快速誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)加快和強(qiáng)化超敏反應(yīng)的出現(xiàn)以提升抗性[15]；小麥中調(diào)控寄主對(duì)小麥條銹病的抗性[16]；過表達(dá)增加煙草對(duì)青枯病的抗性[17]；過表達(dá)可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥的根腐病抗性；在小麥防御根腐病過程中起正調(diào)控作用[18]；過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗較未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋鰪?qiáng)了對(duì)稻瘟病菌侵染的抗性，減少了病斑數(shù)量[19]；番茄在煙草中過表達(dá)，增加了植株抵抗鐮刀菌（）和灰葡萄球菌（）侵染的能力，對(duì)番茄灰霉病產(chǎn)生抗性[20]。水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）作為信號(hào)分子，在植物調(diào)控抗病和防衛(wèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中扮演了重要角色。外源SA能夠引起擬南芥中PR基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高其抗病性[21]。甜瓜幼苗期外接SA，可降低其白粉病病情的指數(shù)，提升植株對(duì)白粉病的抗性[22]；SA處理的油菜提高了對(duì)核盤菌的抗性[23]；SA處理的小麥植株顯著激活和增強(qiáng)病程相關(guān)蛋白（PR-1和PR-5）的表達(dá)，提高了對(duì)白粉病的抗性[24]。小麥外接茉莉酸甲酯（methyl jasmona，MeJA）可以顯著激活、、和等抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，提高小麥對(duì)白粉病的抗病水平，且抗病性的提高與抗病標(biāo)志基因表達(dá)增強(qiáng)呈正相關(guān)[25-26]。因此，植物體受到外界脅迫時(shí)，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（WRKY、NPR1、TGA、EIN）會(huì)參與SA和JA下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過調(diào)控PR等防御相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控過敏性反應(yīng)，從而調(diào)控植物對(duì)病原菌的抗性[15,27-29]。【本研究切入點(diǎn)】印度學(xué)者曾對(duì)谷子中代表9條染色體和10個(gè)MYB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分支的11個(gè)MYB基因進(jìn)行了非生物脅迫（鹽脅迫、脫水脅迫與激素處理）下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）表達(dá)分析，而這些基因是否參與了生物脅迫反應(yīng)？是否在生物脅迫反應(yīng)中的表達(dá)與SA、JA激素信號(hào)通路中的表達(dá)具有相關(guān)性？這些問題目前尚不清楚，有待回答。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究為探索MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控谷子抗銹病反應(yīng)的防御機(jī)制，選擇響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)的9個(gè)SiMYBs基因[7]，通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)其在谷子發(fā)育不同組織部位、抗病與感病材料接種谷銹菌以及外接SA和MeJA后的表達(dá)水平，并進(jìn)行比較，分析SiMYBs基因表達(dá)與植物生長(zhǎng)發(fā)育、病原菌侵染應(yīng)答反應(yīng)和激素調(diào)節(jié)的相關(guān)性，篩選抗病相關(guān)基因，明確轉(zhuǎn)錄激活活性與表達(dá)部位，為深入研究谷子中MYB轉(zhuǎn)錄因子在谷子抗銹病反應(yīng)的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年4月至2019年1月在河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試谷子材料為十里香和豫谷1號(hào)，谷銹菌為強(qiáng)毒性小種A57的單孢菌系93-5，該菌株為河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離保存，菌種的擴(kuò)繁與保存參照梁克恭等[30]方法。十里香對(duì)谷銹菌單孢菌系93-5表現(xiàn)抗病反應(yīng)，豫谷1號(hào)對(duì)93-5表現(xiàn)感病反應(yīng)。

1.2 SiMYBs基因的選擇

根據(jù)已報(bào)道的谷子SiMYBs基因家族信息，選擇其中9個(gè)SiMYBs基因（、、、、、、、和），它們分別來(lái)自該基因家族的9個(gè)進(jìn)化樹分支，且在非生物脅迫反應(yīng)中具有響應(yīng)[7]，用于檢測(cè)它們?cè)诠茸由L(zhǎng)發(fā)育的不同組織部位與脅迫反應(yīng)中的表達(dá)。

1.3 不同條件下的取材

（1）谷子發(fā)育過程中的不同組織部位取材：材料取自谷子品種豫谷1號(hào)孕穗期的根、莖、葉、穗四部位。（2）谷銹菌接種處理與取材：選取培養(yǎng)21 d（4—5葉期）生長(zhǎng)健康且大小一致的幼苗，收集新鮮的谷銹菌單孢菌系93-5，制備孢子懸浮液（濃度為1.0×105個(gè)/mL）噴霧接種幼苗并保濕，于接種后0、12、24、36、48、72、96和120 h采集接種葉片，液氮速凍后于-80℃保存。（3）激素處理與取材：選取培養(yǎng)21 d（4—5葉期）生長(zhǎng)健康且大小一致的幼苗分別用0.1 mmol·L-1SA溶液、0.1 mmol·L-1MeJA溶液進(jìn)行脅迫處理，并于處理后0、12和24 h分別取樣，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 谷子總RNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與分析

采用Trizol試劑（Thermo Fisher Scientific，15596-026），提取不同處理?xiàng)l件下取材的谷子樣品的總RNA，第一鏈cDNA的合成按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，K1622）操作說(shuō)明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為real-time PCR的模板。real-time PCR使用TB GreenTM? Ⅱ試劑盒（TaKaRa，RR820A）完成，選用谷子肌動(dòng)蛋白基因（）作為內(nèi)參。反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、正反向引物各0.8 μL、2 μL cDNA和6.4 μL ddH2O。采用三步法反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30s；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃32 s，40個(gè)循環(huán)后收集熒光信號(hào)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，Ct取平均值，采用2-△△Ct法根據(jù)各樣品在特定熒光閾值下的Ct值計(jì)算基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照相比，將差異倍數(shù)≥2作為顯著性差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。real-time PCR中所用引物信息見電子附表1。

1.5 SiMYBs基因轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

根據(jù)SiMYBs基因在谷子參考基因組中的序列設(shè)計(jì)特異性引物（電子附表1），擴(kuò)增5個(gè)抗病反應(yīng)特異的SiMYBs基因（、、、和）的全長(zhǎng)CDS序列，利用雙酶切體系（RⅠ-HF和HⅠ-HF）與同源重組的方法與pGBKT7載體連接，構(gòu)建與BD（binding domain）融合的重組質(zhì)粒pBD-SiMYBs，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證后用化學(xué)法轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H Gold，以轉(zhuǎn)入空載體為對(duì)照。均勻涂布于SD/-Trp單缺陷平板上，30℃培養(yǎng)2—3 d。待酵母長(zhǎng)出菌落后，稀釋酵母菌落后均勻點(diǎn)在SD/-Trp單缺陷平板和SD/-Trp/ X-α-gal/Aba顯色平板上，30℃培養(yǎng)2—3 d，觀察酵母菌落生長(zhǎng)狀況與進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，并拍照記錄。

1.6 SiMYBs蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)、、、和的特異性引物（電子附表1），分別擴(kuò)增5個(gè)基因的5’端339、360、330、351和360 bp ORF序列，之后構(gòu)建pSiMYB041-YFP、pSiMYB074-YFP、pSiMYB100-YFP、pSiMYB177-YFP和pSiMYB202- YFP融合表達(dá)載體，參考YOO等[31]方法，以生長(zhǎng)2周齡的水稻葉片為材料進(jìn)行原生質(zhì)體制備，將對(duì)照YFP空載體和重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體中，28℃培養(yǎng)12 h后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM 710）觀察水稻原生質(zhì)體內(nèi)的SiMYBs蛋白亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果

2.1 SiMYBs基因在谷子不同組織器官中的表達(dá)

如圖1所示，9個(gè)SiMYBs基因在谷子孕穗期的根、莖、葉和穗中均有表達(dá)。在葉中表達(dá)量最高，其他部位表達(dá)量相似。、、和表達(dá)模式相似，在根中的表達(dá)量最高，葉和穗次之，而莖中的表達(dá)量最低。、和在根、葉中表達(dá)量最高，莖中次之，穗中的表達(dá)量最低。在根中的表達(dá)量最高，其余4個(gè)部位的表達(dá)量極低或檢測(cè)不到，推測(cè)在根部特異性表達(dá)。

R：根；S：莖；L：葉；P：穗 R: root; S: stem; L: leaf; P: Panicle

2.2 谷子與谷銹菌的互作

在谷子生長(zhǎng)的5葉期接種谷銹菌，接種后第14天觀察葉片病斑表型（圖2），十里香在接種93-5單孢菌系后葉片表面無(wú)癥狀，呈典型的抗病反應(yīng)。豫谷1號(hào)接種93-5單孢菌系后葉片表面布滿較大的銹孢子堆，呈典型的感病反應(yīng)。

圖2 接種谷銹菌后第14天的谷子葉片照片

2.3 SiMYBs基因在谷子抗病、感病反應(yīng)中的表達(dá)比較

為檢測(cè)9個(gè)SiMYBs基因在谷子響應(yīng)銹菌脅迫反應(yīng)中的表達(dá)情況，選取谷子十里香和豫谷1號(hào)接種谷銹菌后0、12、24、36、48、72、96和120 h的葉片材料，用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)基因的表達(dá)變化并進(jìn)行對(duì)比分析（圖3），在抗?。≧：十里香-93-5）、感?。⊿：豫谷1號(hào)-93-5）反應(yīng)中沒有發(fā)生明顯的表達(dá)變化。和在R、S反應(yīng)中均下調(diào)表達(dá)，并且24 h時(shí)下調(diào)幅度最顯著，可能參與了植物基礎(chǔ)免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控。在2種反應(yīng)中均表達(dá)上調(diào)，且在S反應(yīng)中明顯高于R反應(yīng)，認(rèn)為在基礎(chǔ)免疫中起作用，且在感病過程中反應(yīng)更劇烈。在R反應(yīng)早期上調(diào)表達(dá)，在S反應(yīng)早期下調(diào)表達(dá)，以12 h變化最為顯著；在R反應(yīng)的12和36 h顯著上調(diào)表達(dá)，而S反應(yīng)過程中沒有發(fā)生明顯可見的表達(dá)變化，推測(cè)和的表達(dá)具有抗病特異性，在抗病反應(yīng)早期起作用。和在R反應(yīng)的48 h內(nèi)下調(diào)表達(dá)，之后恢復(fù)到正常表達(dá)水平，而S反應(yīng)中持續(xù)下調(diào)表達(dá)，且維持低水平的表達(dá)，推測(cè)這兩個(gè)基因在抗病反應(yīng)的中后期起作用。在R、S反應(yīng)的48 h內(nèi)表達(dá)模式相反，R反應(yīng)顯著下調(diào)表達(dá)，S反應(yīng)顯著上調(diào)表達(dá)，以12和36 h差異最顯著，說(shuō)明該基因與抗病相關(guān)。

圖3 SiMYBs基因在谷子抗病、感病反應(yīng)中的表達(dá)模式比較分析

2.4 SiMYBs基因在十里香外接SA和MeJA后的表達(dá)變化

為了檢測(cè)谷子抗病品種十里香中9個(gè)SiMYBs基因?qū)τ诩に豐A和MeJA處理的響應(yīng)，選取處理后0、12和24 h的葉片材料，用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)SiMYBs基因的表達(dá)情況（圖4）。SA處理后的24 h內(nèi)，、、和在12 h均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，24 h出現(xiàn)不同程度的下調(diào)。、、、和下調(diào)表達(dá)，其中基因和的表達(dá)量在處理后12 h下調(diào)至最低，24h恢復(fù)到0 h表達(dá)量。

MeJA處理后的24 h內(nèi)，、、、、和上調(diào)表達(dá)。除表達(dá)持續(xù)上調(diào)外，其余5個(gè)基因表達(dá)模式一致，均在12 h表達(dá)量最大，24 h下降至初始值或以下。、和在檢測(cè)的24 h內(nèi)均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其中在12 h顯著下調(diào)表達(dá)，24 h上調(diào)表達(dá)至0 h的2倍。

圖4 SiMYBs基因在激素SA和MeJA處理的十里香葉片中的表達(dá)

9個(gè)SiMYBs基因中，、、、、、和在SA、MeJA處理的不同時(shí)間點(diǎn)的葉片中表達(dá)模式相似，和表達(dá)模式相反。

2.5 SiMYBs基因在谷子抗病、感病反應(yīng)與外接SA和MeJA反應(yīng)中表達(dá)模式的對(duì)比分析

對(duì)SiMYBs基因在谷子抗?。≧）、感?。⊿）反應(yīng)與SA和MeJA處理早期時(shí)間點(diǎn)（12和24 h）表達(dá)模式進(jìn)行對(duì)比分析（圖5）。在R、S、SA和JA反應(yīng)中，4個(gè)SiMYBs基因（、、和）在R、SA與MeJA反應(yīng)中的表達(dá)模式基本一致，不同于S反應(yīng)，其中，僅在R、SA和MeJA反應(yīng)12 h上調(diào)表達(dá)，而S反應(yīng)中持續(xù)高水平上調(diào)表達(dá)；和在R、SA和MeJA反應(yīng)中上調(diào)表達(dá)，S反應(yīng)中下調(diào)表達(dá)或表達(dá)無(wú)明顯變化；在R、SA和MeJA反應(yīng)中下調(diào)表達(dá)，在S反應(yīng)中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)這四個(gè)基因通過SA和JA信號(hào)途徑參與谷子的早期抗病反應(yīng)。2個(gè)基因（與）在R、S、SA和MeJA反應(yīng)中的表達(dá)模式一致，均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們通過SA、JA途徑參與了植物早期基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。3個(gè)SiMYBs基因（、和）在R、S、SA和MeJA反應(yīng)中的變化趨勢(shì)不同。在SA和MeJA反應(yīng)中表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在R和S反應(yīng)中表達(dá)無(wú)明顯變化；和在R、S和SA反應(yīng)中均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，而MeJA反應(yīng)中上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這兩個(gè)基因通過SA途徑參與谷子早期基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。

2.6 SiMYBs基因轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性是其正常發(fā)揮生物學(xué)功能的重要前提條件，因此，對(duì)篩選到的5個(gè)抗病相關(guān)的SiMYBs基因（、、、和）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性的檢測(cè)（圖6-A），在SD/-Trp平板上，5個(gè)pBD-SiMYBs載體和pBD空載體轉(zhuǎn)化的酵母均可以正常生長(zhǎng)；在SD/-Trp/X-α-gal/Aba平板上，pBD-SiMYBs載體轉(zhuǎn)化的酵母均可以正常生長(zhǎng)且變藍(lán)，pBD空載體轉(zhuǎn)化的酵母不能生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，5個(gè)SiMYBs轉(zhuǎn)錄因子均具有轉(zhuǎn)錄激活活性，通過激活酵母中報(bào)告基因，分解底物X-α-gal發(fā)生顯色反應(yīng)。

圖5 SiMYBs基因在抗病、感病反應(yīng)和外源SA、MeJA處理早期（12和24 h）表達(dá)模式比較

A：SiMYBs在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)；B：SiMYBs在水稻原生質(zhì)體細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

2.7 SiMYBs蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的5個(gè)抗病相關(guān)SiMYBs基因與YFP的融合表達(dá)載體（pSiMYB041-YFP、pSiMYB074-YFP、pSiMYB100-YFP、pSiMYB177-YFP和pSiMYB202- YFP）和pYFP空載體，分別轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體細(xì)胞。通過共聚焦顯微鏡觀察（圖6-B），5個(gè)基因均啟動(dòng)了YFP的表達(dá)形成綠色熒光蛋白，主要在水稻原生質(zhì)體的細(xì)胞核區(qū)域表達(dá)，綠色熒光蛋白信號(hào)與核定位信號(hào)重合，而空載體的綠色熒光信號(hào)遍布整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。

3 討論

谷子基因組中已鑒定到209個(gè)SiMYBs基因[7]，是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。MYB轉(zhuǎn)錄因子因包含不同數(shù)目的R結(jié)構(gòu)域而具有不同的功能：（1）1R-MYB只含有一個(gè)R結(jié)構(gòu)域，主要功能是維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[32]。本研究中屬于此亞組，在葉片中相對(duì)表達(dá)量最高，R、SA和MeJA反應(yīng)中表達(dá)模式一致，具有抗病特異性；經(jīng)過轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè)，SIMYB100具有激活活性且定位到細(xì)胞核中，推測(cè)是通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄參與谷子的抗病反應(yīng)，但這一結(jié)論需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。（2）R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的N端含有2個(gè)R結(jié)構(gòu)域，廣泛參與細(xì)胞分化、激素應(yīng)答、次生代謝、環(huán)境脅迫以及抵抗病原菌的侵害[33]。本研究中、、和在抗病反應(yīng)不同階段的表達(dá)量明顯高于感病反應(yīng)，表現(xiàn)出對(duì)銹菌侵染的特異性表達(dá)，印證了這一亞組的功能。

在植物發(fā)育過程中MYB基因主要參與了根部器官的形態(tài)建成和根毛的發(fā)育過程。本研究中除外，其余8個(gè)基因均在根部表達(dá)最多。表達(dá)模式最典型，除了根部高表達(dá)外，其余部位的表達(dá)極低，推測(cè)可能特異的參與根部的生長(zhǎng)發(fā)育或根毛發(fā)育。目前有關(guān)MYB調(diào)控根部生長(zhǎng)發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)越來(lái)越清晰：WER（R2R3 MYB）和CPC（R3 MYB）能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GL3/EGL3-TTG形成復(fù)合物，再作用于以促進(jìn)根毛凸起[34]。但本研究中的是否與此調(diào)控機(jī)制一致，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

SiMYB基因響應(yīng)生物脅迫（銹菌）和非生物脅迫（高鹽、干旱等）的表達(dá)模式不同。如與在抗病早期12和36 h均被誘導(dǎo)表達(dá)，是0 h表達(dá)量的2倍以上；而谷子品種Prasad[7]中和的表達(dá)量在處理早期（1 h）和后期（24 h）的高鹽脅迫下表現(xiàn)下調(diào)而干旱脅迫下表現(xiàn)上調(diào)，說(shuō)明2個(gè)基因以不同的表達(dá)方式參與了谷子的生物與非生物脅迫反應(yīng)。此外，與在谷子Prasad中均不響應(yīng)高鹽與干旱脅迫反應(yīng)[7]，而本研究中這兩個(gè)基因在抗病、感病反應(yīng)后期不同的表達(dá)模式表明它們與抗病相關(guān)。楊樹中的同源基因[35]的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株能夠激活原花青素合成基因的表達(dá)，增強(qiáng)了楊樹對(duì)潰瘍病菌的抗性，與本研究中的表達(dá)可能正調(diào)控抗病反應(yīng)的結(jié)果一致。

激素SA和JA作為重要的信號(hào)分子激活并介導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)。在激素調(diào)控的過程中，SA和JA信號(hào)之間既有相互拮抗，也存在相互協(xié)作[36-37]。通常認(rèn)為，SA信號(hào)通路主要參與對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原物的抗性反應(yīng)，JA主要參與對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原物的抗性反應(yīng)[38-40]。本研究中，谷銹菌屬于活體營(yíng)養(yǎng)型病原物，和在R、S和SA反應(yīng)早期（12和24 h）均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，而JA反應(yīng)中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們通過SA信號(hào)途徑參與谷子早期的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。而4個(gè)SiMYBs基因（、、和）在R、SA和JA反應(yīng)中表達(dá)變化趨勢(shì)一致，和在R、S、SA和JA反應(yīng)中表達(dá)模式一致，提示6個(gè)基因可能通過SA和JA信號(hào)途徑協(xié)同參與谷子的抗病反應(yīng)或基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。SA和JA信號(hào)分子在谷子抗銹病過程中的協(xié)同或拮抗關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

鑒定到、、、和的表達(dá)與谷子抗銹病相關(guān)，并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在根部特異性表達(dá)，在葉片中高水平表達(dá)，且在谷子生長(zhǎng)發(fā)育和抗病過程中都發(fā)揮一定的功能。、、和在R、SA與MeJA反應(yīng)中的表達(dá)模式基本一致，它們可能通過SA和JA信號(hào)途徑協(xié)同參與谷子的早期抗病反應(yīng)。

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Identification and Expression Analysis of Myb Transcription Factors Related to Rust Resistance in Foxtail Millet

BAI Hui1, SONG ZhenJun2, WANG YongFang1, QUAN JianZhang1, MA JiFang1, LIU Lei1, LI ZhiYong1, DONG ZhiPing1

(1Institute of Millet Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/National Foxtail Millet Improvement Center/Minor Cereal Crops Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050035;2College of Communication and Information Engineering, Shanghai Technical Institute of Electronic & Information, Shanghai 201411)

Millet rust is one of the important factors affecting the yield and quality of foxtail millet. Identification of MYB transcription factors related to rust resistance in foxtail millet lays a foundation for the study of the mechanism of rust resistance in foxtail millet.In this study, we used real-time PCR to detect the expression patterns of 9transcription factors (1) in roots, stems, leaves and panicles at booting stage; (2) during 120 hours post-inoculated withurediniospores in resistance (R) and susceptible (S) reactions; (3) during 24 hours after treatment with salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) in foxtail millet. Then their expression patterns in four reactions of R, S, SA and MeJA were compared, and the resistance-related MYB transcription factors were selected for detection of transactivation activity and subcellular localization.The highest expression ofwas in leaves, and the highest expression of the other eight genes, especially, was in roots. The expression of five genes was correlated with disease resistance.andwere induced by rust fungus infection and their expression levels at early stage of disease resistance were significantly higher than that in the susceptible reaction. The expression ofandwas down-regulated in the early stage of resistance reaction and increased to pre-inoculation level in the later stage, while their expression remained low in susceptible reaction.showed opposite expression pattern in resistance and susceptible responses. In response to exogenous SA and MeJA, the expression ofgene changed in varying degrees. The expression patterns of four genes (,,and) in the R, SA and MeJA reactions were identical, but different from the S reaction. Five resistance-relatedgenes have the transactivation activity and their encoding proteins are located in the nucleus.The expression of five genes,,,,and, was identified to be associated with resistance to rust disease in foxtail millet.andplay certain roles in the growth and disease resistance of foxtail millet. Four genes,,,and, may participate in early disease resistance of foxtail millet through SA and JA signaling pathways.

; MYB transcription factors; rust disease; real-time PCR; disease resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.007

2019-08-01；

2019-09-30

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000703，2018YFD1000700）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31872880）、河北省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新工程（2019-4-2-3）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-07-13.5-A8）

白輝，E-mail：baihui_mbb@126.com。通信作者李志勇，E-mail：lizhiyongds@126.com。通信作者董志平，E-mail：dzping001@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）