董明，再吐尼古麗·庫爾班，呂芃，杜瑞恒，葉凱，侯升林，劉國慶

高粱苗期耐鹽性轉(zhuǎn)錄組分析和基因挖掘

董明1，再吐尼古麗·庫爾班2，呂芃1，杜瑞恒1，葉凱2，侯升林1，劉國慶1

（1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所/河北省雜糧重點實驗室，石家莊 050035；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，烏魯木齊 830091）

【】探究高粱耐鹽脅迫響應(yīng)機制，挖掘高粱耐鹽脅迫基因，為高粱耐鹽育種提供理論基礎(chǔ)。以高粱感鹽品種L甜和耐鹽品種石紅137為供試材料，采用水培試驗。待高粱植株長至三葉一心期，使用2%NaCl溶液對幼苗進(jìn)行鹽脅迫，分別設(shè)置0（對照）、1和24 h處理，每個處理3次重復(fù)。測定不同處理樣品株高、根長、干物重、Na+含量和葉綠素相對含量（SPAD值），并依托Illumina HiSeq 2000平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。利用FPKM方法計算基因表達(dá)量，在差異表達(dá)基因檢測過程中，將差異表達(dá)倍數(shù)（fold change）≥2且FDR＜0.001作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過Gene Ontology和KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對參與高粱不同時間鹽脅迫差異表達(dá)基因進(jìn)行分析注釋。鹽脅迫處理對高粱株高、根長、干物重等性狀無顯著影響，對鈉離子含量和SPAD值影響顯著。石紅137株高、根長、鈉離子含量和SPAD值均高于L甜。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果鑒定得到已知基因26 628個，新基因866個。石紅137中的差異基因數(shù)目高于L甜。石紅137中，0 h vs 1 h、0 h vs 24 h、1 h vs 24 h三組的差異基因數(shù)目分別為375、4 206和3 750個。感鹽品種L甜中，0 h vs 1 h、0 h vs 24 h、1 h vs 24 h三組的差異基因數(shù)目分別為167、2 534和1 612個。GO分析共獲得25個功能注釋，分別為光合作用、細(xì)胞物質(zhì)代謝、翻譯過程以及激素合成等與鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因。KEGG分析發(fā)現(xiàn)鹽脅迫1 h表達(dá)差異基因富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，涉及脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（auxin，AUX）、細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）、赤霉素（gibberellins，GS）、乙烯（ethylene，ETH）過程等共71個基因。鹽脅迫24 h表達(dá)差異基因富集于光合作用相關(guān)途徑，涉及Lhca、Lhcb、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC）、磷酸核酮糖激酶（phosphorylribonucleic kinase，PRK）等20個基因。類黃酮生物合成代謝途徑差異可能是引起石紅137和L甜的耐鹽能力差異的原因之一，花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）和黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）參與類黃酮生物合成途徑。高粱的鹽脅迫過程是一個復(fù)雜的生物過程，依賴于多個基因在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的平衡表達(dá)。鹽脅迫條件下，高粱應(yīng)對環(huán)境刺激受到激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用的控制。類黃酮生物合成途徑在耐鹽品種中起到了重要作用。

高粱；鹽脅迫；轉(zhuǎn)錄組；基因挖掘

0 引言

【研究意義】鹽脅迫是一類重要的非生物脅迫，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。鹽脅迫下，植物的光合作用、呼吸速率以及物質(zhì)代謝受到嚴(yán)重危害，最終導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。高粱作為一種重要的糧食兼經(jīng)濟作物，具有較強的抗旱、耐鹽堿能力[2]，但不同品種間耐鹽性存在較大差異。高粱耐鹽基因的鑒定與挖掘能為探討高粱耐鹽的分子機理、培育耐鹽品種提供堅實基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，全球范圍內(nèi)約有10億hm2的土地存在不同程度的鹽漬化[3]。鹽脅迫對高粱的生長發(fā)育有很大影響，根據(jù)田間土壤鹽分運行規(guī)律，作物在萌發(fā)和幼苗生長期間受鹽脅迫的危害尤為嚴(yán)重。鹽脅迫除了使植物受到離子脅迫之外，同時使植物受到水脅迫和低氧脅迫等。在鹽漬土上種植耐鹽品種是減輕土壤漬化危害的有效方法。早期大量研究表明鹽脅迫條件下，鹽害主要通過改變土壤溶液滲透勢和離子濃度影響植物根系對礦質(zhì)元素的吸收[4]，從而對植株地上部分產(chǎn)生影響，包括植株的形態(tài)發(fā)育、水分平衡、質(zhì)膜透性、光合作用、呼吸作用以及物質(zhì)代謝等途徑[5-8]。植物對抗鹽脅迫是一個復(fù)雜的過程，涉及多個與發(fā)育和生理相關(guān)的途徑[9]。耐鹽植物的耐鹽性主要體現(xiàn)在植株體內(nèi)的離子平衡，Na+和Cl-被貯藏在液泡內(nèi)，保持細(xì)胞滲透勢的穩(wěn)定[10]。部分有機溶質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)也起到穩(wěn)定細(xì)胞滲透勢的作用。目前，在水稻中鑒定出對鹽脅迫反應(yīng)的基因有280個，耐鹽相關(guān)QTL有332個，遍布水稻的整個基因組，耐鹽相關(guān)miRNA有29個[11]。RNA-Seq技術(shù)可以篩選耐鹽與鹽敏感植株的差異表達(dá)基因，鑒定植株響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答基因及表達(dá)特性，以期更好地理解植物對鹽脅迫響應(yīng)的分子機制，為進(jìn)一步鑒定和克隆重要的耐鹽基因，提高植物耐鹽性狀奠定基礎(chǔ)。利用該技術(shù)對玉米[12]、小麥[13]和高粱[14-16]等耐鹽影響因子和機理進(jìn)行了初步探討，對作物耐鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析起到了促進(jìn)作用。王海蓮等[17]利用石紅137和L甜雜交衍生181個重組自交系，發(fā)現(xiàn)長時間低鹽脅迫會抑制高粱幼苗生長。在鹽脅迫下控制高粱苗高、苗鮮重和苗干重QTL的表達(dá)具有較強的環(huán)境特異性，而控制高粱苗高的qSH1-1和qSH7-2在高粱耐鹽遺傳改良中將發(fā)揮重要作用。同時研究發(fā)現(xiàn)6個主要QTL和5個染色體區(qū)域在高粱耐鹽過程中起到關(guān)鍵作用[18]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對高等植物耐鹽性分子機制的研究主要集中在擬南芥和水稻，在高粱中報道較少，且主要集中在個別轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控分析或赤霉素和多效唑?qū)Ω吡荒望}的影響等，對于高粱苗期耐鹽的轉(zhuǎn)錄組測序分析較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對高粱耐鹽品種和感鹽品種進(jìn)行鹽脅迫處理，通過轉(zhuǎn)錄組測序研究高粱對抗鹽脅迫的分子機制，同時比較感鹽和耐鹽品種間響應(yīng)鹽脅迫的差異，為探究高粱耐鹽脅迫機制提供豐富理論途徑，并為高粱耐鹽育種奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)Wang等[18]研究結(jié)果選用感鹽品種L甜和耐鹽品種石紅137為供試材料。試驗材料選取水培方式種植，種子消毒后擺放在培養(yǎng)盒中，在28℃長日照（16 h/8 h）條件下培養(yǎng)。待長至一葉一心，用Hoagland培養(yǎng)液代替水進(jìn)行培養(yǎng)。在三葉一心期利用2% NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，處理時間分別為0（對照）、1和24 h，每個處理3次重復(fù)。處理結(jié)束之后將葉片迅速剪下放入液氮中冷凍，樣品放于-80℃貯藏。干樣取下之后放入105℃烘箱10 min殺青，之后80℃烘干至恒重備用。

1.2 鈉離子含量測定

樣品鈉含量采用HNO3-H2O2方法消煮。稱取樣品0.2 g至消煮管中，加入HNO3-H2O2（4﹕1）混合液5 mL，靜置12 h以上，用江蘇宜興的LNK-872型多功能快速消化器消煮至溶液蒸干。冷卻至室溫，加入5% HNO3溶液8 mL，70℃封口水浴2—3 h，渦旋、靜置，至溶液澄清后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，用ICP-OES（PerkinElmer OPTIMA 210DV）對樣品進(jìn)行測定。

1.3 葉綠素相對含量測定

高粱葉片葉綠素相對含量通過日本產(chǎn)SPAD-502型葉綠素儀進(jìn)行測定。

1.4 cDNA文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

樣品RNA由百邁客生物科技有限公司制備。RNA樣品通過質(zhì)量檢測進(jìn)入Illumina HiSeq 2000平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。下機所得原始數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)過過濾得到純凈數(shù)據(jù)（clean data），純凈數(shù)據(jù)再與指定參考基因組（Sbicolor_v2.1）比較得到比對數(shù)據(jù)（mapped data）。

1.5 差異基因的篩選

將樣品處理兩兩比較得到差異基因。在差異表達(dá)基因檢測過程中，將Fold Change≥2且FDR＜0.001作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)（fold change）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）是通過對差異顯著性值（-value）進(jìn)行校正得到。采用了公認(rèn)的Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設(shè)檢驗得到的顯著性值（-value）進(jìn)行校正，并最終采用FDR作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.6 差異基因的注釋和分類

將比較得到的差異基因依次和Nr（NCBI non-redundant protein，NCBI非冗余蛋白）數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot（Swiss-Prot proteinsequence，瑞士蛋白序列）數(shù)據(jù)庫、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫、COG（clusters of orthologousgroups of proteins，蛋白直系同源聚類）數(shù)據(jù)庫和GO（gene ontology，基因本體論數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行比對，從而獲得與差異基因?qū)?yīng)的蛋白功能注釋及功能分類統(tǒng)計。

1.7 實時熒光定量PCR分析（qRT-PCR）

為了驗證高粱耐鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準(zhǔn)確性，從差異基因數(shù)據(jù)庫中隨機挑選4個基因，利用Primer 6.0設(shè)計引物（表1），分析實時熒光定量PCR結(jié)果是否與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

2 結(jié)果

2.1 鹽脅迫對高粱的影響

鹽脅迫處理能夠影響高粱葉片的鈉離子含量和SPAD值（圖1）。對株高、根長、干物重等性狀無顯著影響，石紅137株高和根長高于L甜（表2）。鹽脅迫處理1 h，植株表型未出現(xiàn)明顯變化。鹽脅迫處理24 h時，植株樣品出現(xiàn)明顯萎蔫（圖2）。與對照相比，2個品種的鈉離子含量均在鹽脅迫處理24 h達(dá)到最高，且差異顯著。SPAD值在鹽脅迫處理24 h顯著降低。石紅137在2個時期鹽脅迫處理的鈉離子含量和SPAD值均高于L甜。

表1 實時熒光定量PCR引物

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果評估

取2個高粱品種鹽脅迫0、1和24 h葉片樣品，分別提取各個樣品RNA，進(jìn)行質(zhì)檢、構(gòu)建文庫之后，利用Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序。6個處理18個樣本高通量測序得到序列標(biāo)簽數(shù)在42 082 348—56 174 902，比對到參考基因組的序列標(biāo)簽數(shù)在33 795 395—44 513 494，各樣品的序列標(biāo)簽與參考基因組的比對效率在76.27%—79.74%。經(jīng)過測序質(zhì)量控制，共得到130.80 Gb處理后的數(shù)據(jù)量，各樣品Q30堿基百分比均不小于92.40%（表3）。將所有的處理后序列標(biāo)簽組裝并與參考基因組進(jìn)行比對，鑒定出已知基因26 628個，新基因866個。

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平 Different lowercase letters indicate a significant difference at a 5% level between different treatments

A：鹽脅迫0 h；B：石紅137鹽脅迫處理 A: 0 h salt stress of Shihong137 and L tian; B: Salt stress treatment and control treatment of Shihong137

表2 鹽脅迫不同時間農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

g：感鹽品種L甜；n：耐鹽品種石紅137；gCK：L甜對照處理；g1h：L甜鹽脅迫1h處理；g24h：鹽脅迫24 h處理；nCK：石紅137對照處理；n1h：石紅137鹽脅迫1 h處理；n24h：石紅137鹽脅迫24 h處理。下同

g: Salt sensitive variety L tian; n: Salt tolerant variety Shihong 137; gCK: L tian control; g1h: L tian salt stress for 1 h; g24h: L tian salt stress for 24 h; nCK: Shihong 137 control; n1h: Shihong 137 salt stress for 1 h; n24h: Shihong 137 salt stress for 24 h. The same as below

2.3 鹽脅迫不同時期差異基因篩選

不同處理兩兩比較，得到差異基因數(shù)目（DEGs）（表4）。耐鹽品種石紅137中，0 h vs 1 h、0 h vs 24 h和1 h vs 24 h的差異基因數(shù)目分別為375、4 206和3 750個。感鹽品種L甜中，0 h vs 1 h、0 h vs 24 h和1 h vs 24 h的差異基因數(shù)目分別為167、2 534和1 612個。相同處理時間2個品種之間比較，gCK vs nCK、g1h vs n1h和g24h vs n24h的差異基因數(shù)目分別為1 240、1 184和1 910。石紅137在鹽脅迫后的差異基因數(shù)目明顯高于L甜，鹽脅迫后1 h高出124.55%，24 h高出65.98%。2品種都是在鹽脅迫24 h后DEG數(shù)目迅速升高，達(dá)到最高值。鹽脅迫24 h DEG數(shù)目高于1 h DEG數(shù)目，石紅137增加數(shù)量較多，增幅1000.00%，而L甜增幅較小，增加965.27%。

表3 高粱葉片轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計

表4 鹽脅迫不同時期差異基因數(shù)目

在3組比較中，L甜有13個差異基因共表達(dá)，石紅137有51個差異基因共表達(dá)。有727個基因在2個品種中共表達(dá)。不同品種之間的差異基因表達(dá)數(shù)目比單個品種中不同處理比較的差異基因表達(dá)數(shù)目多（圖3）。

2.4 與鹽脅迫相關(guān)差異基因

根據(jù)GO功能注釋，nCK vs n1h和gCK vs g1h富集差異最為顯著的前10個生物過程可分為3類，且僅有一個不同（表5）。分別為：1）與激素相關(guān)：生長激素的響應(yīng)、吲哚乙酸生物合成；2）與細(xì)胞物質(zhì)代謝相關(guān)：谷胱甘肽代謝過程、色氨酸分解代謝過程、脯氨酸轉(zhuǎn)運、甲硫氨酸生物合成硫代葡萄糖苷過程；3）對脅迫的直接響應(yīng)：對缺水反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對磷缺乏的反應(yīng)、細(xì)胞高滲鹽度反應(yīng)（nCK vs n1h）/脫黃化（gCK vs g1h）。

表5 高粱葉片中鹽脅迫差異基因的GO富集分析

g：感鹽品種L甜；n：耐鹽品種石紅137；gCK：L甜對照處理；g1h：L甜鹽脅迫1 h處理；g24h：鹽脅迫24 h處理；nCK：石紅137對照處理；n1h：石紅137鹽脅迫1 h處理；n24h：石紅137鹽脅迫24 h處理。下同

nCK vs n24h和gCK vs g24h富集差異最為顯著的前10個生物過程有4個過程不同。nCK vs n24h中GO富集差異最顯著的前十個生物過程分為：1）與光合作用相關(guān)過程：光系統(tǒng)Ⅱ組件、類囊體膜組織、光系統(tǒng)Ⅰ中的光合電子運輸、對紅光的反應(yīng)；2）與細(xì)胞物質(zhì)代謝相關(guān)的生物過程：麥芽糖代謝過程、淀粉生物合成、半胱氨酸生物代謝過程、色氨酸分解代謝過程；3）與翻譯相關(guān)生物過程：rRNA過程；4）與激素相關(guān)的生物過程：對karrikin的響應(yīng)。gCK vs g24h富集差異最為顯著的前10個生物分為：1）與光合作用相關(guān)過程：光系統(tǒng)Ⅱ組件、對紅光的響應(yīng)、光系統(tǒng)Ⅰ中的光合電子運輸、類囊體膜組織；2）與細(xì)胞物質(zhì)代謝相關(guān)的生物過程：戊糖磷酸支路、異戊烯二磷酸生物合成，4-甲基季戊四醇途徑、麥芽糖代謝過程、淀粉生物合成；3）與激素相關(guān)生物過程：對karrikin的響應(yīng)、生長激素的響應(yīng)。

KEGG富集分析表明，gCK vs g1h和nCK vs n1h差異基因主要富集在植物激素信號傳導(dǎo)途徑。gCK vs g24h和nCK vs n24h差異基因的前五個富集通路中有4個相同：分別為光合器官中的碳固定、碳代謝、氨基酸生物合成和光合作用-天線蛋白。另外一個不同通路在gCK vs g24h和nCK vs n24h分別為丙酮酸代謝和光合作用。g1h vs g24h和n1h vs n24h差異基因的前五個富集通路有4個通路相同，且與gCK vs g24h和nCK vs n24h一致。兩類蛋白與高粱葉片鹽脅迫相關(guān)：鹽脅迫早期與植物激素信號相關(guān)、鹽脅迫后期主要涉及到光合作用。2個品種的同一時期比較發(fā)現(xiàn)CK之間沒有顯著的富集通路，而比較鹽脅迫1 h處理和24 h處理有共同的富集通路類黃酮代謝。

2.5 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

植物激素不僅能夠調(diào)控植株的生長發(fā)育，還參與的植物的非生物脅迫。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包含了生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）和赤霉素（GS）（圖4），分別鑒定出基因22、24、11、9和5個。IAA途徑包括AUX、ARF、GH3和SAUR 4個基因家族，ABA途徑包括：ABF、SnRK2、PP2C和PYR/PYL 4個基因家族。SAUR和ABF同源基因全部表達(dá)上調(diào)，其他同源基因在不同處理中表達(dá)模式不同。

2.6 光合作用相關(guān)途徑

Lhca、Lhcb、PPC和PRK等20個光合作用相關(guān)途徑基因參與耐鹽脅迫過程（表4）。PPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）是參與植物碳固定的關(guān)鍵酶，參與光合作用的暗反應(yīng)。Sobic.002G167000在2個品種中均表達(dá)上調(diào)，分別上調(diào)3.80和5.19倍。Sobic.010G160700在2個品種中均下調(diào)表達(dá)。Sobic.004G106900和Sobic.007G106500的表達(dá)模式在2個品種中表現(xiàn)不同。LHC是一類能夠捕獲光能并能將能量迅速傳至反應(yīng)中心引起光化學(xué)反應(yīng)的色素蛋白[19]，分為2個亞類：Lhca和Lhcb，2個品種中Lhca和Lhcb的同源基因均表達(dá)下調(diào)。PRK（磷酸核酮糖激酶）參與碳固定和碳代謝2個途徑，PRK 2個同源基因在2個品種中均表達(dá)下調(diào)（表6），下調(diào)基因在2個品種中分別達(dá)到1.24—128.71倍和9.99—863.12倍。下調(diào)基因倍數(shù)在石紅137中高于L甜。

2.7 類黃酮途徑

類黃酮是植物體內(nèi)重要的次生代謝物之一。通過KEGG富集圖比較分析發(fā)現(xiàn)，2個品種在對照不理中無差異顯著的富集通路（圖5）。鹽脅迫1和24 h處理中存在類黃酮生物合成途徑，且差異顯著?；ㄇ嗨剡€原酶（ANR）Sobic.006G226400和黃酮醇合成酶（FLS）Sobic.004G310100參與到類黃酮生物合成途徑，2個基因在石紅137中的表達(dá)量高于L甜（圖6）。

A：gCK vs nCK；B：g1h vs n1h；C：g24h vs n24h

表6 涉及光合作用與鹽脅迫相關(guān)的基因

圖6 ANR（A）和FLS（B）在2個品種的FPKM值

2.8 實時熒光定量PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，隨機選取4個與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用途徑相關(guān)基因進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證（圖7）。將qRT-PCR數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，其中有3個基因qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯著相關(guān)（<0.05），表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實可靠。

A：Sobic.006G18400；B：006G034300；C：004G300300

3 討論

高粱葉片對鹽脅迫的響應(yīng)受到多種途徑的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄組的整體分析有利于系統(tǒng)性了解高粱的耐鹽機制。為了篩選高粱耐鹽基因，本研究對2個高粱品種的2個鹽脅迫時期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序并對差異基因進(jìn)行注釋。本研究所選2個高粱品種代表了對鹽脅迫的不同反應(yīng)。L甜對鹽脅迫的反應(yīng)要弱于石紅137對鹽脅迫的反應(yīng)，了解2個品種對鹽脅迫響應(yīng)的差異，可以揭示控制石紅137的耐鹽基因，從而對高粱耐鹽基因表達(dá)形成全面了解。

在2個品種中，total reads最低達(dá)到42 082 348，最高達(dá)到56 174 902。平均有78.33%的reads比對到了參考基因組（表3）。結(jié)果表明，所選數(shù)據(jù)庫相對完整。其余的注釋基因未在參考基因組中檢測到，鑒定為新基因。

3.1 2個品種中的差異基因

為確定響應(yīng)鹽脅迫的相應(yīng)基因，對鹽脅迫處理3個時期的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因進(jìn)行比較。結(jié)果表明，gCK vs g24h和g1h vs g24h差異基因數(shù)目明顯高于gCK vs g1h的差異基因數(shù)目，與L甜的形態(tài)指標(biāo)變化一致。nCK vs n24h和n1h vs n24h的差異基因數(shù)目高于nCK vs n1h，這與Na+離子含量變化相對應(yīng)。石紅137在鹽脅迫3個時期差異基因的數(shù)目均高于L甜的差異基因數(shù)目，這表明與感鹽品種L甜相比，耐鹽品種石紅137的有更多的基因參與到鹽脅迫中，為進(jìn)一步闡明高粱耐鹽的調(diào)控機制提供了研究基礎(chǔ)。

GO富集分析顯示，激素響應(yīng)、光合作用以及碳代謝相關(guān)途徑參與到高粱葉片的鹽脅迫中來，有利于高粱及時響應(yīng)鹽脅迫。KEGG分析還發(fā)現(xiàn)差異基因涉及激素信號傳導(dǎo)、光合作用以及類黃酮代謝途徑，這些過程都在高粱應(yīng)對鹽脅迫過程中起著重要作用。

3.2 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

植物激素是重要的次級信號分子，能夠調(diào)節(jié)多種外界環(huán)境刺激[20]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）、赤霉素（GA）、都參與到高粱葉片的鹽脅迫，這些基因耐鹽脅迫過程中表達(dá)模式不同。

ABA在非生物脅迫中起著重要作用，有研究表明高鹽條件下植物會誘導(dǎo)產(chǎn)生ABA，并且ABA信號通路在植物對抗鹽脅迫過程中是必需的[21]。ABA能夠響應(yīng)干旱、鹽脅迫等多種非生物脅迫[22]。植物體內(nèi)ABA信號分為依賴ABA途徑和非依賴ABA途徑[23]，ABA信號途徑由PYR/PYL/PCAR（ABA受體）、PP2C（蛋白磷酸酶2C家族）、SnRK2（SNF1相關(guān)蛋白激酶）和ABF（ABA響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子）組成，通過4個部分的調(diào)節(jié)響應(yīng)鹽脅迫信號。PYR/PYL能夠通過抑制PP2C，釋放SnRK2激酶，以磷酸化的形式調(diào)節(jié)ARF活性[24-25]。本研究中ARF的2個同源基因在2個品種中均表達(dá)上調(diào)，表明ABA含量升高，與Zhu等[22]研究結(jié)果一致，表明高粱通過提高植株體內(nèi)ABA活性來對抗鹽脅迫。

生長素作為調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的植物激素，近年來發(fā)現(xiàn)對非生物脅迫也具有重要的調(diào)節(jié)作用[26-27]。有研究分析發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫中生長素原初反應(yīng)相關(guān)基因、、、的表達(dá)量發(fā)生改變[28]。鹽脅迫會使植物因為水分吸收受阻而導(dǎo)致滲透脅迫，研究表明外源增施生長素能夠提高擬南芥葉片的保水能力[29]。本研究獲得參與生長素途徑的基因家族，這些基因在鹽脅迫過程中被顯著調(diào)節(jié)。AUX/IAA的同源基因Sobic.003G291200在應(yīng)對鹽脅迫過程中顯著提高。表明高粱應(yīng)對外界鹽脅迫依賴于AUX/IAA介導(dǎo)的信號過程。

3.3 光合作用相關(guān)途徑

后期參與鹽脅迫的途徑為光合作用相關(guān)途徑，這些途徑包括光合器官中的碳固定、碳代謝和光合作用-天線蛋白途徑。光合作用是植物生產(chǎn)的能量的主要方式，對植物的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。

光合作用包括2個步驟：光反應(yīng)階段和暗反應(yīng)階段。光反應(yīng)又分為2個階段：原初反應(yīng)、電子傳遞和光合磷酸化。原初反應(yīng)包含光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化。本研究中涉及到原初反應(yīng)的途徑為光合作用-天線蛋白。LHC是一類捕光蛋白復(fù)合體，能夠捕獲光能并把能量傳遞至反應(yīng)中心[19,30]。本研究發(fā)現(xiàn)在2個品種中Lhca和Lhcb 2組蛋白的表達(dá)量下調(diào)?？赡苁且驗樵邴}脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)滲透勢升高，為了維持植物細(xì)胞內(nèi)正常的生理活動，高粱葉片LHC多個蛋白下調(diào)表達(dá)，以降低光合速率，而使高粱適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。PPC是C4作物進(jìn)行光合作用碳固定的關(guān)鍵酶[31]，本研究2個PPC同源基因（Sobic.002G167000、Sobic.007G106500）在石紅137中上調(diào)表達(dá)，一個PPC同源基因（Sobic.010G160700）在石紅137中下調(diào)表達(dá)，表明高鹽環(huán)境對高粱葉片的碳固定產(chǎn)生了影響。PRK是碳代謝的關(guān)鍵酶，將5-磷酸核酮糖催化合成1,5-二磷酸核酮糖（RuBP），PRK在2個品種中的下調(diào)表達(dá)表明，RuBP的再生受到抑制，從而影響光合作用的正常進(jìn)行。

3.4 類黃酮生物合成途徑

類黃酮是一類植物次生代謝產(chǎn)物，常見的類黃酮包括查爾酮、黃酮醇、黃酮、黃烷醇、黃烷酮、花青素等。比較不同品種對照樣本未發(fā)現(xiàn)差異顯著代謝途徑，但對2個時期的鹽脅迫處理樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)共同的差異代謝途徑，即類黃酮生物合成途徑。對參與到此代謝途徑的基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)石紅137中花青素還原酶（ANR）和黃酮醇合成酶（FLS）的表達(dá)量均高于L甜。結(jié)果表明，石紅137在次級代謝產(chǎn)物類黃酮合成過程要強于L甜。研究表明耐鹽植物的耐鹽性主要體現(xiàn)在植株體內(nèi)的離子平衡，Na+和Cl-被貯藏在液泡內(nèi)，保持細(xì)胞滲透勢的穩(wěn)定。部分有機溶質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)也起到穩(wěn)定細(xì)胞滲透勢的作用[10]。則次級代謝產(chǎn)物的合成能力可能是石紅137和L甜是否耐鹽的重要原因。

4 結(jié)論

高粱的鹽脅迫過程是一個復(fù)雜的生物過程，依賴于多個基因在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的平衡表達(dá)。鹽脅迫條件下，高粱應(yīng)對環(huán)境刺激受到激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用的控制。類黃酮生物合成途徑在耐鹽品種中起到了重要作用。

[1] KAUSHAL S S. Increased salinization decreases safe drinking water ., 2016, 50(6): 2765-2766.

[2] KHALID N, AQSA T, IQRA, KHALID H, ABDUL M. Induction of salt tolerance in two cultivars of sorghum (L.) by exogenous application of proline at seedling stage., 2010, 10(1): 93-99.

[3] GUZM N-MURILLO M A, ASCENCIO F, LARRINAGA- MAYORAL J A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts., 2013, 250(1): 33-42.

[4] MUNNS R. Comparative physiology of salt and water stress., 2002, 25(2): 239-250.

[5] 高玉紅, 閆生輝, 鄧?yán)枥? 不同鹽脅迫對甜瓜幼苗根系和地上部生長發(fā)育的影響. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 47(3): 120-123.

GAO Y H, YAN S H, DENG L L. Effects of different salt stress on root and above-ground growth and development of muskmelon seedlings., 2019, 47(3): 120-123. (in Chinese)

[6] GULZAR S, KHAN M A, UNGAR I A. Salt tolerance of a coastal salt marsh grass., 2003, 34(17/18): 2595-2605.

[7] KERKEB L, DONAIRE J P, VENEMA K, RODR GUEZ-ROSALES M P. Tolerance to NaCl induces changes in plasma membrane lipid composition, fluidity and H+-ATPase activity of tomato calli., 2001, 113(2): 217-224.

[8] PARIDA A K, DAS A B, MITTRA B, MOHANTY P. Salt-stress induced alterations in protein profile and protease activity in the mangrove bruguiera parviflora., 2004, 59(5/6): 408-414.

[9] HARE P D, CRESS W A. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants., 1997, 21(2): 79-102.

[10] SERRAJ R, SINCLAIR R T. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions., 2002, 25(3): 33-41.

[11] GANIE S A, MOLLA K A, HENRY R J, BHAT K V, MONDAL T K. Advances in understanding salt tolerance in rice., 2019, 132(4): 851-870.

[12] WANG M, WANG Y, ZHANG Y, LI C, GONG S, YAN S, LI G, HU G, REN H, YANG J, YU T, YANG K. Comparative transcriptome analysis of salt-sensitive and salt-tolerant maize reveals potential mechanisms to enhance salt resistance., 2019, 41(7): 781-801.

[13] AMIRBAKHTIAR N, ISMAILI A, GHAFFARI M R, NAZARIAN FIROUZABADI F, SHOBBAR Z S. Transcriptome response of roots to salt stress in a salinity-tolerant bread wheat cultivar., 2019, 14(3): e0213305.

[14] YANG Z, ZHENG H, WEI X, SONG J, WANG B, SUI N. Transcriptome analysis of sweet sorghum inbred lines differing in salt tolerance provides novel insights into salt exclusion by roots., 2018, 430(1): 423-439.

[15] AKBUDAK M A, FILIZ E, KONTBAY K. DREB2 (dehydration- responsive element-binding protein 2) type transcription factor in sorghum (): genome-wide identification, characterization and expression profiles under cadmium and salt stresses., 2018, 8(10): 426.

[16] FORGHANI A H, ALMODARES A, EHSANPOUR A A. Potential objectives for gibberellic acid and paclobutrazol under salt stress in sweet sorghum ([L.] Moench cv. Sofra)., 2018, 61(1): 113-124.

[17] 王海蓮, 張華文, 劉賓, 楊延兵, 秦嶺, 陳二影, 管延安. 低度鹽脅迫下高粱苗期相關(guān)性狀的QTL定位. 分子植物育種, 2017, 15(2): 604-610.

WANG H L, ZHANG H W, LIU B, YANG Y B, QIN L, CHEN E Y, GUAN Y A. QTL mapping for traits related to salt tolerance at seedling stage of Sorghum under low salt stress., 2017, 15(2): 604-610. (in Chinese)

[18] WANG H L. CHEN G L, ZHANG H W, LIU B, YANG Y B, GUAN Y A. Identification of QTLs for salt tolerance at germination and seedling stage ofL. Moench.,2014, 196: 117-127.

[19] 汪仁, 李曉丹, 江玉梅, 賀佳, 彭峰, 夏冰. 石蒜捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的克隆和序列分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(2): 42-44.

WANG R, LI X D, JIANG Y M, HE J, PENG F, XIA B. Cloning and sequence analysis of light-harvesting chlorophyll a/b binding protein gene from., 2011, 39(2): 42-44. (in Chinese)

[20] DUAN L, DIETRICH D, NG C H, CHAN P M, BHALERAO R, BENNETT M J, DINNENY J R. Endodermal ABA signaling promotes lateral root quiescence during salt stress inseedlings., 2013, 25(1): 324-341.

[21] ACHARD P, CHENG H, DE GRAUWE L, DECAT J, SCHOUTTETEN H, MORITZ T, VANDER S D, PENG J, HARBERD N P. Integration of plant responses to environmentally activated phytohormonal signals., 2006, 311(5757): 91-94.

[22] ZHU J K. Salt and drought stress signal transduction in plants., 2002, 53(1): 247-273.

[23] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K, SHINOZAKI K. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses., 2006, 57(1): 781-803.

[24] CUTLER S R, RODRIGUEZ P L, FINKELSTEIN R R, ABRAMS S R. Abscisic acid: emergence of a core signaling network., 2010, 61(1): 651-679.

[25] FUJITA Y, NAKASHIMA K, YOSHIDA T, KATAGIRI T, KIDOKORO S, KANAMORI N, UMEZAWA T, FUJITA M, MARUYAMA K, ISHIYAMA K, KOBAYASHI M, NAKASONE S, YAMADA K, ITO T, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Three SnRK2 protein kinases are the main positive regulators of abscisic acid signaling in response to water stress in., 2009, 50(12): 2123-2132.

[26] YUAN H, ZHAO K, LEI H, SHEN X, LIU Y, LIAO X, LI T. Genome-wide analysis of the GH3 family in apple (a)., 2013, 14(1): 297.

[27] CHEONG Y H, CHANG H-S, GUPTA R, WANG X, ZHU T, LUAN S. Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses in., 2002, 129(2): 661-677.

[28] SONG Y, WANG L, XIONG L. Comprehensive expression profiling analysis of OsIAA gene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments., 2009, 229(3): 577-591.

[29] LIU X, ZHANG H, ZHAO Y, FENG Z, LI Q, YANG H Q, LUAN S, LI J, HE Z H. Auxin controls seed dormancy through stimulation of abscisic acid signaling by inducing ARF-mediated ABI3 activation in Arabidopsis ., 2013, 110(38): 15485-15490.

[30] 李安節(jié), 柳振峰. 植物光系統(tǒng)Ⅱ捕光過程的超分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ). 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2018, 45(9): 935-946.

LI A J, LIU Z F. Supramolecular structural basis of light harvesting in plant photosystem II., 2018, 45(9): 935-946. (in Chinese)

[31] O'LEARY B, PARK J, PLAXTON WILLIAMC. The remarkable diversity of plant PEPC (phosphoenolpyruvate carboxylase): recent insights into the physiological functions and post-translational controls of non-photosynthetic PEPCs., 2011, 436(1): 15-34.

Transcriptome Analysis and Gene Mining of Salt Tolerance in Sorghum Seedlings (L. Moench)

DONG Ming1, KUERBAN Zaituniguli2, Lü Peng1, DU RuiHeng1, Ye Kai2, HOU ShengLin1, LIU GuoQing1

(1Institute of Millet Crops, Hebei Academy of Agriculture & Forestry Sciences/The Key Minor Cereal Crops Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050035;2Institute of Bioenergy, Xinjiang Academy of Agriculture Sciences, Urumqi 830091)

【Object】The primary aim of this study was to identify salt tolerance genes and explore the tolerance response mechanism under salt stress in sorghum, which may provide a theoretical basis for sorghum salt tolerance breeding. 【Method】Two sorghum varieties, L-Tian, salt-sensitive and Shihong 137, salt-tolerant were employed as plant materials. The sorghum seedlings were treated with 2% NaCl solution at three-leaf and one heart stage. Three treatments including 0 h (CK), 1 h and 24 h were conducted. The plant height, root length, dry matter weight, Na+content and relative content of chlorophyll (SPAD value) were determined, and the transcriptome sequencing was performed on Illumina HiSeq 2000 platform. The FPKM method was employed to calculate the gene expression level. Both the differential expression fold (Fold Change) ≥ 2 and FDR＜0.001 were used as screening criteria to detect the differentially expressed genes. The Gene Ontology and KEGG Pathway databases were used to analyze the differentially expressed genes involved in salt stress at different time points. 【Result】Salt stress had no significant effect on plant height, root length and dry matter weight of sorghum, but had significant effect on Na+content and SPAD value. The plant height, root length, Na+content and SPAD value of Shihong 137 were higher than those of L-tian. Totally 26628 known genes and 866 new genes have been identified from RNA-seq, of which, the number of differentially expressed genes from Shihong 137 is higher than that from L-tian. 375, 4206 and 3750 differentially expressed genes in 0 h vs 1 h, 0 h vs 24 h and 1 h vs 24 h groups had been identified from Shihong 137 respectively. The number of differentially expressed genes of 0 h vs 1 h, 0 h vs 24 h, and 1 h vs 24 h of L-tian was 167, 2534 and 1612, respectively. GO and KEGG analysis revealed that plant hormones such as abscisic acid, auxin, cytokinin, gibberellin and ethylene were involved in the salt tolerance of sorghum at an early stage of salt stress (1h), while Lhca, Lhcb, phosphoenolpyruvate carboxylase, and ribulose phosphate kinase were involved in the salt tolerance at a late stage of salt stress (24 h). The difference in salt tolerance between Shihong 137 and L-tian was mainly caused by the flavonoid biosynthetic metabolic pathway. 【Conclusion】The sorghum response to salt stress is a complex biological process that relies on the balanced expression of multiple genes in complex networks. Under salt stress, sorghum response to environmental stimuli was controlled by both hormonal signal transduction and photosynthesis. The flavonoid biosynthesis pathway played an important role in salt-tolerant varieties.

sorghum (L.); salt stress; transcriptome; gene mining

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.005

2019-06-17；

2019-09-24

國家自然科學(xué)基金（31660435）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-13.5-A10）

董明，E-mail：dddongming@126.com。再吐尼古麗·庫爾班，E-mail：zaytungul@sohu.com。董明和再吐尼古麗·庫爾班為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者侯升林，E-mail：shenglinhou@aliyun.com；劉國慶，E-mail：guoqingliu@hotmail.com

（責(zé)任編輯 李莉）